![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Исследование возможности использования рекомбинантных химерных антител к сердечной изоформе Тропонина I для создания надежных систем диагностики инфаркта миокарда.
Recombinant chimeric antibodies to cardiac isoform of troponin I will be obtained and utilized for construction of high;y sensistive and reliable methods for detection of cardiac troponin I in serum
В ходе выполнения работы будет проведено секвенирование вариабельных доменов различных моноклональных антител, специфичных к сердечной изоформе тропонина I человека. Будет проведена ПЦР-амплификация генов вариабельных доменов выбранных антител. Будет проведено секвенирование полученных ПЦР-фрагментов. На основе полученных последовательностей будут созданы молекулярно-генетические конструкции для экспрессии отобранных иммуноглобулинов в полноразмерном формате. В качестве константных доменов при создании химерных антител будут использованы домены иммуноглобулинов изотипа IgG1 человека. Экспрессия рекомбинантных иммуноглобулинов будет проведена в клетках млекопитающих. Очистка рекомбинантных антител будет проведена с использование хроматографии на белок-А сефарозе.
С использованием рекомбинантных химерных антител были разработаны иммунохимические системы для определения концентрации сердечной изоформы тропонина I в крови человека. Полученные данные о высокой чувствительности, специфичности и отсутствии влияния интерференции антител человека, специфичных к мышиным иммуноглобулинам, дают основание для дальнейшего получения рекомбинантных химерных антител и разработки иммунохимических систем для определения концентрации сердечной изоформы тропонина I на их основе.
В ходе работы были отобраны моноклональные антитела, специфичные к сердечной изоформе тропонина I человека. На их основе был получен набор рекомбинантных химерных антител. Была показана возможность экспрессии рекомбинантных химерных антител в линиях клеток млекопитающих. В ходе выполнения работы были разработаны иммунохимические системамы для определения концентрации сердечной изоформы Тропонина I в крови человека. Была показана высокая чувствительность и специфичность разработанных иммунохимических систем. Данные свойства разработанных систем, а также отсутствие влияния интерференции антител человека, специфичных к мышиным иммуноглобулинам, позволяют сделать вывод о возможности и преимуществах использования рекомбинантных химерных антител к сердечной изоформе Тропонина I в системах диагностики инфаркта миокарда.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Молекулярные механизмы функциональной регуляции клеточной активности |
Результаты этапа: Протеолитические фрагменты белка IGFBP-4, обнаруженные и охарактеризованные в нашей лаборатории, являются перспективными биомаркерами риска осложнений сердечно-сосудистых заболеваний. С целью создания надежных систем количественного определения фрагментов белка IGFBP-4 в крови больных с острым коронарным синдромом проводится изучение иммунохимических и биохимических свойств фрагментов. В течение отчетного периода из ЭДТА-плазмы крови индивидуальных больных с острым коронарным синдромом были выделены эндогенный IGFBP-4 и его фрагменты. Для этой цели была использована аффинная хроматография с использованием специфических моноклональных антител клонов IBP144, IBP180, IBP182, IBP185 и IBP190, иммобилизованных на CL-4B сефарозе. Использование широкого набора моноклональных антител позволило получить максимально полный спектр эндогенных фрагментов IGFBP-4, находящихся в плазме крови индивидуальных больных с острым коронарным синдромом. Эндогенный IGFBP-4 и его фрагменты были выделены из плазмы крови двенадцати пациентов. Анализ полученных препаратов методом иммуноблоттинга с использованием специфических моноклональных антител клона IBP180 показал, что доля гликозилированного N-концевого фрагмента (NT-IGFBP-4) с молекулярной массой 18 кДа в общем пуле NT-IGFBP-4 составляет 9,8-23,5%, тогда как доля гликозилированного IGFBP-4 (30 кДа) составляет 47,2-61,7%. Полученный результат свидетельствует о значительно сниженном уровне протеолитического расщепления гликозилированной формы IGFBP-4 в кровотоке. Таким образом, гликозилирование было выявлено в качестве фактора, регулирующего активность специфических протеаз, субстратом которых является IGFBP-4. Гликозилированные формы эндогенного IGFBP-4 и его фрагментов были очищены из плазмы с использование конканавалин-А сефарозы. Полученные очищенные препараты были использованы для сравнения скоростей расщепления гликозилированной и не гликозилированной форм IGFBP-4 под действием