ИСТИНА

1) Сравнительный анализ данных по общей морфологии, ультраструктуре и составу глоточного вооружения основных групп Platyzoa с Trochozoa. Результат: выявление разнообразия морфологии, формирования и состава глоточного вооружения челюстных Spiralia. 2) Исследование общей морфологии и тонкого строения нескольких видов моллюсков и аннелид, имеющих разную морфологию и тип питания с целью определить основные направления эволюции глоточного вооружения внутри группы. Результат: гомологии глоточного вооружения аннелид и моллюсков. Предположение предкового состояния глоточного вооружения трохофорных. 3) Анализ полученных данных и литературы. Результат: определение границ морфологической изменчивости глоточного вооружения Spiralia, основных путей эволюции внутри группы, предкового состояние пищедобывательного аппарата.

В результате проекта был осуществлен анализ современной литературы, а также были проведены морфологические исследования пищедобывательного аппарата ключевых групп трохофорных животных. На основании анализа литературных данных и результатов морфологических исследований были сделаны обобщения о формировании и возобновлении челюстных образований у спиралий и предложено первичное состояние пищедобывательного аппарата для предка спиралий. Морфологические исследования. Для получения полной картины морфологического разнообразия глоточного вооружения трохофорных животных были проведены морфологические исследования пищедобывательного аппарата одного вида аннелид и четырех видов моллюсков. Первая часть отчета представляет собой описание полученных результатов по морфологии и ультратонкому строению челюстного аппарата Mooreonuphis stigmatis (Annelida, Onuphidae); двух видов голожаберных моллюсков из клады Doridoidea (Flabelliba verrucosa и Eubranchus rupium), одиного вида голожаберных моллюсков из клады Cladobranchia (Vayssierea elegans)(Mollusca, Gastropoda); одного вида ценогастропод рода Conus (Mollusca, Gastropoda). 1) Было проведено полное исследование общей и тонкой морфологии челюстного аппарата одного из видов сем.Onuphidae (Annelida) Mooreonuphis stigmatis. В результате изучения тотальных препаратов были выявлены ключевые моменты закладки и развития челюстей: 1) было обнаружено три типа максилл: larval, juvenile и adult. Закладка личиночных челюстей происходит на стадии 5 сегментов, на стадии 12-13 сегментов происходит смена личиночных на ювенильные, хорошо развитые ювенильные представлены уже на стадии 17-18, смена с ювенильных на взрослые нами прослежена не была. Вероятно, вторая смена происходит на стадии более 90 сегментов; 2) мандибулы, согласно нашим данным, имеют одинаковое строение, за исключением того, что меняется морфология (пропорция рукоятки и апикальной части); 3) в результате изучения тонкого строения максиллярного аппарата с помощью трансмиссионного электронного микроскопа на разных стадиях развития были выявлены следующие особенности: максиллы личинок начинают формироваться за счет уплотнения базикутикулы. Первый этап – это создание каркаса из хаотичных коллагеновых волокон. Далее происходит уплотнение базикутикулы за счет выделения электронно-плотных гранул очень короткими, быстро исчезающими микровиллями. Подобный процесс описан для Dorvilleidae и можно считать типичным для формирования небольших, часто сменяющихся челюстных пластинок Dorvilleidae, не имеющих вторичного роста (это статья Purshcke 1987); 4) максиллы ювенильной генерации челюстей M.stigmatis закладываются параллельно ларвальным, соседней складкой гнатоэпителия. При этом в отличие от гнатоэпителиальных клеток ларвальных максилл, микровилли здесь длинные и пронизывают всю толщу кутикулы. Они формируют массивную многослойную ортогональную решетку, за счет которой происходит утолщение челюстной пластинки. Уплотнение и склеротизация ювенильной максиллы происходит за счет уплотнения эпикутикулярного слоя (формирования сливающихся электронно-плотных гранул, точно также, как у максил первой «ларвальной» генерации), кроме того, за счет уплотнения слоя базикутикулы. Челюсти такого типа, состоящие из двух слоев – плотного электронно плотного внешнего слоя и внутреннего базикутикулярного, состоящего из склеротизованных ортогонально ориентированных слоев коллагенновых волокон, пронизанных микровиллями, очень похожи по структуре на челюсти ряда других аннелид, имеющие возможность продолжительного роста. Такие структуры описаны как для челюстей, располагающихся в вентральном фарингеальном органе (Adercodon pleijeli, Tzetlin 2004) так и у ряда аннелид, несущих челюсти в дистальной части аксиальной мускулистой глотки (см. Purschke 1978, Tzetlin & Purschke 2005). Третья (adult) генерация челюстей также, как и вторая, имеет возможность длительного роста. Ее строение сложнее: внутри крупных маскилл имеется обширная полость, заполненная не только клетками гнатоэпителия, но и кровеносными сосудами и мышцами. На ультраструктурном уровне строение взрослых максилл также более сложное. В базикутикуле, помимо внешнего электронно-плотного слоя, сформированного ортогонально ориентированными слоями коллагеновых волокон, имеется массивный третий (вставочный) слой, состоящий из большого количества везикул. При этом микровилли гнатоэптелия длинные и пронизывают бузикутикулу до середины максиллярной пластинки. Жесткость максилл взрослых особей, вероятно, достигается кальцинацией эпикутикулы. Предположительно из-за декальцинации эпикутикула электронно-прозрачная. Ультраструктура, взрослой челюсти M.stigmatis сходна с таковой у представителей другого семейства клады Eunicida – Eunice torquata Wolf, 1980. Это сходство заключается в наличии под ортогональным слоем, дополнительного слоя в базикутикулярной зоне челюсти. По всей видимости именно этот слой важен для формирования таких экстремально крупных (для аннелид), челюстных образований, как, например, максиллы1 эуницид и онуфид. 2) Для сравнения пищедобывательного аппарата было исследовано три вида голожаберных моллюсков. Nudibranchia делится на две крупные клады Doridoidea и Cladobtanchia. Было исследовано два близкородственных вида из Doridoidea (Flabelliba verrucosa и Eubranchus rupium) с разным типом питания и один представитель Cladobranchia (Vayssierea elegans) имеющий схожий тип питания с Eubranchus rupium. Радулярный аппарат всех представителей включает радулу, одонтофор и радулярное влагалище, в котором происходит синтез зубов радулы и радулярной мембраны. Радула F. verrucosa данного вида трисериальная, в каждом поперечном ряду есть центральный зуб и два латеральных. Радулярная формула для F. verrucosa: 15-21×1.1.1. Одонтофор представляет собой опорную структуру, включающую радулярный ретрактор, протрактор одонтофора и радулярный валик, состоящий из видоизмененных, сильно вакуолизированных мышечных клеток. Зубы радулы и радулярная мембрана синтезируются в терминальном конце радулярного влагалища. За синтез зубов радулы и радулярной мембраны отвечают специализированные клетки – одонтобласты и мембранобласты соответственно. Согласно данным TEM они представляют собой крупные, объемистые клетки с большим количеством рибосом и митохондрий, хорошо развитым шероховатым ЭПР. Апикальная поверхность одонтобластов и мембранобластов несет длинные толстые микровилли, пронизывающие материал зуба радулы и радулярную мембрану. В апикальной части одонтобластов и мембранобластов были обнаружены везикулы с гранулярным хитином – хитосомы; обе группы клеток подостланы базальной мембраной. На ультраструктурном уровне в незрелом зубе радулы можно выделить 4 зоны, различающиеся направлением и плотностью расположения хитиновых волокон. Согласно данным конфокальной микроскопии с внешней поверхности зубов третьего поперечного ряда радулы начинается процесс полимеризации хитина. Синтез радулы F. verrucosa проходит в 4 этапа: 1) одонтобластами синтезируется коллагеновый колпачок зуба; 2) зуб поворачивавется на 90º и прикрепляется к радулярной мембране, синтезируемой непрерывно; 3) под коллагеновым колпачком зуба начинает накапливаться неполимеризованный хитин из хитосом одонтобластов; 4) по мере продвижения зуба от терминального конца радулярного влагалища у его устью, хитин в матриксе зуба полимеризуется, и зуб минерализуется. В процессе минерализации зуба принимает участие супрарадулярный эпителий радулярного влагалища, в транспортировке радулы к рабочему краю принимает участие субрадулярный эпителий радулярного влагалища. F. verrucosa является удобным объектом для наблюдения за питанием. F. verrucosa питается путем всасывания с последующим откусыванием части еды. Полученные данные по пищевому поведению подтверждают предложенный по морфологическим данным механизм функционирования буккального комплекса. По результатам съемки можно описать основные стадии процесса питания моллюска: 1) распознавание добычи; 2) засасывание добычи (полипа) в буккальную полость; 3) измельчение полипа в буккальной полости; 4) завершение процесса питания (Рис. 2). Не смотря на то, что V. elegans и E. rupium питаются схожим образом (сверлящий тип питания), а именно просверливают небольшие отверстия в «домиках» пищевого объекта (V. elegans питается аннелидами с извитыми известковыми трубочками спирорбидами, E. rupium текатными гидроидными), строение буккального комплекса