| 1 |
20 мая 2015 г.-15 декабря 2015 г. |
Разработка противовирусных препаратов нового поколения на основе ДНК-аптамеров к вирусу гриппа |
| Результаты этапа: 1. Одиннадцать наиболее перспективных аптамеров к гемагглютинину были соотнесены с тремя типами структур: G-квадруплексом, i-мотивом и шпилькой.
Для аптамера НА5, образующего i-мотив, была изучена рН-зависимость, определен рН полураспада i-мотива - 7,1, а также изучена термическая стабильность аптамера при разных рН.
Для G-квадруплексных аптамеров показано, что их спектр зависит от концентрации катионов натрия и калия, что указывает на наличие равновесия между несколькими конформациями. Аптамеры НА6 и НА7 были охарактеризованы по термической стабильности, оба аптамера имели температуру плавления 47-48°С.
Из семи аптамеров, образующих шпильки, были выбраны два: НА4, образующий межмолекулярную, димерную шпильку и аптамер НА9, образующий внутримолекулярную шпильку. Оба аптамера были охарактеризованы по термической стабильности, профиль плавления у аптамеров отличался, а точное соотнесение полученных данных требует дополнительных исследований на модельных объектах.
Сравнение данных, полученных методами спектроскопии кругового дихроизма и УФ-спектроскопии, показало, что метод КД-спектроскопии позволяет определить тип структуры аптамера и изучить его термическую стабильность, в то время как метод УФ-спектроскопии позволяет изучить только термическую стабильность некоторых типов структур. В дальнейшем использование КД-спектроскопии является предпочтительным для всех типов структур.
2. В ходе выполнения работ по моделированию структур аптамеров HA6 и HA7, был предложен подход по анализу последовательностей содержащих кандидатные участки на образование G-квадруплексов. Были предложены топологии аптамеров и отобраны те, которые удовлетворяют экспериментальным данным. Был разработан прототип программного обеспечения, позволяющего моделировать структуры ДНК со сложной топологией на основе известных структурах заготовках-модулей. Структурная устойчивость предложенных моделей была оценена моделированием молекулярной динамики. Были предложены модели-победители и оценена устойчивость квадруплексных модулей.
Методом ЯМР были охарактеризованы три аптамера: G-квадруплексный НА7, i-мотив НА5 и внутримолекулярная шпилька НА9. Спектр аптамеров НА7 и НА9 зависит от отжига и, вероятно, отражает смесь двух и более разных конформаций со сходной топологией. Аптамер НА9 обладает наименее стабильной структурой, в то время как аптамер НА5, напротив, образует топологически устойчивую структуру. Все аптамеры имеют высокое конформационное разнообразие, что означает, что потенциально модификация структуры аптамеров может привести к повышению их активности за счет повышения доли активной конформации.
Биоинформатический поиск детерминант активности ДНК-аптамеров к гемагглютинину дал следующие результаты:
1) для высокой функциональной активности аптамеров к гемагглютинину нужна "нежесткая" структура, т.е. необходима ограниченная конформационная подвижность аптамера;
2) в первичных структурах аптамеров к гемагглютинину нет консенсусных участков;
3) в элементах вторичной структуры аптамеров есть следующие консенсусные участки: в петлях шпилек - TAA и CGAC, а в неструктурированных участках аптамеров - TAA, GAA и CC-повторы.
Найденные последовательности, предположительно, являются частью фармакофоров ДНК-аптамеров к гемагглютинину.
3. В обзоре суммированы данные о способах получения и очистки гемагглютининов, а также о методах определения активности гемагглютининов. Приведены методики определения активности НА, подробно рассмотрен принцип методов, границы их применимости и сравнительный анализ их достоинств и недостатков, стандартизация и обработка результатов эксперимента, особенности пробоподготовки. Рассмотрены следующие методы:
1) тесты, основанные на гемагглютинации эритроцитов;
2) иммунохимические тесты, включая:
- одиночную радиальную иммунодиффузию (SRID),
- иммуноэлектрофорез (IEP, rocket electrophoresis),
- иммуноферментный анализ (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA);
3) хроматографические методы.
