Разработка прототипа вакцины против сибирской язвы на основе сферических частиц вируса табачной мозаикиНИР

Development of vaccine prototype against anthrax based on tobacco mosaic virus spherical particles

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 24 апреля 2018 г.-31 декабря 2018 г. Разработка прототипа вакцины против сибирской язвы на основе сферических частиц вируса табачной мозаики
Результаты этапа: Получена генетическая конструкция, позволяющая экспрессировать основной белковый компонент токсина сибирской язвы – главный протективный антиген (PA). Получены генетические конструкции, позволяющие экспрессировать два мутантных белковых компонента токсина сибирской язвы – фактор летальности (LF) и фактор эдемы (EF). Генетические конструкции экспрессированы в клетках E. coli, рекомбинантные белки выделены, очищены и охарактеризованы. Получены антисыворотки к каждому из очищенных рекомбинантных белков. Накоплен в растениях, выделен и очищен препарат ВТМ, из которого получены и полностью охарактеризованы с помощью ряда физико-химических методов СЧ.
2 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Разработка прототипа вакцины против сибирской язвы на основе сферических частиц вируса табачной мозаики
Результаты этапа: 1. Полученные и охарактеризованные в ходе выполнения проекта в 2018 году рекомбинантные белки РА, LFE687A и EFH351A – антигены B. anthracis были адсорбированы на поверхности СЧ-ВТМ. Для получения комплексов были использованы СЧ разного размера (300±27 нм – СЧ300 и 500±35 нм – СЧ500). Так как немутированные белки токсина заведомо токсичны при совместном введении, то в эксперименте по созданию комплексов с СЧ нами были использованы только инактивированные варианты LF и EF На первом этапе на СЧ разного размера были отдельно адсорбированы антигены токсина сибирской язвы и получены комплексы СЧ-РА, СЧ-LFE687A и СЧ-EFH351A. Для каждого комплекса было подобрано соотношение СЧ-антиген, таким образом, чтобы в инкубационной смеси не оставался свободный от СЧ рекомбинантный белок.. С помощью метода флуоресцентной спектроскопии определено предельное количество целевого антигена, способное адсорбироваться на поверхности СЧ. Было показано, что на поверхности СЧ выбранных размеров способно адсорбироваться ~ 10 мкг антигена. Оптимальное массовое соотношение СЧ–антиген составило 10:1. Таким образом, были получены комплексы СЧ-РА, СЧ-LFE687A и СЧ-EFH351A при инкубации СЧ с белком в массовом соотношении 10:1, на 100 мкг СЧ – 10 мкг антигена. Все комплексы были получены с сферическими частицами диаметром 300 нм и 500 нм. Впервые была предпринята попытка адсорбировать на поверхности СЧ сразу три различных белка. Более того, впервые целевые белки имели бактериальное происхождение. Комплексы СЧ-РА/ LFE687A/ EFH351A получали in vitro при инкубации СЧ диаметром 300 нм или 500 нм. и одновременно трех белков - РА, LFE687A, EFH351A. в массовом соотношении 100:3:3:3. Таким образом, было получено два типа комплексов: (1) СЧ, на поверхности которых сорбирован только один из трех рекомбинантных белков токсина, после чего такие комплексы могут быть объединены между собой в различных комбинациях и соотношениях в один препарат; (2) комплексы, полученные путем адсорбции на поверхности СЧ смеси из трех компонентов токсина. Всего было получено четыре препарата: 1) СЧ300 с отдельной посадкой трех антигенов (смесь), 2) СЧ300 с одновременной посадкой трех антигенов, 3) СЧ500 с отдельной посадкой трех антигенов (смесь), 4) СЧ500 с одновременной посадкой трех антигенов. 2. Полученные комплексы СЧ – антигены B. anthracis были охарактеризованы широким спектром физико-химических методов (электронная микроскопия, метод анализа траекторий наночастиц, электрофорез и спектрофотометрия), в том числе стабильность и агрегационное состояние. При анализе комплексов методом электрофореза в геле было показано, что в препарате присутствуют белки PA, LFE687A, EFH351A с молекулярной массой 83 кd, 93 кd и 89 кd соответственно и белок СЧ, соответствующий по молекулярной массе белку оболочки ВТМ. Анализ методом спектрофотометрии показал, что в составе комплексов присутствуют только белковые молекулы. С помощью метода просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и метода анализа траекторий наночастиц был проведен сравнительный анализ СЧ свободных от рекомбинантных белков и композиций СЧ-антигены. Показано, что СЧ после образования комплекса с рекомбинантными белками не меняют свою морфологию и средний размер и не образуют агрегатов. Для изучения стабильности композиций, состоящих из СЧ и антигенов B. anthracis были использованы метод ПЭМ и метод динамического рассеяния света (фотонная корреляционная спектроскопия). Важно было показать стабильность композиций СЧ-антиген(ы) в физиологических условиях. Для этого комплексы СЧ-антигены переводили из водного раствора в PBS. Полученные препараты были проанализированы с помощью методов ПЭМ и динамического рассеяния света, которые показали, что композиции СЧ-антигены B. anthracis сохраняют свой средний диаметр, как при переводе в PBS, так и при хранении в PBS. Важно отметить, что при изменении солевых условий не происходило их агрегации, что свидетельствует о высокой стабильности полученных препаратов в физиологических условиях. 3. Методом иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ) была исследована антигенная специфичность каждого из используемых рекомбинантных антигенов B. anthracis в составе комплексов с СЧ в физиологических условиях. Антигенную специфичность рекомбинантных белков исследовали в четырех вакцинных препаратах, содержащих смесь комплексов СЧ-РА, СЧ-LFE687A, СЧ-EFH351A и комплекс СЧ-РА/ LFE687A/ EFH351A и СЧ разного размера (СЧ300 и СЧ500). Специфическая активность каждого из используемых антигенов в комплексе с СЧ была подтверждена методом ИЭМ с помощью полученных в 2018 году мышиных антисывороток к рекомбинантным белкам (РА, LFE687A и EFH351A) и что гораздо важнее коммерческих поликлональных антител к РА, LF и EF (Goat anti-PA, Goat anti-LF, Goat anti-EF, ListLabs, США) и вторичных видоспецифических антител, конъюгированных с коллоидным золотом 12 нм. Было показано, что в физиологических условиях целевые белки остаются на поверхности сферических частиц и сохраняют свою антигенную специфичность, как в случае использования СЧ с диаметром 300 нм, так и в случае использования СЧ с диаметром 500 нм. 4. Комплексы СЧ и каталитически инактивированных мутантов токсина B. anthracis LF и EF были исследованы на наличие токсического действия на клеточных культурах в присутствии PA. Были использованы две линии клеток B. anthracis – клетки мышиных макрофагов (J774A.1) для исследования цитотоксичности LFE687A и клетки яичников китайского хомячка (CHO-K) для оценки ферментативной активности EFH351A. Клетки линии мышиных макрофагов 1774 А.1 чувствительны к действию летального токсина, что делает возможным проведение экспериментов по цитотоксичности. МТТ-тест проводили по методике, описанной ранее (Lu, et al, 2013). Результаты МТТ-анализа показали значительное дозо-зависимое снижение жизнеспособности клеток (цитотоксичность от 10 до 100%) только в присутствии LT (LF+PA). В случае В случае PA +LFE687 и СЧ-PA+СЧ-LFE687 регистрировали незначительные отклонения от нормы – цитотоксичность до 20%. Все остальные тестируемые препараты (PA, СЧ-PA, LFwt, LFE687A или СЧ-LFE687A) не обладали токсическим действием в культуре клеток мышиных макрофагов J774A.1. Полученные результаты отличаются от ранее опубликованных данных о полном отсутствии цитотоксичности мутанта LFE687 на культуре мышиных макрофагов (Gupta 2007), что может быть связано, в частности, с использованием другого растворителя для формазана и чувствительностью метода. Учитывая результаты по токсичности, полученной на культурах клеток было принято решение исследовать токсичность полученных вакцинных препаратов на мышах. В связи с этим дополнительно к МТТ-тесту были проведены эксперименты по изучению токсикологических свойств (летальности) полученных препаратов СЧ-PA и СЧ-LFE687 на лабораторных животных. Мышам линии BALB/c в возрасте 6 – 8 недель (в каждой группе по 6 животных) вводили одну или две дозы с интервалом в 1 неделю СЧ-PA совместно с СЧ-LFE687. Контрольным группам мышей вводили СЧ-PA или физиологический раствор. После введения второй дозы в опытной группе (СЧ-PA+ СЧ-LFE687) был зарегистрирован падеж мышей. В