ИСТИНА

Проект направлен на решение фундаментальной проблемы рационального создания химических соединений с определенными типами биологической активности. Традиционно обнаружение таких веществ являлось, во многом, результатом случайных находок. Характерные для современной науки достижения в области установления пространственных структур сложных белковых молекул и проникновение методов компьютерного молекулярного моделирования в органическую химию позволяют существенно увеличить долю рациональности в поиске физиологически активных веществ и создавать органические структуры, обладающие заранее заданными биологическими свойствами. В русле этой глобальной научной тенденции и находится настоящая работа. Основной задачей данного проекта в рамках указанной фундаментальной проблемы является разработка необычных типов биоизостерической замены для создания новых структурных классов физиологически активных веществ, воздействующих на такие молекулярные мишени человеческого организма, как клеточный белок тубулин и построенные из него микротрубочки, АМРА-глутаматные рецепторы и белки оболочки флавивирусов. Подобные соединения обладают потенциальной противоопухолевой, противовирусной и нейропротекторной активностью, а также способностью повышения когнитивных (познавательных) функций мозга. Задача проекта включает в себя выполнение трех основных логических этапов создания физиологически активных соединений: предсказание – синтез – испытания. Для предсказания активности предполагается проведение компьютерного молекулярного моделирования с использованием данных рентгеноструктурного анализа различных областей белка тубулина (в комплексе с известными лигандами), моделей AMPA рецепторов и белков оболочки флавивирусов. Основным этапом работы по проекту является синтез смоделированных структур, позволяющий получить новые неописанные классы потенциальных физиологически активных веществ, а также внести заметный теоретический вклад в химию гетероциклических, мостиковых и каркасных соединений. На заключительном этапе предполагается проведение биологического тестирования полученных веществ (совместно с Университетом г. Росток, Германия, Институтом полиомиелита и вирусного энцефалита имени M.П. Чумакова РАМН и Институтом физиологически активных веществ РАН), а также составление корреляций структура – активность, выявление серий биоизостерических соединений и определение дальнейших путей оптимизации структур. Сравнение полученных результатов с мировым уровнем. Изостерическая и биоизостерическая замена атомов или группировок в структурном прототипе будущего лекарства широко используется в ходе дизайна лекарственных веществ с целью увеличения активности, улучшения фармакокинетических характеристик или упрощения схемы их синтеза, а также для увеличения структурного разнообразия лигандов тех или иных молекулярных мишеней [1. 2]. В ходе реализации данного проекта начато изучение возможностей применения новых типов неклассической биоизостерической замены с участием каркасных, мостиковых и гетероциклических группировок для создания веществ с противоопухолевой и противовирусной активностью. В качестве основной молекулярной мишени выбран клеточный белок тубулин и построенные из него микротрубочки, на которые действуют известные противоопухолевые вещества таксол, винбластин и колхицин [3, 4]. Подавляющее большинство мировых исследований по созданию тубулин-направленных лигандов посвящено модификациям лигандов колхицинового домена [5–7], главным образом структурно простого и высоко активного комбретастатина А-4 (СА-4), причем преобладают небольшие модификации линкера и заместителей в ароматических кольцах исходной молекулы [8]. Попытки же сильного удлинения расстояния между двумя арильными группировками СА-4 представлены единичными работами (см., например, [9] и ссылки в ней), и исследование именно такой биоизостерической замены начато авторским коллективом в настоящем проекте. Проведенный в рамках выполнения его первого этапа тщательный литературный анализ выявил крайне малое число работ, посвященных созданию лигандов колхицинового домена с использованием мостиковых группировок (один из нескольких примеров – см. в [10]), а также попыток замены стероидного скелета 2-метоксиэстрадиола (взаимодействующего с указанной областью) нестероидными группировками (см. единичный пример [11]). Поэтому проводимая авторским коллективом разработка бицикло[3.3.1]нонановых аналогов 2-метоксиэстрадиола является оригинальным в плане приема дизайна исследованием. В последние годы в литературе заметно увеличение числа работ по созданию необычных, «гибридных» лигандов тубулина [12, 13], и в этих рамках находятся исследования авторского коллектива по синтезу изостерических аналогов тубулокластина – противоопухолевого агента, обладающего