протеазы PAPP-A. С использованием флуороиммунных систем специфической детекции фрагментов IGFBP-4 было показано, что скорость расщепления гликозилированной формы IGFBP-4 в 3-4 раза ниже, чем не гликозилированной. Эти результаты находятся в полном соответствии с результатами, полученными при изучении соотношения гликозилированной и не гликозилированной форм IGFBP-4 и NT-IGFBP-4 в образцах плазмы крови индивидуальных больных. С использованием эндогенного IGFBP-4 было показано, что ферментативная активность рекомбинантной и эндогенной форм протеаз РАРР-А, а также константы Михаэлиса обеих форм фермента по отношению к IGFBP-4 не различаются. Исследование фрагментов белка IGFBP-4 с использованием моноклональных антител, специфичных к центральным частям молекул, а также к протеолитическим неоэпитопам данных фрагментов, показало отсутствие деградации концевых частей фрагментов. Нативное состояние концевых частей фрагментов IGFBP-4 позволяет проводить точное количественное определение их концентрации в плазме крови и, соответственно, делает их надежным инструментом для исследования активности протеазы PAPP-A. Масс-спектрометрический анализ подтвердил наличие фрагментов IGFBP-4 в плазме крови, а также позволил впервые обнаружить наличие гликозилированной формы NT-IGFBP-4 в плазме крови человека. Было показано, что уровень протеолитического расщепления гликозилированной формы IGFBP-4 в кровотоке под действием специфической протеазы PAPP-A значительно снижен. Обнаруженное отсутствие деградации концевых частей фрагментов IGFBP-4 позволяет проводить точное количественное определение их концентрации в плазме крови. Было подтверждено наличие фрагментов IGFBP-4, а также обнаружена гликозилированная форма NT-IGFBP-4 в плазме крови человека. | ||
2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Молекулярные механизмы функциональной регуляции клеточной активности |
Результаты этапа: Протеолитические фрагменты белка IGFBP4, обнаруживаемые в кровотоке, являются перспективными биомаркерами риска осложнений сердечно-сосудистых заболеваний. Изучение гликозилирования фрагментов белка IGFBP4 в крови больных с острым коронарным синдромом позволит создать надежные системы количественного определения фрагментов. В течение отчетного периода было проведено исследование иммунохимических и биохимических свойств эндогенного IGFBP-4 и его фрагментов, выделенных из ЭДТА-плазмы крови индивидуальных больных с острым коронарным синдромом. Для этой цели была использована аффинная хроматография с использованием специфических моноклональных антител, иммобилизованных на CL-4B сефарозе. Разделение гликозилированных и негликозилированных фракций эндогенного IGFBP-4 и его фрагментов было проведено с использование конканавалин-А сефарозы. Для исследования влияния гликозилирования эндогенного N-концевого фрагмента IGBFP-4 человека на взаимодействие со специфическими моноклональными антителами проведено сравнение данного взаимодействия с рекомбинантным NT-IGFBP-4 и полноразмерным IGFBP-4. Моноклональное антитело IBP180 является ключевым инструментом количественного определения концентрации NT-IGFBP-4 и полноразмерного IGFBP-4. Эпитоп антитела IBP180 включает в себя аминокислотные остатки 108-122 и, таким образом, находится в непосредственной близости от единственного сайта гликозилирования IGFBP-4 (Asn104). Ранее в нашей лаборатории было выяснено, что у большинства больных с острым коронарным синдромом обнаруживается фракция гликозилированного NT-IGFBP-4. В течение отчетного периода было показано, что моноклональное антитело IBP180 с одинаковой эффективностью распознает гликозилированный и негликозилированный IGFBP-4, а также гликозилированный и негликозилированный NT-IGFBP-4. Отличий во взаимодействии антитела IBP180 с эндогенными и рекомбинантными белками также выявлено не было. Отсутствие влияния гликозилирования IGFBP-4 и NT-IGFBP-4 на взаимодействие со специфическими моноклональными антителами было показано в методе Вестерн-блоттинга, а также в иммунофлуресцентном анализе сэндвич-типа. Таким образом, было показано, что гликозилированная и негликозилированная формы IGFBP-4 и NT-IGFBP-4 в крови могут достоверно определяться иммунохимическими методами. При расщеплении гликозилированного IGFBP-4 под действием протеазы РАРР-А гликан остается на N-концевом протеолитическом фрагменте. Исследование гликозилирования эндогенного NT-IGFBP-4 было проведено с использованием масс-спектрометрии. Помимо пика с m/z 14615, соответствующего однозаряженному иону немодифицированной формы N-концевого фрагмента IGFBP-4 1-135 (с Марр 18 кДа), на масс-спектре NT-IGFBP-4 был зарегистрирован