конрольных группах животных отклонений от нормы (внешний вид, вес, двигательная активность) не наблюдали. Для оценки ферментативной активности EFH351A использовали клеточную линию яичников китайского хомячка (CHO-K1, Termo Fisher Scientific). Уровни внутриклеточного цАМФ определяли количественно в клеточных лизатах. Дозо-зависимое увеличение цАМФ наблюдали только в клетках, обработанных ЕТ (EF+РА). Уровень цАМФ в клетках, инкубированных с мутантной формой ЕF в присутствии РА, практически не отличался от отрицательных контролей. Однако, в недавно опубликованном исследовании по токсичности каталитически инактивированных мутантов EF, включая EFH351A, было показано, что они сохраняли способность вызывать системную токсичность, хотя эффекты были значительно слабее, чем у животных, инъецированных нативным EF (Zhao et al., 2016). Полученные нами результаты по токсичности препарата СЧ-LFE687 при совместном введении с СЧ-PA лабораторным животным, а также новые литературные данные о токсичности мутанта EFH351A при совместном введении с РА на модели животных (Zhao et al., 2016).заставили нас отказаться от дальнейшего использования мутантных форм LFE687 и EFH351A в составе кандидатной вакцины против сибирской язвы. Протективный антиген является центральным компонентом токсинов и играет ключевую роль в защите против инкапсулированных и некапсулированных штаммов B. аnthracis. Во многих исследованиях показано, что протективная эффективность коррелирует с нейтрализующими антителами, индуцируемыми РА. Большинство эпитопов, антитела к которым обладают токсин-нейтрализующей активностью картированы на РА Исходя из ряда достоверных данных, опубликованных в последнее время, можно утверждать, что рекомбинантный РА (rPA), адсорбированный на гидроксиде алюминия нестабилен и теряет способность индуцировать нейтрализующие антитела при хранении. Однако, адъюванты на основе гидроксида алюминия используется практически во всех кандидатных вакцинах, которые находятся в клинических испытаниях. Мы считаем, что подбор подходящего адъюванта является одной из наиболее важных стратегий для разработки новой эффективной вакцины против сибирской язвы. Предложен новый подход – использование структурно модифицированных вирусов растений (СЧ) в качестве стабилизирующей rРА платформы и эффективного адъюванта, – который может стать определяющим в успехе разработки современной вакцины только на основе протективного антигена. 5. Для проведения сравнительного исследования иммуногенной активности кандидатных вакцинных препаратов на основании полученных данных были отобраны 2 препарата - СЧ300-РА (РА, адсорбированный на СЧ диаметром 300 нм) и СЧ500-РА (РА, адсорбированный на СЧ диаметром 500 нм).. Наибольшие титры антител регистрировались на седьмой день после третьей иммунизации для вакцинного препарата СЧ300-РА – 1/650000 при дозе антигена 10 мкг и СЧ500-РА – 1/600000. Показано, что иммунизация животных СЧ-РА приводила к значительному увеличению титров антител к РА по сравнению с иммунизацией только РА (10 мкг). Таким образом, в ходе выполнения проекта было отобрано два варианта кандидатного вакцинного препарата СЧ300-РА и СЧ500-РА, подобраны оптимальный состав кандидатной вакцины, доза антигена (10 мкг) и оптимальное соотношение антиген – СЧ. 6. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта в 2019 году еще раз продемонстрировали уникальные адсорбционные свойства СЧ. Была впервые показана возможность одновременной презентации на их поверхности трех белков бактериальной природы. В 2019 г. в ходе выполнения проекта было проведено сравнительное исследование поверхностного аминокислотного состава СЧ и вирионов ВТМ, чтобы приблизиться к пониманию уникальных адсорбционных свойств СЧ и сделать важный шаг для понимания их структуры. Использование метода тритиевой планиграфии и дополнительных физико-химических методов позволило нам провести детальный структурный анализ поверхности СЧ. Суммируя полученные данные, можно утверждать, что состав аминокислотных остатков на поверхности СЧ существенно отличается от вирионов ВТМ, что объясняет уникальные адсорбционные свойства СЧ, которые позволяют презентировать и стабилизировать РА на их поверхности.
