ИСТИНА

В рамках темы будут исследоваться физиолого-биохимические цитологические и генетических особенностей грибов из разных эколого-трофических групп. Будут получены новые данные о составе и функциональных механизмах приспособления грибов экстремальных местообитаний; новые сведения о генетике и метаболических возможностях грибов в том числе дереворазрушающих и используемых в фармацевтических целях; будут изучаться механизмы старения грибной клетки с использованием модельных аско- и базидиальных грибов; создана коллекция грибов-экстремофиллов и штаммов перспективных для биотехнологии

In the framework of the theme the physiological, biochemical, cytological and genetic characteristics of fungi of various ecologo-trophic groups that will be explored. New data of the composition and functional mechanisms of adaptation of fungi to extreme habitats wiil be obtained. The new information about the genetics and metabolic capabilities of fungi including of wood-destroying species and fungi used in pharmaceutical purposes will be discovered. The aging mechanisms of fungal cells using as model ascomycetes and basidiomycetes species will be examined and the collection of fungi-extremophiles and strains perspective for biotechnology will be created.

Будут получены данные о грибных сообществах в различных компонентах наземных и водных экосистем, включая экстремальные местообитания. Изучены изменения в составе цитозоля и мембран, особенностях жизненного цикла, ультраструкты клеток и органелл (митохондрий), физиологии, внеклеточного ферментного комплекса и генома грибов разных эколого-трофических групп и при различных воздействиях. Это позволит глубже понять механизмы приспособления грибов к экстремальным местообитаниям, взаимодействий с другими организмами; новые сведения о генетике и метаболических возможностях грибов в том числе дереворазрушающих будут актуальными для разработки препаратов для биотехнологии и медицины. Определены перспективные маркеры для изучения старения грибной клетки, получены новые данные о феномене длительного существования грибов в растущем состоянии и старении грибов. Создана коллекция грибов-экстремофилов и штаммов перспективных для биотехнологии и фитопатологии, разработаны современные новые приемы идентификации и мониторинга грибов, важных для устойчивого развития растениеводства.

Коллектив обладает оригинальными подходами, подобранными средами и схемами выделения грибов, включая экстремофильные, сапротрофные и фитопатогенные виды, из различных компонентов экосистем. Освоены и разработаны собственные приемы для идентификации грибов, включая молекулярно-генетические, накоплен большой опыт проведения скрининга активных продуцентов ферментов и антибиотиков. Отработана схема выяснения биохимических реакций (по изменению состава цитозоля и липидов мембран, ферментативной активности, спектра ферментов) и ряда других характеристик грибов на воздействие экстремальных значений рН, концентрации соли и других факторов среды. Есть и постоянно расширяется уникальная коллекции штаммов грибов, включающая представителей разных эколого-физиологических групп и новых видов (открытых сотрудниками кафедры) алкалофильных и алкалотолерантных грибов. Данные таксоны пока отсутствуют в мировых коллекциях и исследование физиолого-биохимических свойств, выявление у них метаболитов, важных для биотехнологий имеет приоритетное значение. Получены важные данные о составе грибных сообществ в наземных экосистемах и экофизиологии грибов разных таксономических групп, продукции ими протеаз, антибиотических соединений. Это позволяет проводить в дальнейшем сравнительные исследования с микобиотой водных экосистем, прибрежных зон, глубже понять особенности состава грибов в разных экотопах и успешнее вести поиск нужных продуцентов для биотехнологий и медицины.

