| 1 |
2 февраля 2015 г.-31 декабря 2015 г. |
Функциональный анализ неканонического модуля транспортных генов вирусов растений |
| Результаты этапа: Ген ТБГ1 вируса зеленой пятнистости гибискуса (ВЗПГ) был клонирован в вектор для экспрессии в E. coli, отработаны условия для его экспрессии в бактериальных клетках и аффинной очистки. Клонирован участок генома ВЗПГ, включающий гены ТБГ2 и ТБГ3. Гены ТБГ1, ТБГ2 и ТБГ3 ВЗПГ, слитые с GFP либо mRFP, были клонированы в составе бинарного вектора под контролем 35S-промотера; получены агробактериальные культуры, несущие полученные векторные конструкции. В экспериментах по агроинфильтрации листьев N.benthamiana с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии изучена субклеточная локализация слитых белков. Был проведен биоинформатический анализ имеющихся баз данных транскриптомов с целью идентификации ранее неизвестных вирусов и вирусоподобных последовательностей. Результаты анализа обнаруженных новых вирусных последовательностей согласуются с ранее предложенным сценарием происхождения и эволюции ТБГ, который включает три последовательных этапа: возникновение гена ТБГ1, кодирующего хеликазный домен, приобретение гена ТГБ2 в результате горизонтального переноса генов или автономизации С-концевого домена ТБГ1, и возникновение гена ТБГ3 в геномном блоке, состоящем из ТБГ1 и ТБГ2. |
| 2 |
1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. |
Функциональный анализ неканонического модуля транспортных генов вирусов растений |
| Результаты этапа: Показано, что белки, кодируемые открытыми рамками трансляции (ОРТ) 2 и 3 в геномной РНК2 вируса зеленой пятнистости гибискуса (ВЗПГ), достаточны для комплементации межклеточного транспорта в растениях Nicotiana benthamiana мутантного варианта Х-вируса кортофеля, лишенного транспортной функции. Эти два гена представляют собой специализированный транспортный модуль, названый «бинарный транспортный блок» (БТБ); в соответствии с этим ОРТ2 и ОРТ3 ВЗПГ были названы генами БТБ1 и БТБ2. Эксперименты по субклеточной локализации показали, что в эпидермальных клетках N. benthamiana слитный белок GFP-БТБ1 локализовался диффузно в цитоплазме и ядре. Однако в присутствии белка БМБ2 направлялся в локализованные у клеточной стенки вытянутые тела, а также в точечные структуры в клеточной стенке, которые ко-локализовались с отложениями каллозы у плазмодесм, и в соседние клетки. Таким образом, было показано, что белок БМБ2 ВЗПГ может направлять белок БМБ2 к плазмодесмам и через плазмодесмы. Полученные данные подтверждают ранее предложенную модель, в соответствии с которой межклеточный транспорт вирусных белков включает стадию первичной доставки в мембранные компартменты, находящиеся в непосредственной близости от плазмодесм, дальнейшую транслокацию во внутреннюю полость плазмодесм и, наконец, транспорт в прилежащие клетки. |
| 3 |
1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. |
Функциональный анализ неканонического модуля транспортных генов вирусов растений |
| Результаты этапа: Исследование механизмов внутриклеточного транспорта белков БМБ показало, что актин-связывающие белки, супрессирующие транспорт по актиновым филаментам и приводящие к разрушению природной структуры эндоплазматического ретикулума (ЭПР), блокировали транспорт БТБ2 к периферии клетки и приводили к его локализации в ассоциации с аберрантными структурам ЭПР. С другой стороны, показано, что блокирование формирования COPII-везикул, необходимых для транспорта мембранных и секретируемых белков их ЭПР в структуры аппарата Гольджи, не оказывает влияния на транспорт белка БТБ2 к периферии клетки. |
