Кардиотонические стероиды как регуляторы транскрипции генов: идентификация относительной роли моновалентных катионов и кальцияНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 9 февраля 2015 г.-31 декабря 2015 г. Кардиотонические стероиды как регуляторы транскрипции генов: идентификация относительной роли моновалентных катионов и кальция
Результаты этапа: Дабы избежать артефактов, обусловленных клеточной смертью, в первой части нашей работы мы изучили дозовую зависимость действия КТС на жизнеспособность клеток HUVEC. Как видно из Рисунка 1 при увеличении времени инкубации уабаин оказывал цитотоксическое действие при меньших концентрациях. Так было установлено, что через 24, 38 и 72 часа смерть клеток HUVEC, регистрируемая по потере их связи с подложкой, наблюдалась при концентрациях уабаина больших, чем 100, 30 и 10 nM, соответственно, в то время как при через 6 часов клетки оставались живыми даже в присутствии 3,000 nM уабаина. Этот вывод нами был подтвержден с помощью фазово-контрастной микроскопии (Рис. 2), а также измерениями содержания фрагментов хроматина (Taблица 1) и активности каспазы-3 (Taблица 2). Рис. 1. Дозовая зависимость действия уабаина через 6, 24, 48 и 72 часа инкубации на жизнеспособность клеток HUVEC. О гибели клеток судили по потери их связывания с подложкой. * p<0.05 Рис. 2. Фазово-контрастная микроскопия клеток HUVEC после 6, 24, 48 и 72 час инкубации с уабаином в концентрациях, указанных в правом углу. Taблица 1. Дозовая зависимость действие уабаина на распад хроматина в клетках HUVEC Ouabain, nM Chromatin fragments, % 6 hr 24 hr 48 hr 72 hr 0 2.9±1.1 2.0±0.8 3.3±1.2 3.9±2.0 1 ND ND ND 3.0±1.6 3 ND ND ND 4.6±2.4 10 ND ND 4.0±1.6 7.1±2.1 30 ND 3.1±0.9 19.5±4.4 25.6±6.7 100 4.5±1.8 15.0±4.7 41.5±8.8 36.7±7.0 3,000 6.2.±2.1 43.4±7.3 38.8±4.9 35.4±5.5 ND – this parameter was not determined. The total content of 3H-labeled DNA was taken as 100%. Means ± S.E. from experiments performed in quadruplicates are shown. Taблица 2. Дозовая зависимость действие уабаина на активность каспазы-3 в клетках HUVEC Ouabain, nM Csapase-3 activity (nmol per mg of protein per hr) 6 hr 24 hr 48 hr 72 hr 0 0.25±0.03 0.23±0.02 0.29±0.06 0.37±0.05 1 ND ND ND 0.30±0.08 3 ND ND ND 0.36±0.04 10 ND ND 0.40±0.03 0.65±0.18 30 ND 0.33±0.05 1.50±0.14 2.06±0.18 100 0.29±0.03 1.09±0.07 3.15±0.28 3.22±0.20 3,000 0.44.±0.07 3.04±0.12 2.88±0.29 2.98±0.22 ND – this parameter was not determined. Means ± S.E. from experiments performed in triplicates are shown. В дополнительных экспериментах мы изучали дозовую зависимость действия КТС на жизнеспособность клеток HUVEC при 96-час инкубации. Используя фазаво-контрастную микроскопию, мы не обнаружили гибель клеток при увеличении концентрации МБГ в диапазоне от 0.3 до 30 nM (Рис. 3); отрицательные результаты были также получены при исследовании всеми другими, указанными выше методами. В отличии от МБГ, после 96 час инкубации потеря клетками связи с подложкой наблюдалась при концентрациях уабаина выше 10 nM (Рис. 3). Исходя из полученных данных при исследовании влияния КТС на внутриклеточную концентрацию натрия и калия и транскриптом клеток мы использовали уабаин и МБГ при тез коенцентрациях и временах инкубации, при которых они не оказывали влияния на жизнеспособность клеток. Рис. 3. Фазово-контрастная микроскопия клеток HUVEC после 96 час инкубации с уабаином и МБГ в концентрациях, указанных в правом углу. Как видно из рисунков 4 и 5 в диапазоне от 1 до 3 nM уабаин увеличивал K+i и уменьшал Na+¬i на 20-30%. Это наблюдение согласуется с активацией Na+,K+-ATPaзы низкими дозами КТС, обнаруженной целым рядом исследователей 3;4 5 6 7 8 9;10. Как и ожидалось в более высоких концентрациях уабаин ингибировал Na+,K+-ATPaзу, что приводило к диссипации трансмембранных градиентов моновалентных катионов. Для нашего исследования важно отметить, что кажущее сродство к уабаину увеличивалось по мере увеличения времени инкубации. Так, например, при 6 часовой инкубации полумакимальное увеличение [Na+]i происходило в присутствии 100 nM уабаина, в то время как после 24 и 48 час инкубации такой же эффект был отмечен в присутствии 