3 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Разработка прототипа вакцины против сибирской язвы на основе сферических частиц вируса табачной мозаики
Результаты этапа: Для создания вакцины против сибирской язвы на основе вирусов растений в ходе выполнения проекта были отобраны два кандидатных вакцинных препарата - СЧ300-РА (РА, адсорбированный на СЧ диаметром 300 нм) и СЧ500-РА (РА, адсорбированный на СЧ диаметром 500 нм). Протективный антиген (РА) – основной антиген токсина сибирской язвы - играет ключевую роль в защите против токсигенных и капсулированных штаммов B. аnthracis. Одной из главных проблем при создании субъединичных вакцин на основе рекомбинантного РА (rPA) является нестабильность этого белка. Исходя из ряда данных, опубликованных в последнее время, можно утверждать, что rPA, адсорбированный на гидроксиде алюминия нестабилен, деградирует и теряет способность индуцировать нейтрализующие антитела при хранении. Однако адъюванты на основе гидроксида алюминия используются практически во всех кандидатных вакцинах на основе rPA, которые находятся в настоящее время в клинических испытаниях. По нашему мнению, подбор подходящего адъюванта и стабилизация молекулы полноразмерного РА является одной из наиболее важных стратегий для разработки новой эффективной вакцины против сибирской язвы. На лабораторных животных проведен анализ кинетики уровня специфических антител к протективному антигену антратоксина. Показано, что иммунизация животных СЧ300-РА и СЧ500-РА приводила к значительному увеличению титров антител к rРА по сравнению с иммунизацией только rРА. СЧ с диаметром 300 нм и 500 нм с одинаковой эффективностью стимулируют иммунный ответ у лабораторных животных на целевой антиген. Продемонстрировано, что большая часть антител вырабатывается на протективный антиген, а не на СЧ, используемые в качестве адъюванта. Для оценки вклада клеточного и гуморального иммунного ответа на протективный антиген в составе вакцинного препарата проведено изотипирование двух антисывороток, полученных при иммунизации мышей двумя прототипами вакцины. Показано, что комплексы СЧ500-РА и СЧ300-РА способствуют стимуляции Th2–иммунного ответа, поскольку наблюдается наибольшая выработка антител подкласса IgG1, что крайне важно для получения эффективного протективного эффекта. Проведено сравнение иммуностимулирующих свойств СЧ в составе прототипа вакцины по сравнению с широко распространенными в фармакологии адъювантами. Продемонстрировано, что СЧ обоих размеров (СЧ300 и СЧ500) вызывают более высокие титры антител по сравнению с гидроксидом алюминия и обладают сравнимыми адъювантными свойствами с неполным адъювантом Фрейнда. Проведены предварительные эксперименты по изучению токсических свойств препаратов кандидатной вакцины при однократном внутримышечном введении различных доз мышам линии BALB/c. За время проведения эксперимента не было выявлено гибели подопытных животных и отклонений в наблюдаемых внешних признаках, а также в регистрируемых физиологических параметрах (вес, температура). В результате проведенного исследования токсичности на мышах BALB/c при однократном введении препаратов кандидатной вакцины установлено, что исследуемые препараты нетоксичны. Проведено сравнительное изучение стабильности rPA, а также rPA в составе комплексов с СЧ при хранении при +25°С в течение 12 дней. Результаты, полученные на полноразмерном rPA с молекулярной массой 83 кДа (rPA83), продемонстрировали, что адсорбция rPA83 на поверхности СЧ приводит к частичной защите целевого антигена от протеолиза при хранении. Однако, устойчивость белка rPA83 (в комплексе с СЧ) к деградации была неполной. В связи с этим был предложен другой подход для стабилизации rРА. Для отработки этого подхода было принято решение провести направленный мутагенез части молекулы РА, а именно содержащей домены 3 и 4. Сайт-направленным мутагенезом был получен белок, состоящий из доменов 3 и 4 rPA (mrPA3+4) с заменами двух аспарагинов на глутамины. Дезамидирование аспарагинов является наибодее частой причиной деградации белков при хранении. Продемонстрирована эффективная сорбция белка mrPA3+4 на СЧ с сохранением антигенной специфичности и стабильность при хранении. Сочетание одновременно двух подходов – использование структурно модифицированных вирусов растений (СЧ) как стабилизирующей rРА платформы (а также эффективного адъюванта) и модифицированного rРА83 c аминокислотными заменами, стабилизирующими белок, – может стать основой для создания современной стабильной вакцины на основе протективного антигена. В результате проведенных работ был создан и охарактеризован прототип вакцины против сибирской язвы. на основе рекомбинантного антигена B. anthracis и структурно модифицированных вирусов растений (СЧ) в качестве стабилизирующей rРА платформы и эффективного адъюванта. Получено два варианта препарата кандидатной вакцины - СЧ300-РА (rРА, адсорбированный на СЧ диаметром 300 нм) и СЧ500-РА (rРА, адсорбированный на СЧ диаметром 500 нм). Исследованы иммуногенность, безопасность и стабильность вакцинного препарата. Частицы двух размеров СЧ300 и СЧ500 с равной эффективностью могут выполнять роль стабилизируюшей платформы-адъюванта при разработке вакцины против сибирской язвы. В ходе выполнения проекта показано, что стабилизация полноразмерного rPA может быть осуществлена одновременно с использованием двух подходов: адсорбцией rPA на поверхности СЧ и направленным мутагенезом сайтов, являющихся причиной дестабилизации белка. Получены также комплексы СЧ с доменами 3 и 4 РА, которые содержат 7 токсин-нейтрализующих эпитопов и которые могут также рассматриваться как самостоятельные антигены при создании рекомбинантной вакцины против сибирской язвы. Полученные результаты могут лечь в основу разработки современной эффективной рекомбинантной вакцины с модифицированным rРА83, стабилизированным за счет аминокислотных замен в комплексе с СЧ. Дальнейшие исследования необходимы для создания эффективного прототипа современного вакцинного препарата и его полной характеристики, включая изучение протективных свойств на моделях животных.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".