Рассматривая эти методы с точки зрения их применимости к изучению ингибиторов гемагглютинина, наиболее простыми в исполнении оказались тесты, основанные на гемагглютинации эритроцитов. Более сложным, но и более чувствительным является иммуноферментный анализ. На следующих этапах выполнения гранта планируется, в первую очередь, использовать тесты, основанные на гемагглютинации эритроцитов, как тест, удобный для скрининга новых аптамеров к гемагглютинину. |
| 2 |
1 января 2016 г.-15 декабря 2016 г. |
Разработка и изучение новых ДНК-аптамеров к гемагглютинину |
| Результаты этапа: Для создания серии новых потенциальных аптамеров к гемагглютинину были выбраны три представителя разных структурных топологий. Аптамер НА9 имеет топологию "шпильки", НА7 - G-квадруплекса, а НА5 - i-мотива. На основе этих трех аптамеров предложена серия потенциальных аптамеров. Основной идеей при разработке новых аптамеров является предположение о возможных узнающих петлях, которые были найдены биоинформатическими методами в 2015 году. В частности, в нашем обзоре были описаны следующие потенциальные узнающие петли: TAA, GAA и СС. В 2016 году запланирован синтез и исследование топологии и полиморфизма серии потенциальных аптамеров к гемагглютинину. 9 аптамеров были предложены и охарактеризованы спектроскопией кругового дихроизма и УФ-спектроскопией при разных температурах (эксперименты по "плавлению") и рН (для аптамеров с i-мотивом).
Показано, что рН стабильность аптамера НА5 определяется не только количеством цитозинов в повторе, но и структурой петель: цитозиновые петли увеличивают рН полуперехода и термическую стабильность при низких рН. Возможно, феномен связан с образованием дополнительных пар С-Н+-С в петлях при рН ниже 6. Олигонуклеотиды НА5_1 и НА5_2 имеют замены в большой петле ААGAAGAA, содержащей потенциальный узнающий мотив GAA. В олигонуклеотиде НА5_1 гуанины заменены на аденины, т.е. убран потенциальный узнающий мотив. А в олигонуклеотиде НА5_2 гуанины заменены на тимины, создавая потенциальный узнающий мотив TAA. Внесенные изменения практически не повлияли на рН полуперехода i-мотива, в обоих случаях он составил 7,2. Термическая стабильность i-мотива обоих олигонуклеотидов также близка к таковой аптамера НА5.
Аптамер НА7 ранее был охарактеризован нами как параллельный G-квадруплекс с пропеллерными петлями по 1, 2 и 7 нуклеотидов. Самая длинная петля представлена нуклеотидами TTATTTT, которые и были подвержены изменениям при разработке потенциальных аптамеров. В НА7-1 петля была укорочена до 3 нуклеотидов (ТТА), в НА7-2 - последние 2 тимина заменены на 2 аденина (для получения узнающей петли ТАА, в НА7-3 - 6-звенная петля содержит оба узнающих мотива - ТАА и GAA. Все аптамеры сохранили топологию параллельного G-квадруплекса. Укорочение длинной петли в олигонуклеотиде НА7-1 привело к повышению температуры "плавления" G-квадруплекса на 10оС. Остальные модификации, не затрагивающие длину петли, не повлияли на топологию и мало изменили стабильность структуры. Еще одна модификация аптамера НА7 касается не изменения его последовательности, а изменения конформации аптамера с помощью катиона бария. Комплекс имеет повышенную термическую устойчивость.
Аптамер НА9 имеет топологию "шпильки". Т.к. "шпилька" имеет несколько "несовершенств" в виде внутренних петель, mismatch, выпетливаний, в данном случае изменение УФ-спектра при денатурации незначительно. Далее проанализированы КД-спектры аптамеров. НА9-1 имеет замены двух петель ТАА на ТТТ (т.е. убраны узнающие петли), а аптамер НА9-2 - замены ТАА на петли GAA. Введение пиримидиновых оснований вместо пуриновых привело с снижению термической стабильности, и наоборот, введение пуринового основания вместо пиримидинового несколько увеличило стабильность структуры. Такие эффекты, вероятно, связаны с эффектами стэккинга петли с участком дуплекса.