3 и 10 nM уабаина, соответственно (Рис. 5). При 96-часовой инкубации уабаин в концентрации 3 nM увеличивал [Na+]i и уменьшал [K+]i в ~3 и 2 раза, соответственно (Рис 6). В отличие уабаина, мы не обнаружили существенного влияния 96-часовой инкубации на соотношение [Na+]i/[K+]i в присутствии 10 нМ МБГ. Этот результат согласуется с данными, полученными ранее на клетках эпителия почечных канальцев собаки 11. Рис. 4. Дозовая зависимость действия уабаина через 6, 24, 48 и 72 часа инкубации на содержание K+ content в клетках HUVEC. * p<0.05 Рис. 5. Дозовая зависимость действия уабаина через 6, 24, 48 и 72 часа инкубации на содержание Na+¬i content в клетках HUVEC. * p<0.05 Рис. 6. Дозовая зависимость действия уабаина (кривые 1 и 3) и МБГ (кривые 2 и 4) на содержание Na+ (кривые 1 и 2) and K+ (кривые 3 и 4) в клетках HUVEС через 96 час инкубации. * p<0.01. В следующей серии экспериментов мы сопоставили дозовые зависимости действия КТС на соотношение [Na+]i/[K+]i и транскриптом клеток эндотелия человека. С этой целью мы провели 6-час инкубацию клеток HUVEC в присутствии 30, 100 and 3,000 nM уабаина. Как уже отмечалось выше, 6-ти часовая инкубация с 30 nM уабаина не влияла на концентрацию внутриклеточного Na+ и K+ и соотношение [Na+]i/[K+]i, в то время как в концентрациях 100 и 3,000 nM уабаин уменьшал [K+]i в ~5 и 10 раз, увеличивал [Na+]i в ~3 и 8 раз; при этом соотношение [Na+]i/[K+]i возрастало в ~15 и 80 раз, соответственно (Рис. 4 и 5, Таблица 3). Taблица 3. Изменение соотношения [Na+]i/[K+]i и транскриптома клеток HUVEC после 6 часов инкубации в присутствии 30, 100 и 3000 нМ уабаина Parameter Ouabain, nM 30 100 3,000 [Na+]i/[K+]i 1.19 14.97* 78.13* Number of up-regulated transcripts ND 124 4117 Maximal fold of activation 8.71 197.05 Number of down-regulated transcripts ND 134 5160 Maximal fold of inhibition 2.85 15.75 Up- and down-regulated transcripts were defined as transcripts whose expression was increased or decreased by more than 1.2-fold (p<0.05). The [Na+]i/[K+]i ratio was calculated from data presented in Figs. 4 and 5 and taken in the absence of ouabain as 1.00. * p<0.001 compared to the [Na+]i/[K+]i ratio in cells in 6 hr incubation in the absence of ouabain. ND – differentially expressed transcripts were not detected. Изучение транскриптома было проведено с помощью набора GeneChip® Human Gene 1.0 ST array, который позволяет следить за экспрессией 28,869 гена, т.е. покрывает более 90% от общего числа генов в геноме человека. Данные были получены в 3-независимых экспериментов и обрабатывались с помощью principal component analysis (PCA) как описано нами ранее {4865;5251}. Этот подход показал, что основным источником изменения транскриптома клеток HUVEC является воздействие 100 и 3,000 nM, но не 30 nM уабаина (Рис. 7). Как видно из таблицы 3, при воздействии 100 и 3,000 nM уабаина, т.е. в концентрациях, при которых соотношение [Na+]i/[K+]i увеличивается в ~15 и 80 раз, общее число транскриптов, чья экспрессия изменена более чем в 1.2 раза (p<0.05), было 258 и 9277, соответственно. Это число соответствует 1 and 30% от общего числа транскриптов кодирующей части генома человека. Мы не обнаружили дифференциально экспрессированных транскриптов после 6 час инкубации с 30 nM уабаина, т.е. при той концентрации, при которой уабаин не влиял на внутриклеточную концентрацию Na+ и K+. Как видно из Таблицы 4 умеренное увеличение соотношение [Na+]i/[K+]i , отмеченное чере 6 час инкубации в присутствии 100 nM уабаина приводит к более чем 2-х кратному изменению экспрессии генов, вовлеченных в регуляцию транскрипции и трансляции, включая увеличение содержания транскрипционных факторов FOS, EGR1, ZFP36, ATF3, JUNB и уменьшение содержания eukaryotic translation initiation factor EIF5. Анализ этих генов, проведенный с помощью Ingenuity database (Рис. 8), показывает, что увеличение экспрессии EGR1 и JUN может обуславливать изменение экспрессии других генов, обнаруженных в этом эксперименте, а также после полномасштабной диссипации ионных градиентов, отмеченной после 6 час инкубации с 3,000 nM уабаина (Taблицы 5 и 6). Эти изменения касаются