довольно сильно различается. Буккальный комплекс V. elegans включает внешнюю и внутреннюю буккальную мускулатуру, буккальную полость с дорсально отходящим пищеводом и радулярный аппарат. Челюсти отсутствуют. У данного вида также отсутствуют ротовые щупальца, однако клетки эпителия ротового отверстия и ротовой трубки несут длинные реснички, что предполагает наличие чувствительной функции у данных зон. Внешняя буккальная мускулатура V. elegans представлена дилататорами ротовой трубки, задним буккальным тенсором и буккальным ретрактором. Внутренняя буккальная мускулатура V. elegans представлена большим количеством мышц, состоящих из небольших мышечных пучков: констриктором буккальных губ, буккальным сфинктером, вентральным и латеральными протракторами одонтофора, ретрактором одонтофора и радулярным ретрактором. Согласно данным по ультраструктуре буккальная мускулатура представлена гладкими мышцами. Одонтофор V. elegans на сагиттальном срезе имеет пальцевидную форму; его длина у трехмиллиметровой особи составляет 400 мкм, а высота – 80-90 мкм. Он состоит из 4 групп буккальных мышц: вентрального и латеральных протракторов одонтофора, ретрактора одонтофора и радулярного ретрактора. Хрящи одонтофора или радулярный валик – дополнительные опорные структуры – отсутствуют. Радула V. elegans на всем протяжении подостлана радулярной мембраной, имеет V-образную форму на сагиттальном срезе, причем вентральная ветвь радулы приблизительно равной длины с дорсальной. В поперечном ряду насчитывается 6 зубов: два внутренних, сильно зазубренных латеральных зуба; два внешних гребенковидных латеральных зуба и два маргинальных зуба в виде пластинки. Центральный зуб отсутствует. Радулярная формула для V. elegans: 35-40×1.2.0.2.1. По данным трансмиссионной электронной микроскопии зрелые зубы имеют электронно-плотную, гомогенную структуру. По морфологическим данным был предложен механизм сверления V. elegans : Как только моллюск с помощью чувствительных, покрытых ресничками участков в области ротового отверстия находит подходящий для сверления участок трубки, сокращаются дилататоры ротовой трубки и расслабляются буккальный ретрактор и констриктор буккальных губ, таким образом открывая радулярному аппарату доступ к стенке трубки. При сокращении вентрального протрактора одонтофора и расслаблении радулярного ретрактора и ретрактора одонтофора одонтофор с радулой выдвигается вперед и контактирует со стенкой трубки. Сверлящее движение радулы и одонтофора обеспечивается попеременным сокращением латеральных протакторов одонтофора. После того, как отверстие просверлено, ретракторы радулы и одонтофора сокращаются, латеральные и вентральный протракторы одонтофора расслабляются. Высасывание полихеты из трубки и измельчение ее в буккальной полости обеспечивается координированной работой буккального сфинктера и заднего буккального тенсора. При этом констриктор буккальных губ находится в сокращенном состоянии, перекрывая сообщение буккальной полости и внешней среды для того, чтобы избежать выпадения пищи. В буккальный комплекс E. rupium входят челюсти, внешняя и внутренняя мощная буккальная мускулатура, буккальная полость с дорсально отходящим от ее середины пищеводом и радулярный аппарат, расположенный вентрально. Внешняя мускулатура буккального комплекса представлена двумя группами мышц, первая из которых соединяет переднюю часть буккального комплекса с дорсальной стенкой гемоцеля – буккальный ретрактор, а вторая начинается от терминального конца радулярного влагалища и оканчивается в нижней губе моллюска – ретрактор губ. Внутренняя буккальная мускулатура представлена мощными раскрывателями челюстей и протракторами и ретракторами одонтофора. Эпителий буккальной полости формирует две обширные латеральные складки, в которых располагаются челюсти и радулярное влагалище, где формируется радула. Челюсти, как и буккальный комплекс, вытянуты в передне-заднем направлении. Они представляют собой парные челюстные пластинки, лежащие в складках буккального эпителия и несущие в передней части длинные, изогнутые дугой жевательные отростки с зубчиками по краю. Радула E. rupium трисериальная, каждый поперечный ряд содержит один центральный зуб и два латеральных. Одонтофор представлен двумя группами буккальных мышц, хрящи одонтофора или радулярные валики отсутствуют. Радулярное влагалище выстлано супрарадулярным (верхним) и субрадулярным (нижним) эпителиями, в терминальном конце радулярного влагалища обнаружены одонтобласты и мембранобласты. Таким образом две различные ветви Nudibranchia – Doridoidea и Cladobranchia – хорошо отличимы друг от друга по составу и общему строению буккальной мускулатуры. У Doridoidea она представлена большим количеством мелких мышечных пучков, как у крупных представителей, так и у миниатюрных, таких как Vayssierea elegans; у Cladobranchia буккальная мускулатура обычно представлена небольшим количеством крупных мышечных пучков. Спецификация типа питания не ведет к значительным изменениям. Представители с одинаковым типом питания из разных групп сохраняют характерные черты строения буккального комплекса (такие, как количество мускулатуры буккального комплекса и внешней мускулатуры). 