ИСТИНА

Проект направлен на решение актуальной задачи создания структур заданной архитектоники на основе биосовместимых и биорезорбируемых полимеров для тканевой инженерии и других биомедицинских целей. Для решения поставленной задачи использованы подходы, развиваемые в рамках нескольких научных дисциплин: физической химии, химии высокомолекулярных соединений, спектроскопии, материаловедения, регенеративной медицины. Предполагается получение биосовместимых матриксов путем вспенивания полилактидов и полилактогликолидов в сверхкритическом диоксиде углерода с одновременной импрегнацией полимеров молекулами спиновых и люминесцентных зондов. Использование зондовых методов позволит определить средние и локальные концентрации, а также установить характер распределения зондовых молекул в полимерных структурах на макро- и микроуровнях. Методом спинового зонда будут определены параметры подвижности молекул зондов и проанализированы релаксационные процессы в полученных матриксах. Кинетические характеристики деградации полимерных структур, а также транспорта молекул зондов из полимерных матриц в ходе их набухания и гидролиза in vitro будут измерены с помощью спектроскопии ЭПР и конфокальной флуоресцентной микроскопии. Будут выявлены цитотоксические эффекты матрицы с инкапсулированными зондами в условиях in vitro, и проведен морфологический анализ процессов биорезорбции и распределения зонда в месте имплантации на малых лабораторных животных. В результате выполнения проекта будут разработаны научные основы формирования матриксов для тканевой инженерии с использованием сверхкритического диоксида углерода.

The project is aimed at solving the actual problem of creating structures of a given architectonics based on biocompatible and bioresorbable polymers for tissue engineering and other biomedical purposes. To solve this problem, the approaches of several scientific disciplines: physical chemistry, chemistry of high-molecular compounds, spectroscopy, materials science, regenerative medicine, were applied. Obtaining of biocompatible matrixes basing on foaming polylactides and polylactoglycolides in supercritical carbon dioxide with simultaneous impregnation of polymers by molecules of spin and luminescent probes is expected. Using of probe methods allows to detemine mean and local concentrations, as well as distribution of probe molecules in polymer structures at macro and micro levels will be determined. The parameters of the mobility of probe molecules will be determined and the relaxation processes in the obtained matrixes will be analyzed by spin probe method. Kinetic characteristics of the degradation of polymer structures as well as transport of probe molecules from polymer matrices during their swelling and hydrolysis in vitro will be established using EPR spectroscopy and confocal fluorescence microscopy. Cytotoxic effects of the matrix with encapsulated probes will be revealed under in vitro conditions, and a morphological analysis of the bioresorption and probe distribution at the site of implantation in small laboratory animals will be performed. As a result of the project, the main principles of formation of matrixes for tissue engineering with the use of supercritical carbon dioxide will be developed.

1. Методика изготовления пористых матриксов для тканевой инженерии на основе D,L-полилактида с одновременной импрегнацией стабильными нитроксильными радикалами ТЕМПОН, 4-гидрокси-ТЕМПО-бензоат, а также флуоресцентным зондом SNARF™-4F 5-(и-6)-карбоксильная кислота. Механические свойства полученных материалов, параметры, характеризующие равномерность распределения парамагнитного или флуоресцентного вещества, характеристики релаксационных процессов, происходящих в полимере с течением времени, а также под действием паров воды и повышенных температур. 2. Кинетические закономерности транспорта парамагнитного вещества из пористой полимерной матрицы и пластин различной толщины в раствор фосфатного буфера с рН=7.4 при 37°С. 3. Динамика изменения подвижности введенных молекул в ходе набухания и гидролиза полимера. 4. Анализ цитотоксичности сформированных в среде скСО2 допированных зондами матриц в условиях in vitro.