cyclooxygenase PTGS2 и других генов, вовлеченных в формирование иммунного ответа и воспаления, ADAMTS1, ADAMTS5, ADAMTS4, ADAMTS9, ядерных рецепторов подсемейства nuclear receptor subfamily 4 (NR4A1-NR4A3), генов, вовлеченных в регуляцию роста, дифференцировки и смерти клеток (KIT ligand KITLG, Kruppel-like factor KLF4, growth differential factor GDF15, tumor necrosis factor ligand TNFSF9, thioredoxin interacting protein TXNIP, G0S2 switch controlling protein G0S2, cyclin-dependent kinase WEE1). Мы также обнаружили ~7-кратное снижение EDN1 (Taблица 6) – гена, кодирующего preproendothelin-1, протеолиз которого приводит к образованию endothelin-1 – основного вазоконстриктора, продуцируемого клетками эндотелия. Эти изменения проходят на фоне ~10-кратного увеличения экспрессии универсального вазоконстриктора adrenomedulin (ADM, Taблица 5). Рис. 7. PСА анализ изменений транскриптома клеток HUVEC через 6 часов инкубации в отсутствии и присутствии 30, 100 и 3000 nM уабаина. Принципиальные компоненты на трехмерном рисунке (PC#1, PC#2 and PC#3) соответствуют вариабильности экспрессии генов в 3-х независимых экспериментах. Рис. 8. Сигнальная система, полученная с помощью IPA Knowledge Base, и которая с наиболее высокой достоверностью описывает изменения экспрессии генов клеток HUVEC через 6 час инкубации в присутствии 100 nM уабаина. Гены, чья экспрессия увеличена и уменьшена, показаны красным и зеленым цветом, соответственно. Taблица 4. Гены, чья экспрессия изменяется более чем в 2 раза после 6-ти час инкубации в присутствии 100 nM уабаина Gene symbol, title FC Affymetrix ID Fold of modulation/p value FOS // FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog TTR 7975779 6.07/1.39E-03 EGR1 // early growth response 1 TTR 8108370 5.87/2.08E-04 PTGS2 // prostaglandin-endoperoxide synthase 2 ENZ/IIR 7922976 5.86/6.23E-05 ADAMTS1 // ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 ENZ 8069676 4.16/6.23E-05 ZFP36 // zinc finger protein 36, C3H type, homolog (mouse) TTR 8028652 3.77/2.40E-03 ATF3 // activating transcription factor 3 TTR 7909610 2.60/4.17E-03 JUNB // jun B proto-oncogene TTR 8026047 2.49/1.82E-03 MIR31 // microRNA 31 TTR 8160439 2.22/3.50E-03 GDF15 // growth differentiation factor 15 GDD 8027002 2.22/1.52E-03 C2orf61 // chromosome 2 open reading frame 61 UNK 8052004 2.20/2.26E-04 KITLG // KIT ligand CYT/GDD 7965322 2.19/7.61E-04 C7orf53 // chromosome 7 open reading frame 53 UNK 8135532 2.05/1.25E-03 RPL27A // ribosomal protein L27a TTR 7938295 2.03/4.17E-03 EIF5 // eukaryotic translation initiation factor 5 TTR 7977058 -2.84/4.53E-04 MIR216A // microRNA 216a TTR 8052374 -2.08/8.99E-05 MIR27B // microRNA 27b TTR 8156571 -2.02/3.50E-03 FC – functional categories: CYT – cytokines; ENZ – non-classified enzymes; GDD – cell growth, differentiation and death; IIR – immune and inflammatory responses; ISG – intracellular signaling; OTH –others; TRP – transporters; TTR – transcription/translation regulators; UNK – function remains unknown. Taблица 5. Гены, чья экспрессия увеличивается более чем в 10 раз после 6-ти час инкубации в присутствии 3000 nM уабаина Gene symbol, title FC Affymetrix ID Fold of activation/p value IDI2 // isopentenyl-diphosphate delta isomerase 2 ENZ 7931748 154.43/1.41E-09 KLF4 // Kruppel-like factor 4 (gut) TTR 8163002 75.47/1.41E-09 FOSB // FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homol B TTR 8029693 49.97/2.01E-08 OR2B6 // olfactory receptor, family 2, subfamily B, memb 6 ISG 8117622 42.60/7.24E-09 DSTNP2 // destrin (actin depolymerizing factor) pseudogen UNK 7953518 41.24/2.14E-09 BAMBI // BMP and activin membrane-bound inhibitor ISG/GDD 7926875 29.56/3.32E-09 HIST1H2AH // histone cluster 1, H2ah TTR 8117543 27.72/3.54E-08 RPL13P5 // ribosomal protein L13 pseudogene 5 UNK 7953516 24.64/2.45E-09 HIST1H1T // histone cluster 1, H1t TTR 8124402 22.87/2.90E-09 HIST1H4I // histone cluster 1, H4i TTR 8117537 22.67/6.96E-09 RAB44 // RAB44, member RAS oncogene UNK 8119102 22.22/4.47E-09 HIST1H2BJ // histone cluster 1, , H2bj TTR 8124484 21.61/8.02E-09 SNORD77 // small nucleolar RNA, C/D box 77 TTR 7922412 