3) Для понимания границ морфологической изменчивости радулярного аппарата брюхоногих моллюсков и выяснение особенностей формирования пищедобывательного аппарата в зависимости от типа питания, было проведено исследования общей и тонкой морфологии радулярного аппарата Conus. Представители этого рода являются хищниками, в связи с чем радула претерпела существенные изменения. Радула не представляет собой ленту (радулярную мембрану) с прикрепленными к ней зубцами. Один зуб представляет собой конус с каналом внутри, по которому поступает яд в жертву. При нападении колуса на жертву, зуб, наполненный ядом, с силой выстреливает и полностью отделяется от конуса. Нами было впервые изучено ультратонкое строение радулярного аппарата Conus. Радула формируется в радулярном влагалище. Формирование происходит в виде незамкнутой пластинки широким концом вперед. Каждый зуб имеет в основании внеклеточный матрикс, вероятно, остаток радулярной мембраны. Не смотря на то, что зубы не прикреплены к радулярной мембране, они все равно формируют правильные ряды по два зуба. 2. Основные обобщения и выводы, сделанные по проекту На основании анализа литературных данных и результатов морфологических исследований были сделаны обобщения о формировании и возобновлении челюстных образований у спиралий. Картина морфологического разнообразия челюстного аппарата группы может быть описана следующим закономерностями: 1) все челюстные образования за редким исключением (стилеты немертин) являются производными специализированного эктодермального гнатоэпителия, который характеризуется синтетической активностью (хорошо развитый рибосомальный ЭПР, аппарат Гольджи), клеточной арматурой (тонофиламенты подстилают цитоплазматическую мембрану в базально-апикальной оси); 2) синтетическая активность коррелирует с продолжительностью роста челюстных образований: непродолжительный рост эктодермальной структуры может происходить за счет деятельности коротких мировиллей или апокринной секреции; продолжительный рост, как в длину, так и в толщину происходит за счет микровиллярной активности; микровилли могут пронизывать практически всю толщину челюстной пластинки; 3) существует предел морфогенетических возможностей эктодермального эпителия, обусловленный функцией структуры, необходимостью возобновления и длительностью использования. Эти ограничения определяют характер и пределы морфологического разнообразия челюстных структур у Trochozoa. Существует несколько гипотез об облике общего предка всех спиральных животных, самые распространенные – это 1) плануло-турбеллярные гипотезы. Согласно этой группе гипотез, предок, представляет собой просто устроенный планктонный организм с радиальной симметрией, лишенный целома, несквозным кишечником, который после оседания приобрел билатеральную симметрию. Вероятно, такой предок был детритофагом, собирающим с поверхности грунта с помощью ресничек мелкие органические частички или, существует другая вероятность, это организм был донным фильтратором с ресничными лопастями, которые способны улавливать органические частички из толщи воды. 2) архицеломатная и метамерные гипотезы. Предок сложно устроен с метамерным целомом, сегментарным телом и сквозным кишечником. Такой предок вероятнее всего был детритофагом с ресничными придатками. Какова бы ни была общая организация и степень морфологической сложности предка билатерий, вероятнее всего, первичным состоянием пищедобывательного аппарата является лопасть или лопасти, покрытые ресничками. Эти лопасти собирали с поверхности грунта частички детрита. При переходе к обитанию на твердых субстратах появляется необходимость в дополнительной арматуре для соскребывания обрастаний с твердых поверхностей. Поскольку эктодермальный эпителий – невероятно пластичная ткань, с большим разнообразием морфогенетических возможностей (о чем свидетельствует, например, разнообразие раковин у моллюсков), то вероятнее всего в разных группах независимо друг от друга возникали различного рода приспособления к соскребыванию: радула и челюсти у моллюсков, челюсти у гнатифер, челюсти у аннелид.