Аптамер НА5 и его гомологи были изучены методами молекулярной динамики. На основе языка программирования python был разработан алгоритм, который осуществляет сборку новой структуры из одноцепочечной ДНК, используя геометрические ограничения взятые из известной структуры i-мотива. Для успешной сборки, процедуру надо осуществлять в два этапа: первый, со слабыми ограничениями на межатомные расстояния и углы, а затем уже с более сильными. Судя по всему, это связано с тем, что при сильных ограничениях, как только атомы достигают нужного расстояния относительно друг друга, они уже сильно ограничивают конформационное сканирование при моделировании отжига, но такое явление часто происходит в процессе сборки случайно, когда структура ещё не достигла нужной конформации, а также некоторые атомы уже могут находится на данных расстояниях в исходной структуре спиральной НК, то есть она достигает некоего локального минимума, из которого не может выйти. А сборка в два этапа помогает избежать такого явления.
Все получившиеся варианты аптамеров были проверены на сохранение топологии i-мотива, что позволило отсеять часть структур из дальнейшего рассмотрения. Часть структур была также отсеяна из-за неправильной конформации связывающих петель. Для анализа устойчивости гибридной структуры использовалась молекулярная динамика в явно заданном растворителе в программном пакете GROMACS. На шаге минимизации энергии несколько структур потеряли нужную конформацию, в результате чего осталось 10 возможных вариантов аптамеров. Для 7 из них, на данный момент, завершена молекулярная динамика и проведён анализ полученной траектории.
Лучшая структура характеризуется длиной i-мотива в 10 пар оснований, двумя внутренними петлями длиной по два нуклеотида между i-мотивом и дуплексной частью. Для соединения между тяжами i-мотива выгодными оказались петли длиной 4-5 нуклеотидов. Можно предположить, что именно эти петли и являются ключевыми узнающими элементами.
На основании выполненной работы можно заключить, что разработан подход к конструированию третичной структуры аптамерных ДНК с топологией i-мотива. Подход позволяет ранжировать различные варианты вторичной структуры в моделях третичной структуры. В будущем будут предприняты шаги по поиску взаимосвязи структуры предлагаемых аптамеров и их функциональной активности.
Для атомно-силовой микроскопии (АСМ) была использована подложка из модифицированного высоко-ориентированного пиролитического графита (ВОПГ). Данная методология была применена для анализа образцов гемагглютинина вируса гриппа. Были изучены гемагглютинины из трех разных штаммов, сорбированные на модифицированном ВОПГ, при разных рН до конформационного перехода белка (рН 7,6), промежуточную точку в районе рН конформационного перехода (рН 6,3) и после конформационного перехода (рН 5,0).
Три образца рекомбинантного гемагглютинина содержат как мономерный белок, так и его тримеры и олигомеры с высотой до 12,5 нм, что соответствует диаметру молекулы. Гистограммы распределения высот объектов имеют выраженную рН-зависимость. При этом тенденция индивидуальна для белка из каждого штамма. Так, количество олигомеров гемагглютинина из штамма H3N2 при снижении рН сначала значительно увеличивается (плечо в районе 6,5 нм вероятно соответствует тримеру белка), а затем снова уменьшается при рН 5. Сходная тенденция имеется в образцах гемагглютинина из штамма H1N1, однако плечо пика находится в районе 9 нм (что соответствует более крупному олигомеру). А в образцах гемагглютинина из штамма H9N2 снижение рН приводит к монотонному увеличению доли олигомеров, при этом их диаметр превышает даже 12 нм.
Этот феномен интересен с точки зрения изучения функции аптамеров. В модельном эксперименте мы использовали антитела к гемагглютинину из штамма H3N2, которые должны интерферировать с образованием олигомеров белка, т.к. их эпитоп (по результатам компьютерного анализа данных РСА) находится на боковой грани гемагглютинина. Мы провели эксперимент по определению конформационного состояния гемагглютинина из штамма H3N2 в присутствии эквивалентного количества антитела. Результаты приведены на рис. 20. Во всех изученных образцах добавление антитела приводило к значительному снижению доли крупных олигомеров гемагглютинина. Предположительно, феномен связан с блокированием эпитопа, участвующего в образовании межмолекулярных комплексов гемагглютинина.
Для изучения функциональной активности ДНК-аптамеров к гемагглютинину предполагалось использовать тест агглютинации эритроцитов человека под действием гемагглютинина. Эритроциты под действием гемагглютинина образуют осадок (сгусток), размер которого пропорционален количеству активного гемагглютинина. В литературе было показано, что данный метод позволяет оценить не только IC50, но и константу ингибирования гемагглютинина (на примере синтетических аналогов сиаловых кислот).