19.45/9.19E-08 NR4A1 // nuclear receptor subfamily 4, group A, member 1 TTR/GDD/IIR 7955589 19.29/5.47E-08 RNASE10 // ribonuclease, RNase A family, 10 (non-active) UNK 7973078 18.79/1.19E-08 SNORD75 // small nucleolar RNA, C/D box 75 TTR 7922416 18.76/5.87E-09 LAG3 // lymphocyte-activation gene 3 CYT 7953418 18.75/2.45E-09 NEFM // neurofilament, medium polypeptide OTH 8145361 18.24/1.67E-07 ADAMTSL4 // ADAMTS-like 4 ENZ/IIR 7919743 17.98/5.09E-08 C10orf110 // chromosome 10 open reading frame 110 UNK 7925846 17.00/2.73E-08 KRTAP5-2 // keratin associated protein 5-2 OTH 7937696 15.74/2.73E-08 CENPL // centromere protein L OTH 7922391 15.18/2.14E-09 HIST1H2BG // histone cluster 1, H2bg TTR 8124423 14.75/8.00E-08 SNORA67 // small nucleolar RNA, H/ACA box 67 TTR 8004508 14.42/1.32E-08 LRRC23 // leucine rich repeat containing 23 UNK 7953520 14.41/1.09E-08 MAFB // v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene TTR 8066266 14.32/2.19E-08 ARC // activity-regulated cytoskeleton-associated OTH 8153322 13.69/2.29E-08 SNORD50B // small nucleolar RNA, C/D box 50B TTR 8127989 13.57/4.09E-07 NT5DC4 // 5'-nucleotidase domain containing 4 ENZ 8044512 13.35/2.45E-09 HIST1H2AG // histone cluster 1, H2ag TTR 8117535 12.90/8.95E-08 GEM // GTP binding protein overexpressed in skel muscle ISG 8151816 12.69/8.43E-08 SNORD78 // small nucleolar RNA, C/D box 78 TTR 7922408 12.65/6.64E-09 HIST2H2BE // histone cluster 2, H2be TTR 7919637 12.48/3.04E-08 EGR2 // early growth response 2 TTR 7933872 12.47/1.09E-06 HIST2H2BF // histone cluster 2, H2bf TTR 7919604 12.39/9.47E-09 NANOS1 // nanos homolog 1 (Drosophila) TTR 7930872 12.29/2.48E-09 ID2 // inhibitor of DNA binding 2, dominant negative TTR 8040103 12.01/1.19E-08 EGR3 // early growth response 3 TTR 8149720 11.87/2.07E-07 IER2 // immediate early response 2 GDD 8026163 11.71/1.83E-07 TLR7 // toll-like receptor 7 CYT/IRR 8166059 11.45/3.86E-08 MIR503 // microRNA 503 TTR 8175261 11.44/5.44E-08 SNORA31 // small nucleolar RNA, H/ACA box 31 TTR 7971386 11.11/8.00E-09 SNORD44 // small nucleolar RNA, C/D box 44 TTR 7922410 10.91/7.91E-08 PEG10 // paternally expressed 10 GDD 8134339 10.87/1.37E-06 CDH16 // cadherin 16, KSP-cadherin OTH 8001898 10.84/4.17E-08 GFPT2 // glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 2 ENZ 8116418 10.61/6.64E-09 RASL11A // RAS-like, family 11, member A TTR 7968236 10.55/1.97E-07 ACTN2 // actinin, alpha 2 OTH 7910727 10.18/1.36E-08 RDH10 // retinol dehydrogenase 10 (all-trans) GDD 8146921 10.14/4.03E-09 ADM // adrenomedullin ISG 7938390 10.08/1.74E-07 DNAJB1 // DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 1 OTH 8034837 10.05/5.64E-09 FC – functional categories: CYT – cytokines; ENZ – non-classified enzymes; GDD – cell growth, differentiation and death; IIR – immune and inflammatory responses; ISG – intracellular signaling; OTH –others; TRP – transporters; TTR – transcription/translation regulators; UNK – function remains unknown. Taблица 6. Гены, чья экспрессия уменьшается более чем в 5 раз после 6-ти час инкубации в присутствии 3000 nM уабаина Gene symbol, title FC Affymetrix ID Fold of modulation/p value MIR181B1 // microRNA 181b-1 TTR 7923173 -15.75/5.96E-07 MIR217 // microRNA 217 TTR 8052372 -13.45/7.66E-08 MIR221 // microRNA 221 TTR 8172266 -13.35/3.62E-09 LOC100130428 // IGYY565 UNK 7952451 -11.24/2.24E-07 FLJ36840 // hypothetical LOC645524 UNK 8144228 -9.47/7.80E-07 SAMD9L // sterile alpha motif domain containing 9-like UNK 8140971 -9.44/5.24E-08 WEE1 // WEE1 homolog (S. pombe) GDD/TTR 7938366 -8.20/3.82E-08 PRO2012 // hypothetical protein PRO2012 UNK 7924817 -8.08/9.82E-07 DICER1 // dicer 1, ribonuclease type III TTR 7981111 -7.40/5.87E-09 TRIM38 // tripartite motif-containing 38 UNK 8117321 -7.38/8.67E-08 ZNF552 // zinc finger protein 552 TTR 8031825 -6.97/2.63E-05 EDN1 // endothelin 1 OTH 8116921 -6.85/1.09E-08 MIRLET7A2 // microRNA let-7a-2 TTR 7952313 -6.23/1.56E-06 VCP // valosin-containing protein OTH 8160914 -6.14/3.62E-09 KIAA0430 // KIAA0430 GDD 7999642 -5.96/1.36E-08 ZNF192 // zinc finger protein 192 TTR 8117646 -5.93/2.46E-07 ZFC3H1 // zinc finger, C3H1-type