необычной двойной активностью и очень высокой цитотоксичностью. Высокая активность подобных соединений делает их привлекательными соединениями для использования в химиотерапии опухолевых заболеваний. В русле современных тенденций в поиске лекарственных веществ находится и раздел проекта, посвященный синтезу веществ с потенциальной активностью против штаммов флавивирусов. Поиски ингибиторов размножения соответствующих вирионов ведутся различными исследовательскими группами мира, но при этом наибольшее число исследований посвящено дизайну соединений, действующих на вирусы лихорадки денге, Западного Нила и желтой лихорадки (см. обзор [14]). И лишь единичные работы посвящены находкам соединений, препятствующих размножению вируса клещевого энцефалита (см., например, [15, 16]). В настоящем проекте нами разрабатываются именно такие соединения, причем на основе структурно не сложных и синтетически доступных шаблонов – адамантанов и бицикло[3.3.1]нонанов, содержащих аминоизоксазольный фрагмент. В основе синтетической части данной работы нами использовались фундаментальные мировые и отечественные разработки по синтезу и функционализации каркасных и гетероциклических соединений, так что, в целом, уровень полученных теоретических и экспериментальных результатов вполне сопоставим с мировым.

The present project is directed to the solution of the fundamental problem of the elaboration of unusual types of bioisosteric replacement for the creation of novel structural types of physiologically active compounds, acting on such molecular targets in the human organism as cell protein tubulin and microtubules, AMPA receptors and the different viral proteins. In general, we are planning to accomplish the following investigations: 1. Molecular design, synthesis and biotests of unique dual acting compound tubuloclustin, obtained by replacement of the whole pharmacophoric fragment by other known ligands of colchicine binding site. 2. Synthesis of the series of putative bioisosteric analogues of highly cytotoxic combretastatin, obtained by a rare (with a pronounced elongation) variation of a linker in the lead-compound (including the combination of the linker elongation with the replacement of one of the groups). 3. Synthesis of the series of unusual analogues of the known tubulin ligands – 2-methoxyestradiol and vinblastin – by non-classical replacement of polycyclic systems in the parent molecules by bridged and caged fragments. 4. The study of interrelation of bridged and caged fragments in the frame of tubulin ligands design, the design of antiviral compounds and ligands of AMPA receptors. 5. Synthesis of the series of putative antiviral compounds based on variations of the heterocyclic groups in the lead compounds. The solution of all the tasks will include three main steps the prediction – the synthesis – the biotests. For the prediction of the structures the computer molecular modeling will be used.

В 2015 году коллектив ожидает получить следующие результаты. · На основе исследований с помощью молекулярного моделирования определить оптимальную структуру линкера в потенциальных биоизостерических аналогах тубулокластина с другими лигандами колхицинового сайта связывания в тубулине. Разработать и осуществить многостадийные схемы синтеза аналогов тубулокластина с заменой колхицинового фрагмента комбретастатиновым. Разработать многостадийную схему синтеза стабильных аналогов тубулокластина с заменой колхицинового фрагмента 2-метоксиэстрадиольным и изучить подходы к их синтезу. Изучить полученные соединения на цитотоксичность и способность к образованию тубулиновых кластеров с помощью флуоресцентной микроскопии на клетках карциномы легких человека А549. · Реализовать многостадийные схемы синтеза аналогов тубулокластина с заменой адамантановой группировки мостиковыми фрагментами, провести для них соответствующее биотестирование. Проанализировать полученные корреляции структура – активность, на основании которых предложить улучшенную модель связывания тубулокластина и его аналогов с тубулиновым димером. · Синтезировать серию аналогов комбретастатина на основе 5-арилметилен-имидазол-4-онов и провести их биотестирование в МТТ тесте и на способность конкурировать с комбретастатином (или колхицином) за связывание с тубулином методом флуоресцентной микроскопии. В результате определить, является ли предложенный тип структуры биоизостерическим выбранным соединениям-лидерам. · Провести синтез нескольких аналогов (в том числе мостиковых) адамантанового соединения-лидера с анти-флавивирусной активностью и протестировать полученные соединения на противовирусную активность по отношению к штамму вируса клещевого энцефалита (и других штаммах флавивирусов). Провести компьютерный докинг структур наиболее активных соединений