В 2016 году были поставлены несколько методик, пригодных для определения функциональной активности. Были апробированы пять методик определения функциональной активности и аффинности ДНК-аптамеров к гемагглютинину, включая гемагглютинацию эритроцитов рекомбинантным гемагглютинином и вирусами гриппа, ИФА с антителами к гемагглютинину и рекомбинантным белком, ИФА с фетуином и вирусами гриппа и поверхностный плазмонный резонанс в модификации с силикатной подложкой. Данные методики были применены к ДНК-аптамерам НА5, НА7 и НА9. Показано, что достаточной чувствительностью обладает разновидность ИФА на основе комплексообразования между вирионами гриппа и белком фетуином. Показано взаимодействие аптамера НА5 с пятью разными вирусами гриппа, при этом наибольшее связывание наблюдалось со штаммами aichi K2168 и H3N1 5154. В дальнейшем предлагается использовать данную методику, а также вариант поверхностного плазмонного резонанса с сукцинимидным способом иммобилизации гемагглютинина. Дальнейшая работа будет проводиться совместно с вирусологами из ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» и ФГБУ «Научно-исследовательский институт ГРИППА» Минздрава РФ, поскольку именно они обладают необходимой базой разных штаммов вирусов гриппа и лабораториями для работы с вирулентными штаммами.
|
| 3 |
1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. |
Функциональная активность ДНК-аптамеров к гемагглютинину |
| Результаты этапа: Методом поверхностного плазмонного резонанса определена аффинность восьми аптамеров к гемагглютининам (ГА) пяти разных штаммов. Еще пять аптамеров были охарактеризованы качественно на связывание с ГА четырех разных штаммов. Для аптамеров с каркасом i-мотива качественно показано связывание с ГА; обнаружено различие в специфичности, которая зависит от нуклеотидной последовательности предполагаемых участков петель. Для аптамеров с каркасами G-квадруплекса и несовершенного дуплекса удалось оценить кинетические и равновесные константы для комплексов с ГА 5 разных штаммов.
Функциональная активность ГА определяется его олигомерным состоянием и рН. Атомной силовой микроскопией (АСМ) высокого разрешения показали различия в олигомеризации рекомбинантных ГА разных штаммов вирусов гриппа при нейтральном и слабокислом рН. Взаимодействие ГА с лигандами, моноклональным антителом и ДНК-аптамерами, влияло на олигомеризацию ГА. В образцах ГА преобладала фракция тримеров. Мономеры, вероятно, присутствуют в незначительных количествах, например, в образце ГА H1. Олигомерное состояние ГА коррелирует с их функциональной активностью. ГА H5 и H7 с минимальными размерами олигомеров индуцировали агглютинацию эритроцитов человека. Другие образцы ГА содержат различные олигомеры, которые функционально неактивны. Полученные данные согласуются с тем, что именно тримерный ГА проявляет функциональную активность.
рН эффективно влияет на олигомерный состав ГА для Н1, Н3 и Н9, которые не обладали функциональной активностью и содержали большие лабильные олигомеры. Напротив, функционально активные НА сохранили свое олигомерное состояние при изменении рН.
На конформацию и, следовательно, олигомеризацию ГА можно повлиять путем связывания с лигандами. «Сильные» лиганды могут связывать одну из конформаций ГА и сдвигать баланс между олигомерами. Взаимодействие ГА Н3 с антителом, эпитоп которого расположен в межфазной части тримера ГА, препятствует олигомеризации; даже при использовании субстехиометрического количества. По-видимому, олигомеры мало стабильны, что позволяет смещать равновесие.
Структура аптамера I5 зависит от рН, поскольку его каркас образуется i-мотивом, который собирается при кислом pH. В отличие от антител, аптамер способствовал образованию крупных олигомеров: объем увеличивался в 3-12 раз с максимальным эффектом при рН 5.
Функциональная активность серии ДНК-аптамеров к ГА определялась несколькими методами. В тесте ингибирования агглютинации эритроцитов определяли KiHAI для разных аптамеров. Значения составляют несколько мкМ, что на 2-3 порядка превышает аффинность аптамеров к ГА. Аналогичный концентрационный эффект наблюдается при ингибировании связывания вируса гриппа с поверхностью, модифицированной гликозилированными белками. По-видимому, причиной служит низкая эффективность моновалентного лиганда (аптамера) в конкуренции с мультивалентным, многоцентровым связыванием вируса с поверхностью, покрытой гликозилированными белками. Очевидно, что улучшить ингибирующую активность аптамеров можно путем создания поливалентных конструкций.