containing UNK 7964937 -5.79/1.01E-08 MIR186 // microRNA 186 TTR 7916984 -5.79/2.85E-05 MIR222 // microRNA 222 TTR 8172268 -5.71/8.43E-07 AGGF1 // angiogenic factor with G patch and FHA domains GDD 8106429 -5.57/2.87E-08 PDGFB // platelet-derived growth factor beta polypeptide ISG/GDD 8076195 -5.47/1.76E-07 KIAA0317 // KIAA0317 UNK 7980189 -5.46/1.41E-08 ZNF780B // zinc finger protein 780B TTR 8036813 -5.44/1.89E-06 LOC100287934 // hypothetical LOC100287934 UNK 7909990 -5.42/9.06E-06 IREB2 // iron-responsive element binding protein 2 TTR 7985166 -5.28/4.59E-08 RASSF2 // Ras association (RalGDS/AF-6) domain family GDD 8064790 -5.19/8.16E-09 ZNF330 // zinc finger protein 330 TTR 8097543 -5.17/1.98E-07 FC – functional categories: CYT – cytokines; ENZ – non-classified enzymes; GDD – cell growth, differentiation and death; IIR – immune and inflammatory responses; ISG – intracellular signaling; OTH –others; TRP – transporters; TTR – transcription/translation regulators; UNK – function remains unknown. Table listed transcripts whose expression was decreased by more than 5-fold. Так как уабаин содержит стероидное кольцо, было предположено, что при длительной инкубации КТС проникают через плазматическую мембрану и влияет на транскрипцию генов посредством Na+i/K+i-независимого взаимодействия с минералкортикоидными рецепторами 12;13. В целях проверки этой гипотезы мы инкубировали клетки эндотелия в течение 96 час в присутствии 1 nM уабаина и 10 nM MБГ, которые не оказывали влияние на внутриклеточное содержание Na+ и K+, a также с 3 nM уабаина и 30 nM MБГ, в присутствии которых соотношение [Na+]i/[K+]i увеличивалось в ~7- и 3-раза, соответственно (Рис. 6). Из Таблицу 7 видно, что низкие дозы КТС даже при длительной инкубации не оказывают влияния на транскриптом клеток HUVEC, в то время увеличение соотношения [Na+]i/[K+]i в присутствии 3 nM уабаина и 30 nM MБГ было обнаружено изменение содержания 2185 и 1121 транскриптов, соответственно. Следует отметить, что среди 71 и 8 генов, чью экспрессия увеличивалась и уменьшалось в присутствии 3 nM уабаина более чем в 2 раза, экспрессия 50 генов однонаправлено изменялась в 30 nM MБГ (Taблица 8). Taблица 7. Действие уабаина и MБГ на транскриптом клеток HUVEC после 96 часов инкубации Parameter Control Ouabain, nM MBG, nM 1 3 10 30 Number of up-regulated transcripts NA ND 880 ND 484 Maximal fold of activation 33.28 21.43 Number of down-regulated transcripts NA ND 1305 ND 637 Maximal fold of inhibition 2.71 3.13 Up- and down-regulated transcripts were defined as transcripts whose expression was increased or decreased by more than 1.2-fold (p<0.05). ND – differentially expressed transcripts were not detected. NA – none applicable. Table 8. Гены, чья экспрессия изменялась более чем в 2 раза после 96 час инкубации в присутствии 3 nM уабаина Gene symbol FC Affymetrix ID 3 nM ouabain, fold of modulation/p value 30 nM MBG, fold of modulation/p value FOS TTR 7975779 33.28/8.84E-07 13.29/4.84E-06 ZFP36 TTR 8028652 20.36/9.39E-07 6.09/7.00E-06 EGR1 TTR 8108370 15.33/3.86E-05 21.43/6.11E-08 ADAMTS1 ENZ/IRR 8069676 13.04/8.84E-07 5.01/4.04E-04 PTGS2 ENZ/IIR 7922976 11.36/1.38E-06 9.02/4.46E-06 EGR2 TTR 7933872 8.09/9.39E-07 10.19/6.06E-07 ATF3 TTR 7909610 7.39/6.40E-06 8.13/5.14E-06 ARRDC4 UNK 7986350 5.62/2.45E-06 NC NR4A1 TTR/GDD/IIR 7955589 5.39/2.13E-05 7.29/3.30E-06 NR4A3 TTR/GDD/IIR 8156848 5.38/2.09E-05 6.00/5.25E-05 STC1 ENZ/IRR 8149825 5.35/4.84E-04 NC JUNB TTR 8026047 5.06/3.43E-06 1.53/5.87E-03 KLF4 TTR/GDD 8163002 4.70/3.66E-05 3.03/1.21E-04 DUSP1 ISG 8115831 4.52/3.32E-06 6.09/3.33E-05 ADAMTS5 ENZ/IIR 8069689 4.43/2.58E-05 2.16/2.01E-03 NR4A2 TTR/GDD/IIR 8055952 4.15/1.28E-04 2.99/4.56E-04 SNAI1 TTR 8063382 3.87/8.20E-06 NC HEY1 TTR 8151457 3.75/1.21E-05 1.84/9.12E-03 SOCS3 ISC/CYT 8018864 3.75/7.12E-06 NC VTRNA1-3 UNK 8108631 3.64/5.49E-05 2.76/3.12E-04 JUN TTR 7916609 3.17/6.40E-06 4.72/3.60E-05 KITLG CYT/GDD 7965322 3.05/3.99E-05 1.44/8.66E-03 C7orf53 UNK 8135532 3.00/6.76E-04 1.33/8.66E-03 EGR3 TTR 8149720 2.98/1.48E-04 3.07/3.09E-04 GDF15 GDD/IIR 8027002 2.98/9.39E-07 NC IDI2 ENZ 7931748 2.87/1.55E-03 