в различные области связывания модельной белковой оболочки флавивирусов. · Реализовать многостадийную схему синтеза необычных мостиковых аналогов 2-метоксиэстрадиола и провести испытания их цитотоксичности в МТТ тесте и способности конкурировать с 2-метоксиэстрадиолом (или колхицином) за связывание с тубулином методом флуоресцентной микроскопии. В дальнейшем (в 2016 – 2017 годах) коллектив ожидает получить следующие результаты. · Получить стабильные аналоги тубулокластина с 2-метоксиэстрадиольным фрагментом, а также аналоги этого соединения-лидера с подофиллотоксином и с заменой адамантановой группировки потенциальными биоизостерическими каркасными группировками. Изучить полученные соединения на цитотоксичность и способность к образованию тубулиновых кластеров и, на основании анализа корреляций структура – активность, впервые предложить модель связывания полученных аналогов тубулокластина с тубулиновым димером, а также сделать вывод об «универсальности» (или «не универсальности») кластеризующего эффекта при биоизостерической замене. · Получить серию биоизостерических аналогов комбретастатина на основе 5-аминоизоксазолов и провести их биотестирование в МТТ тесте, а для наиболее активных аналогов – тестирование на способность конкурировать с комбретастатином (или колхицином) за связывание с тубулином. Предложить модель связывания этих соединений с тубулиновым димером. · Провести молекулярный дизайн структур аналогов ремантадина с различными гетероциклами с потенциальной активностью против флавивирусов. Синтезировать серию таких соединений и провести их биотестирование на противовирусную активность по отношению к штамму вируса клещевого энцефалита (и других флавивирусов). · Провести разработку вариантов синтеза необычных аналогов винбластина, в которых катарантиновый фрагмент заменен адамантановым каркасом. В случае их успешной реализации изучить их способность вызывать деполимеризацию микротрубочек и образование паракристаллов тубулина. · Провести молекулярный дизайн и синтез потенциальных биоизостерических адамантановых аналогов лиганда АМРА-рецепторов на основе замещенных азабицикло[3.3.1]нонан-9-онов и провести тестирование их способности влиять на вход кальция в клетку, а для наиболее активных соединений – на стимуляцию памяти и когнитивных (познавательных) способностей на поведенческих моделях in vivo. · В случае получения высоко активных биоизостерических аналогов тубулокластина провести их тестирование в экспериментах in vivo (совместно с Институтом экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра имени Н.Н. Блохина РАМН). В целом, в результате выполнения настоящего проекта будут сконструированы, синтезированы и протестированы новые структурные типы соединений с противоопухолевой, противовирусной и нейропротекторной активностью, а также внесен вклад в расширение приемов неклассической биоизостерической замены в дизайне физиологически активных веществ.

Ранее участниками коллектива c помощью метода структурного моделирования и на основании литературного исследования был создан новый тип гибридных соединений, объединяющих в своей молекуле фрагмент колхицина – известного ингибитора полимеризации тубулина и «упрощенного аналога» таксола на основе N-трет-бутоксикарбонил-фенилизосерилоксиадамантана. В ходе дальнейших исследований была получена серия более простых производных колхицина с очень высокой цитотоксичностью и уникальной – двойной – активностью, а в научную литературу был введен оригинальный термин – тубулокластин. Авторский коллектив разработал и осуществил серию многостадийных схем синтеза некоторых структурно близких аналогов тубулокластина, и эти разработки будут использованы и в рамках предлагаемой программы для синтеза необычных биоизостерических аналогов тубулокластина с замененным колхициновым фрагментом и с заменой адамантановой группировки мостиковыми структурами. Благодаря проведенным участниками коллектива работам в области компьютерного молекулярного моделирования, были предложены несколько вариантов биоизостерических аналогов колхицина, слишком токсичного для клинического использования в противораковой терапии. Авторами разработаны методы получения таких соединений и начата их реализация. Предварительные данные по компьютерному моделированию показывают, что возможна биоизостерическая замена сложного катарантинового фрагмента в молекуле алкалоида несложными производными адамантана. Эти результаты стимулируют проведение расширенных работ по созданию соответствующих аналогов винбластина. Коллектив обладает большим опытом и навыками работы в области дизайна структур физиологически активных веществ с каркасными и мостиковыми фрагментами. Участники коллектива имеют навыки биотестирования получаемых соединений на некоторые типы биологической активности.