Руководитель проекта академик РАН профессор В.В. Лунин одним из первых в нашей стране начал проводить исследования в области сверхкритических флюидов. Область его научных интересов охватывает широкий круг проблем, включая органический и неорганический синтез в сверхкритических флюидных средах, вопросы сверхкритической флюидной экстракции и хроматографии, получение новых, в том числе микронизированных форм биологически активных веществ и т.д. Научный коллектив имеет опыт работы по импрегнации полимерных материалов парамагнитными веществами в среде сверхкритического диоксида углерода. Проведена серия экспериментов по оптимизации параметров сверхкритического вспенивания D,L-полилактида, допированного стабильным нитроксильным радикалом ТЕМПОЛ. Члены научного коллектива имеют опыт использования метода спинового зонда для изучения структуры и динамики полимерных материалов. Получение информации о вращательной подвижности осуществляется с использованием современных компьютерных программ, в том числе разработанных членами научного коллектива.Участники проекта имеют большой опыт в области флуоресцентного биоимиджинга с использованием зондов, предназначенных для выявления молекулярных мишеней на поверхности клеток, оценки цитотоксичности материалов различного происхождения, разработки тканеинженерных конструкций; отработана процедура трансплантации матриксов различного происхождения и геометрии в организм животных. Результаты работы были опубликованы в ведущих мировых журналах, а также в виде глав в монографиях.

1. На примере таких полимеров как поли(D,L-лактид), поликарбонат, полиметилметакрилат и графт-сополимер N изопропилакриламида с олиголактидом показано, что применение метода ЭПР in situ позволяет охарактеризовать процессы импрегнации полимеров в сверхкритических флюидах на качественном и количественном уровне. Для решения этой задачи разработанный нами ранее реактор высокого давления был модифицирован для быстрого напуска сверхкритического лиоксида углерода (скСО2) или раствора спинового зонда в скСО2. Получены коэффициенты диффузии спинового зонда TEMPONE в набухших в скСО2 поли(D,L-лактиде), поликарбонате и полиметилметакрилате. 2. С использованием скСО2 получены пленки и пористые матриксы на основе D,L-полилактида (PDLLA), импрегнированные спиновыми зондами и спин-меченым диклофенаком. Материалы охарактеризованы методами сканирующей электронной микроскопии, нанотвердометрии, спектроскопии ЭПР. Клеточные тесты демонстрируют отсутствие токсического действия полученных материалов. 3. Использование спектроскопии ЭПР в рамках методики спинового зонда позволило не только определить содержание парамагнитного вещества в материалах на основе PDLLA на разных этапах его деградации in vitro, но и количественно оценить соотношение парамагнитных частиц, стабилизированных в полимерной матрице и м ёё находящихся в наполненных водным раствором порах. Показано, что аскорбиновая кислота, восстановительное действие которой является основной причиной гибели нитроксильных радикалов in vivo, практически не проникает внутрь полимерных матриксов. Основным фактором, который может вызывать снижение содержания нитроксида, является закисление областей внутри полимерной матрицы. 4. Для установления кинетических закономерностей высвобождения впервые применен метод количественного анализа зашумленных спектров ЭПР нитроксильных радикалов в водных средах, основанный на конволюции экспериментальных спектров со спектром той же системы «радикал – матрица», характеризующимся высоким отношением сигнал/шум. Этот подход позволяет определять количество радикалов, не превышающее 1012 – 1013 частиц. 5. На основании данных по деградации пленок PDLLA и высвобождению из них парамагнитных и оптических зондов, полученных с использованием комплекса спектральных данных и данных микроскопии, предложены физическая и математическая модели деградации алифатических полиэфиров в водной среде и высвобождения допантов. Форма кривых высвобождения низкомолекулярных веществ из PDLLA обусловлена изменением соотношения вкладов высвобождения допантов через поры, образующиеся и закрывающиеся на разных этапах и в разных протранственных зонах при гидролитической деградации полимера. Результаты моделирования применимы для предсказания кинетических профилей высвобождения низкомолекулярных веществ из пленок PDLLA различной формы. 6. Обнаружено, что процессы набухания и порообразования в системах «спиновый зонд TEMPONE/питательная среда/клеточные сфероиды» и «TEMPONE/питательная среда» происходят медленнее, чем в системе «TEMPOL/PBS». 7. На примере биополимерных матриксов: аэрогелей на основе альгината натрия и желатина показано, что анализ формы спектров ЭПР парамагнитного зонда TEMPONE в сухом полимере и в присутствии паров воды может служить основой для определения чувствительности этих полимеров к влажности воздуха, а также позволяет судить о степени деградации сшитых биополимеров.