NC BAMBI GDD 7926875 2.80/4.30E-04 1.29/1.68E-02 EFNB2 ISG/GDD 7972713 2.79/1.44E-05 1.52/6.33E-03 GEM ISG 8151816 2.77/6.90E-04 2.71/7.67E-04 ABCG2 TRP 8101675 2.76/2.27E-06 NC SNORD3A UNK 8005547 2.72/2.03E-05 NC FAM71A UNK 7909624 2.66/1.36E-04 1.70/4.02E-04 IER2 UNK 8026163 2.65/8.00E-05 1.54/9.03E-03 HIST2H2BE TTR 7919637 2.60/1.13E-04 1.67/7.66E-04 INSIG1 OTH 8137526 2.58/1.44E-05 1.25/9.33E-03 PROX1 UNK 7909681 2.52/2.45E-06 2.70/5.01E-04 HEY2 TTR 8121850 2.52/1.32E-04 2.07/9.81E-04 CA8 ENZ 8150978 2.50/1.28E-03 NC HIST1H1T TTR 8124402 2.48/7.76E-03 1.32/8.08E-03 TNFSF9 CYT/GDD 8025053 2.47/1.45E-04 3.71/9.91E-05 DLL4 GDD 7982854 2.46/1.30E-05 NC PTHLH GDD 7962000 2.39/8.00E-05 NC APOLD1 GDD 7954055 2.36/4.48E-04 NC GUCY1B3 ISG 8097973 2.34/1.01E-05 NC IGFBP5 GDD 8058857 2.28/8.16E-03 1.60/4.00E-03 SPRY4 ISG/GDD 8114797 2.28/2.56E-03 1.79/2.83E-03 BCL6 TTR/IIR 8092691 2.27/2.27E-06 NC HIST2H4A TTR 7905067 2.24/1.01E-04 1.88/4.31E-03 KCNJ2 TRP 8009502 2.24/8.00E-05 2.00/7.01E-04 TSC22D2 TTR 8083324 2.24/6.58E-05 NC DDIT3 TTR 7964460 2.23/1.06E-03 2.78/3.33E-04 C2orf61 UNK 8052004 2.23/1.61E-03 NC HIST1H2BG TTR 8124423 2.19/7.34E-03 NC HES1 TTR 8084880 2.19/2.45E-06 2.21/4.41E-04 ELMOD1 ISG 7943562 2.18/1.25E-04 NC MAFB TTR 8066266 2.16/9.95E-04 1.89/2.08E-03 HIST1H2BD TTR 8117382 2.13/2.18E-03 NC SNORD75 TTR 7922416 2.11/6.89E-04 -1.39/8.88E-03 ADAMTS9 ENZ 8088560 2.10/1.30E-05 2.09/7.51E-04 ADAMTS4 ENZ 7921821 2.09/2.67E-04 1.97/8.31E-04 KLF5 TTR 7969414 2.07/6.49E-04 1.62/1.51E-03 HIST2H2AA3 TTR 7905079 2.05/1.30E-04 NC NEFM OTH 8145361 2.04/6.82E-03 -1.25/6.77E-03 PCDH17 OTH 7969330 2.04/1.13E-04 NC TXNIP GDD 7904726 2.03/1.30E-05 2.22/6.89E-04 FJX1 UNK 7939365 2.03/2.41E-02 -1.33/9.38E-03 BHLHE40 TTR/GDD 8077441 2.03/1.80E-05 NC ID2 TTR 8040103 2.02/2.60E-03 1.73/2.21E-05 G0S2 GDD 7909441 2.02/3.87E-04 2.06/7.66E-05 IDI1 ENZ 7931754 2.01/1.39E-04 1.21/4.61E-03 MIRLET7C TTR 8067944 -2,03/3.36E-03 NC DTL GDD 7909568 -2.05/8.00E-05 NC KIAA1370 UNK 7988970 -2.07/4.94E-06 1.22/2.99E-03 FAM111B UNK 7940147 -2.18/2.72E-03 -1.59/2.27E-03 PDK4 ENZ 8141094 -2.32/4.18E-05 -1.48/8.72E-04 TRA2A TTR 8138592 -2.40/3.39E-04 NC EIF5 TTR 7977058 -2.52/6.54E-05 -2.59/4.72E-05 FBXO32 ENZ 8152703 -2.71/1.95E-04 -1.73/3.70E-04 FC – functional categories: CYT – cytokines; ENZ – non-classified enzymes; GDD – cell growth, differentiation and death; IIR – immune and inflammatory responses; ISG – intracellular signaling; OTH –others; TRP – transporters; TTR – transcription/translation regulators; UNK – function remains unknown.
2 1 января 2016 г.-31 января 2016 г. Кардиотонические стероиды как регуляторы транскрипции генов: идентификация относительной роли моновалентных катионов и кальция
Результаты этапа: В 2016 году в рамках данного проекта мы планировали осуществить идентификацию быстрореагирующих генов, вовлеченных в изменения транскриптома клеток эндотелия при действии кардиотонических стероидов (КТС), как первичных элементов Na+i,K+i-чувствительного сигнального каскада, с конечной целью проверки участия в этом процессе ионов кальция. Для решения этой задачи нами были использованы клетки эндотелия (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC, Lonza Walkersville, MD, USA), методы культивирования которой описаны нами ранее (1;2). С целью увеличения соотношения [Na+]i/[K+]i клетки инкубировали 30 мин, 1, 2 и 6 часов в присутствии 3 мкM уабаина. Нами было установлено, что в этом временном диапазоне уабаин не влияет на жизнеспособность HUVEC (2). Содержание внутриклеточного K+ и Na+ определяли по равновесному распределению 86Rb и 22Na (3-5). Методы выделения РНК и изучения изменений транскриптома с помощью технологии Affymetrix и GeneChip® Human Gene 1.0 ST array для транскриптов, кодируемых 28869 генами (Santa Clara, CA) описаны нами в предыдущих работах (1;6;7, см. файл Список цитируемой литературы). В этой серии экспериментов, нами были получены следующие результаты. Как видно из рисунка 1 (см. файл Рисунки), достоверное увеличение [Na+]i и потеря [K+]i наблюдаются уже через 30 мин после ингибирования Na+i,K+i-АТФазы уабаином, в то