минорный пик с m/z 17260. NT-IGFBP-4 (1-135) с молекулярной массой 17260 Да может содержать полисахарид с массой 2622 Да с составом мономеров Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3(Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-2(Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6)Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc или же сиалосодержащий полисахарид с массой 2619 Да состава (Hex)4(HexNAc)1(Deoxyhexose)2(NeuAc)2 (Man)3(GlcNAc)2. Была проведена обработка тотального препарата IGFBP-4 дегликозилазой PNGase F, способной отщеплять полисахариды, присоединенные к полипептиду по N-типу через амидную группу аспарагина. При этом дегликозилированию подвергались форма NT-IGFBP-4 с кажущейся молекулярной массой 18 кДа и форма IGFBP-4 с массой 30 кДа. В состав гликана NT-IGFBP-4 с массой 17260 Да (соответствует форме NT-IGFBP-4 с кажущейся молекулярной массой 18 кДа) могут входить два остатка N-ацетилнейраминовой кислоты. В этом случае модифицирующий полисахарид должен обладать отрицательным зарядом. При отщеплении двух отрицательно заряженных остатков, содержащих карбоксильные группы, теоретическое значение pI молекулы NT-IGFBP-4 увеличится с 5,86 до 6,32 при незначительном изменении молекулярной массы (около 0,6 кДа). Чтобы установить, действительно ли в составе гликозилированного NT-IGFBP-4 имеются сиаловые кислоты, препарат эндогенного гликозилированного NT-IGFBP-4 обрабатывали α2-3,6,8-нейраминидазой с последующим электрофорезом в присутствии мочевины и без додецилсульфата натрия. Как видно, после обработки гликозилированного NT-IGFBP-4 α2-3,6,8-нейраминидазой его электрофоретическая подвижность уменьшается. При проведении электрофореза в присутствии мочевины без додецилсульфата натрия подвижность белка обусловлена его размером и его зарядом. При отщеплении двух остатков N-ацетилнейраминовой кислоты молекулярная масса белка изменяется незначительно, а заряд изменяется в положительную сторону. Этим объясняется уменьшение электрофоретической подвижности гликозилированного NT-IGFBP-4 при его обработке α2-3,6,8-нейраминидазой. Таким образом, было показано, что в составе полисахарида NT-IGFBP-4 присутствует N-ацетилнейраминовая (сиаловая) кислота. Таким образом, было показано, что гликозилирование IGFBP-4 и NT-IGFBP-4 не влияет на взаимодействие со специфическими моноклональными антителами, и, следовательно, гликозилированная и негликозилированная формы IGFBP-4 и NT-IGFBP-4 в крови могут достоверно определяться иммунохимическими методами. Было показано, что в составе полисахарида эндогенного NT-IGFBP-4 присутствует N-ацетилнейраминовая (сиаловая) кислота. | ||
3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Молекулярные механизмы функциональной регуляции клеточной активности |
Результаты этапа: Протеолитические фрагменты белка IGFBP4, обнаруживаемые в кровотоке, являются перспективными биомаркерами риска осложнений сердечно-сосудистых заболеваний. Изучение фрагментов белка IGFBP4 в крови больных с острой сердечной недостаточностью позволит определить прогностическую ценность этих новых биомаркеров для данной группы больных. В течение отчетного периода было проведено определение концентрации фрагментов IGFBP-4 в ЭДТА-плазме крови индивидуальных больных с острой сердечной недостаточностью. Было показано, что фрагменты IGFBP-4 ассоциированы с повышенным риском смертности у больных с острой сердечной недостаточностью. Фрагменты IGFBP-4 могут использоваться в качестве биомаркеров для выявления больных с острой сердечной недостаточностью, для которых повышен риск осложнений и смертности. | ||
4 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Молекулярные механизмы функциональной регуляции клеточной активности |
Результаты этапа: В ходе работы были отобраны моноклональные антитела, специфичные к сердечной изоформе тропонина I человека. На их основе был получен набор рекомбинантных химерных антител. Была показана возможность экспрессии рекомбинантных химерных антител в линиях клеток млекопитающих. В ходе выполнения работы были разработаны иммунохимические системамы для определения концентрации сердечной изоформы Тропонина I в крови человека. Была показана высокая чувствительность и специфичность разработанных иммунохимических систем. Данные свойства разработанных систем, а также отсутствие влияния интерференции антител человека, специфичных к мышиным иммуноглобулинам, позволяют сделать вывод о возможности и преимуществах использования рекомбинантных химерных антител к сердечной изоформе Тропонина I в системах диагностики инфаркта миокарда. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".