В проекте разрабатываются новые типы неклассической биоизостерической замены для создания структур веществ с различными типами физиологической активности. На этапе 2015 года: I. В рамках работ по изучению различных типов биоизостерической замены в соединении «двойного действия» на основе исследований с помощью молекулярного моделирования определена оптимальная структура линкеров в аналогах тубулокластина [N-(8-(адамант-2-илокси)-8-оксооктаноил)-N-дезацетилколхицина] с другими лигандами колхицинового сайта связывания в тубулине – комбретастатином и 2-метоксиэстрадиолом. Продемонстрирована сложность проведения реакции восстановительного аминирования 2-метокси-6-оксо-17β-эстрадиола с адамант-2-ил-8-аминооктаноатом, приводящая к получению 2-метокси-6,7-дегидроэстра-1,3,5(10)-триен-3,17β-диола и требующая подбора других методик синтеза целевого конъюгата – 2-адамантил-8-[(2-метоксиэстра-1,3,5(10)-триен-3,17β-диол-6-ил)амино]октаноата. Разработаны и реализованы многостадийные схемы синтеза аналогов тубулокластина с заменой колхицинового фрагмента комбретастатиновым. Синтезированный в ходе этих работ 2-адамантиловый эфир 7-[(2-{[(2E)-3-(3-гидрокси-4-метоксифенил)-2-(3,4,5-триметоксифенил)проп-2-еноил]амино}этил)амино]-7-оксогептановой кислоты обладает заметной цитотоксичностью по отношению к клеткам карциномы легких А549, способен влиять на динамику микротрубочек и выбран в качестве нового соединения-лидера для дальнейшей структурной оптимизации. Реализованы две многостадийных схемы синтеза аналогов тубулокластина с заменой адамантановой группировки. II. В ходе исследований по варьированию линкера в соединении-лидере (в комбинации с заменой одной из связанных группировок) получена серия аналогов комбретастатина на основе 5-арилметилиден-оксазол-4-онов и N-метил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-онов, биотестирование которых на цитотоксичность по отношению к клеткам карциномы легких А549 выявило весьма активное соединение – (5Z)-5-[(4-метоксифенил)метилиден]-3-метил-2-(4-метилфенил)-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он, перспективное для дальнейшей оптимизации его структуры. III. В ходе работ по изучению взаимозаменяемости каркасных и мостиковых группировок полностью реализован синтез нового бицикло[3.3.1]нонанового аналога адамантан-содержащего соединения-лидера [1-(5-аминоизоксазол-3-ил)-3-адамант-1-илпропан-1-она] и начато получение серии близких по структуре соединений с целью последующего тестирования на противовирусную активность по отношению к штаммам вируса клещевого энцефалита и других флавивирусов. IV. В рамках исследований по замене полициклической системы в соединении-лидере мостиковой группировкой реализована многостадийная схема синтеза необычного нестероидного аналога 2-метоксиэстрадиола на основе производного бицикло[3.3.1]нонана, аннелированного с гваяколом. В целом, в результате выполнения первого этапа настоящего проекта сконструированы, синтезированы и протестированы новые структурные типы соединений с противоопухолевой и потенциальной противовирусной активностью, а также внесен вклад в расширение приемов неклассической биоизостерической замены в дизайне физиологически активных веществ.