время как через 6 часов эти параметры изменялись в ~10 и 20 раз, соответственно. Мы обнаружили, что через 30 и 60 мин инкубации с уабаином изменяется содержание 54 и 19 транскриптов, соответственно (Таблица 1, см. файл Таблицы). Через 2 и 6 часов инкубации число транскриптов, чье содержание было изменено более чем на 20% (p<0.05), резко возрастало (685 and 8633 транскриптов, соответственно). Исходя из полученных данных, мы предложили следующую классификацию уабаин-чувствительных генов. К генам раннего ответа (еarly response genes, ERG) мы отнесли те гены, чью экспрессии была изменена через 30 и 60 мин более чем в 1.2 раза. Гены промежуточного ответа (intermediate response genes, IGR) мы классифицировали как гены, чья экспрессия была изменена более чем на 50% через 2 часа после добавления уабаина; по понятной причине в эту категорию не попадали ERG. Все остальные гены, обнаруживающие измененную экспрессию через 6 часов инкубации мы отнесли к генам позднего ответа (late response genes, LRG). Список этих генов приведен в таблицах 2-6. В другой серии экспериментов мы изучили кинетику действия уабаина на основные сигнальные каскады, вовлеченные в регуляцию транскрипции. С этой целью клетки лизировали в буфере, содержащим 150 мM NaCl, 1% Tритон X-100, 0,1% SDS, 2 мM ЭДТА, 2 мM ЭГТА, 25 мM HEPES (pH 7.5), 10% глицерол, 1 мM NaF, 200 мкM Na3VO4 и ингибиторы протеиназ. Разделение белков в полученных образцах проводили в полиакриламидном геле по методу Лэммли в присутствие SDS. Затем белки были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану (“Mini Trans-Blot”, Bio-Rad) и инкубировались в течение ночи при 4оС при с первичными антителами (Cell Signaling, Hornby, ON). После промывания и инкубации с вторичными антителами белки визуализировали с помощью набора хемилюминесценции (Santa Cruz Biotechnology). Репрезентативные блоты, полученные в этих экспериментах, представлены на рисунках 2 и 3. Мы не смогли обнаружить достоверного влияние уабаина на содержание МКК6, SERK1, фосфорилированной формы NFkB, в то время как увеличение фосфорилирования ERK, JNK и p38 MAPK выявлено через 6 часов инкубации, т.е. после изменения транскриптома клеток, связанного с экспрессией ERG и IGR. В отличие от перечисленных выше генов прирост фосфорилирования AKT и CREB прослеживался уже через 1 и 2 часа после добавления уабаина, соответственно. В этой связи мы сфокусируем последующие эксперименты на изучение роли этих двух элементах проведения сигнала в изменениях [Na+]i/[K+]i –чувствительного транскриптома и планируем опубликовать полученные результаты в конце 2017 года. Одновременно с приведенными выше исследованиями мы предприняли изучение роли кальция в увеличении содержания циклооксигеназы 2 типа (СОХ-2 или PTGS2 - одного из IGR, претерпевшего наиболее резкое увеличение экспрессии при действии уабаина (Таблица 3) на примере фибробластов легких человека. Мы показали, что как уабаин, так и другой КТС дигоксин увеличивают экспрессию СОХ-2, увеличивают активность РКА, оцениваемую по сдвигу подвижности ее субстрата VASP, и подавляют дифференцировку миофибробластов, оцениваемую по приросту содержания коллагена, фибронектина и гладкомышечного актина в ответ на добавление TGF-beta (Рис. 4). При сопоставлении влияния безкалиевой среды (Рис. 5), дозовой зависимости действия уабаина (Рис. 6), влияния ингибиторов потенциал-зависимых Са2+ каналов (никардипина) и Na+/Ca2+ обмена (соединение KB-R7943) (Рис. 7) на содержание внутриклеточного натрия и калия, вход кальция, экспрессию СОХ-2, активность РКА, содержания коллагена, фибронектина и гладкомышечного актина было установлено, что ингибирование дифференцировки миофибробластов опосредовано увеличением соотношения [Na+]i/[K+]i, и прирост [Ca2+]i за счет активации Na+/Ca2+ обмена. Тем не менее ни ингибитор СОХ-2 соединение NS-398, ни СОХ-2-siRNA не устраняли ингибирующее действие уабаина на дифференцировку миофибробластов в ответ на добавление TGF-beta1 (Рис. 8). Результаты этих исследований, опубликованные в American Journal Physiology – Lung & Respiratory Physiology (8), показали, что экспрессия СОХ-2 при действии уабаина опосредована активацией Na+/Ca2+ обмена и увеличением [Ca2+]i, не является достаточным условием подавления дифференцировки миофибробластов в ответ на добавление КТС.