Ингибирующую активность аптамеров оценили в тесте нейтрализации инфекции вирусами гриппа. Испытаны пять аптамеров: I5, I5-5, I5-T, G7 и G7-1; все они ингибировали заражение вирусами культур клеток в диапазоне концентраций 1-4 мкМ. По предварительным данных эффективность аптамеров убывает в ряду: I5 = I5-5 > I5-T = G7 = G7-1.
Разработана методика (ELAA), аналог ИФА, которая позволила оценить связывание аптамеров с целыми вирусными частицами. Показанное ранее связывание аптамеров с ГА не гарантирует связывания с вирусом, поскольку эпитоп может быть маскирован. Максимальный сигнал получен для аптамеров I5 и I5-Т. Аптамеры проявляют специфичность к разным штаммам вируса. Штамм Н5N1 и даже штамм Н3N1, родственный штамму Н3N2, аптамер связывает с низкой эффективностью. Напротив, аптамер G7 с низкой активностью к штамму Н3N2, хорошо связывает штаммы Н5N1 и Н3N1. На основе штамм-специфичных аптамеров можно разработать тест-систему для определения штамма вирусов гриппа. Для создания аптамера, универсального к разным штаммам вирусов гриппа, потребуется оптимизация структуры, другая альтернатива - использование комбинации аптамеров.
Аптамеры с каркасной структурой i-мотива:
Из данных рН- и температурной стабильности модификаций базового аптамера I5 можно заключить, что i-мотив формируется из блоков по 5 цитозинов. Таким образом, появляется возможность менять предполагаемые узнающие петли – AAGAAGAA, С3 и С4, без нарушения структуры каркаса. Эксперименты показали, что состав петель мало влияет на каркас i-мотива. Замена цитозиновых петель на тиминовые в аптамерах I5-Т и I5-С5 приводила к улучшению связывания ГА. Аптамер I5-Т показал высокую аффинность и к вирусам гриппа. По-видимому, это явилось следствием ограничения конформационного полиморфизма исходного блока из 22 С, что естественно привело к повышению аффинности.
Частичная замена предполагаемых узнающих петель сохраняет функциональную активность аптамеров, изменяя специфичность к разным штаммам, а замена всех петель приводит к потере активности.
Аптамеры с каркасной структурой G-квадруплекса
G-квадруплексные аптамеры, в отличие от аптамеров с i-мотивом, имеют меньшие по модулю величины энергии Гиббса. Модификация узнающей петли незначительно влияет на термодинамику структуры, в то время как укорочение петли приводит к структурированию аптамера. Что касается аффинности к ГА разных штаммов, аптамер с короткой петлей оказался наиболее близок к исходному аптамеру, различия в константах не превышали двух раз. Введение консенсусов увеличило специфичность аптамеров для разных штаммов. Связывание серии G-квадруплексных аптамеров с вирусами гриппа показало, что функциональная активность G7-2 и G7-3 сравнима с таковой для G7 и выше, чем для G7-1.
Аптамеры с каркасной структурой несовершенного дуплекса
Несовершенные дуплексные аптамеры обладают наименьшей термодинамической стабильностью структуры. Аптамер D9-1 с заменой консенсусных участков петель на тиминовую вставку – единственный из всех исследованных аптамеров показал положительную энергию Гиббса. Для D9-2, с консенсусом GAA, энтальпии понижается на 20 кДж/моль вместе с синхронным понижением энтропийного фактора, в итоге термодинамическая стабильность, в целом, понижается.
Для дуплексных аптамеров наблюдается прямая корреляция между стабильностью структуры и функциональной активностью: D9-1 обладает наименьшей стабильностью и функциональной активностью. Наличие функциональной активности у аптамера с положительной энергией Гиббса можно объяснить фолдингом слабоструктурированного аптамера на поверхности белка. Как и в случае аптамеров с каркасами G-квадруплекса и i-мотива, введение и удаление консенсусов влияет на специфичность аптамеров. |