3 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Кардиотонические стероиды как регуляторы транскрипции генов: идентификация относительной роли моновалентных катионов и кальция
Результаты этапа: Na+,K+-АТФаза осуществляет электрогенный обмен 3 ионов внутриклеточного Na+ на 2 иона внеклеточного К+, используя для транспорта энергию, освобождающуюся при гидролизе АТФ, и выполняя ключевую роль в регуляции внутриклеточной концентрации Na+ и K+, поддержании мембранного потенциала, объема клетки и сопряженного с Na+ транспорта аминокислот, глюкозы и других низкомолекулярных соединений. За последнее время появилось большое количество работ, свидетельствующих о том, что Na+,K+-ATФаза является рецептором кардиотонических стероидов (КТС), которые помимо ингибирования Na+-насоса инициируют сигнальные каскады, приводящие к активации фосфоинозитол-3 киназы, митоген-активируемых протеинкиназ, накоплению инозитол-3-фосфата и высвобождению внутриклеточного Са2+. В нашей лаборатории было установлено, что КТС вызывают экспрессию генов раннего ответа в присутствии хелаторов вне- и внутриклеточного кальция. На основании этих данных нами была сформулирована гипотеза о существовании нового Na+i,K+i-опосредованного, Ca2+i-независимого сигнального каскада, вовлеченного в регуляцию экспрессии генов. Данный проект направлен на исследование роли Na+i,K+i-опосредованного Ca2+i-независимого механизма проведения сигнала в изменениях транскриптома клеток эндотелия, вызванных уабаином и маринобуфагенином – двух представителей семейства КТС, обнаруженных у человека. В рамках данного проекта в 2015-2017 гг нами проведено несколько взаимосвязанных исследования, в которых были получены следующие результаты. Было показано, что механизм устойчивости к КТС клеток гладкой мускулатуры, эндотелия и астроцитов грызунов, связан с особенностями конформационных изменений α1-Na+,K+-АТФазы при ее взаимодействии с КТС, и не зависит от действия КТС на внутриклеточные концентрации Na+ и K+. Кроме того, был идентифицирован набор белков, взаимодействие которых с α1-Na+,K+-АТФазы человека индуцируется КТС. В клетках HUVEC был идентифицирован набор генов Na+i,K+i-чувствительных, экспрессия которых изменяется при увеличении соотношения внутриклеточных концентрации натрия и калия ([Na+]i/[K+]i) более чем на 20% при действии уабаина и маринобуфагенина. Также мы изучили роль кальция в увеличении содержания циклооксигеназы 2 типа (СОХ-2 или PTGS2). Мы показали, что в фибробластах легких человека наряду с резким возрастанием содержания СОХ-2 мРНК как уабаин, так дигоксин, увеличивают активность РКА и подавляют дифференцировку миофибробластов, оцениваемую по приросту содержания коллагена, фибронектина и гладкомышечного актина в ответ на добавление трансформирующего фактора роста TGF-β. Было установлено, что ингибирование дифференцировки миофибробластов опосредовано увеличением соотношения [Na+]i/[K+]i, и приростом [Ca2+]i за счет активации Na+/Ca2+ обмена. Мы также показали, что подавление дифференцировки миофибробластов КТС обусловлено резким уменьшением экспрессии одной из субъединиц TGF-β рецептора TGFR2. Нами были проведены первые исследования, направленные на идентификацию Са2+i-зависимой части Na+i,K+i-чувствительного транскриптома клеток эндотелия человека. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что диссипация трансмембранного градиента моновалентных катионов активирует Ptgs2 и Nr4a1 через прирост [Ca2+]i, опосредованный активацией никардипин-чувствительных Са2+ каналов L-типа, взаимодействием [Ca2+]i с СаМ и последующим фосфорилированием киназой CaMKII регулятора транскрипции CREB и дефосфорилированием кальцинеурином регулятора транскрипции NFAT, соответственно. В отличие от Ptgs2 и Nr4a1, мы не обнаружили влияния никардипина, антагонистов кальмодулина, а также ингибиторов CaMKII и кальцинеурина на прирост транскрипции Egr1 и Atf3 , индуцированный уабаином.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".