Исследование микобиоты в наземных и водных экосистемах, с акцентом на экстремальные экотопы. Их цель – изучение таксономического разнообразия и взаимодействий грибов с другими организмами, их экофизиологии, биохимических и морфологических механизмов адаптации, жизненные циклов, участия в деструкции органических веществ и синтезе биологически активных соединений, генетических и ультаструктурных особенностей, механизмов старения и выхода на возможности практического применения представителей грибного царста. 1. Алкалофильные и алкалотолерантные грибы из разных регионов мира 1.1 Биоразнообразие и филогения. Исследованы грибы в уникальных природных местообитаниях - засоленных и щелочных почвах (содовых солончаках) России (побережья озер в степях Западной и Южной Сибири), Монголии, Кении (оз. Магади), Казахстане, Армении. Более 150 образцов почв содово-сульфатного, содово-хлоридного, содово-сульфатно-хлоридного и содового засолений со значениями рН 7.1 - 11.5, и суммой растворимых солей от 0.2 до 385.0 г/кг было проанализировано с использованием селективной щелочной среды. Также изучены нейтральные окультуренные почвы Москвы и Подмосковья, побережья (песчаные грунты) морей (Белого, Балтийского, Баренцева, Японского), образцы прибрежной зоны Шпицбергена, гиперсоленые нейтральные почвы побережья оз. Баскунчак (Астраханская обл.), оз. Эльтон и Булухта (Волгоградская обл.), почвы побережья некоторых засоленных озер Забайкалья. Общее число исследованных образцов превышало 400. Филогенетический анализ, проведенный на основе секвенирования участков ITS, LSU рДНК, SSU рДНК, TEF-1alpha, b-tubulin, RPB2, показал полифилетичность группы алкалофильных/толерантных грибов. Устойчивость к щелочным условиям эволюционно неоднократно возникала у разных групп аскомицетовых грибов. Щелочеустойчивые грибы представлены среди аскомицетов, преимущественно в сем. Plectosphaerellaceae, Chaetomiaceae, Myrotheciomycetaceae и Pleosporaceae. 1.2 Новые таксоны. Описаны, проиллюстрированы и опубликованы новые для науки таксоны аскомицетов: 2 рода Sodiomyces, Chordomyces; новая секция – Alternaria sect. Soda; 8 новых видов - Sodiomyces alkalinus, S. magadiensis, S. tronii; Emericellopsis alkalina, Chordomyces antarcticus, Alternaria kulundii, A. petuchovskii, A.shukurtuzii. 1.3. Особенности экофизиологии: отношение к фактору рН, концентрации хлористого натрия, температуре. В щелочных почвах присутствуют грибы с разными типами адаптации к фактору рН. Анализ кривых роста грибов в диапазоне значений рН от 4 до 11 позволил выделить группы алкалофилов (облигатных и факультативных) и алкалотолерантов (сильных, умеренных и слабых). Предложена схема определения типа адаптации к фактору рН. Обнаружено и доказано явление алкалофилии у грибов. Обнаружен и подтвержден облигатно алкалофильный тип адаптации у видов рода Sodiomyces – S. alkalinus, S. magadiensis и S. tronii. Оптимальными для роста были значения рН выше 8. По характеру кривых зависимости скорости роста алкалофильных грибов от концентраций NaCl в среде их можно отнести к галотолерантам. Галофильных грибов, требующих для роста определенных концентраций солей, нами найдено не было. Отношение к температуре отличалось у изолятов грибов разных регионов. Особенно наглядно это было показано для Sodiomyces spp. Наиболее жарким из всех исследованных местообитаний было побережье оз. Магади. Оптимум роста у S. tronii и S. magadiensis, изолированных с побережья озера, отмечен при 32 °C, для всех изолятов S. alkalinus (изоляты с побережий озер Западной Сибири, Забайкалья, Монголии, Танзании) оптимальной была температура около 28°C. 1.4. Особенности жизненных циклов и морфологии. Описан Sodiomyces – тип развития половой стадии, свидетельствующий о приспособлении к обитанию на побережье содовых озер и имеющий конвергентное сходство с клейстотециальными морскими грибами и с обитателями затапливаемых субстратов. Показано сходство морфологических признаков исследованных алкалофильных и алкалотолерантных грибов  для представителей Plectosphaerellaceae и Myrotheciomycetaceae характерно acremonium-, verticillium-, gliocladium–подобное конидиальное спороношение, с обильным образованием слизи при бесполом и половом спороношении, с агрегацией мицелия в тяжи, склеенные слизью, плодовые тела замкнутые. Для Pleosporaceae  наличие хламидоспор или микросклероциев, которые могут прорастать конидиями. 1.5. Механизмы адаптации щелочеустойчивых грибов к фактору рН: исследование динамики углеводов цитозоля, мембранных и запасных липидов у алкалофильных и алкалотолерантных грибов в ответ на изменение внешнего рН. Впервые показано, что ответ на изменение внешнего рН у алкалофильных и алкалотолерантных грибов различается. У алкалофилов большую роль играет трегалоза, высокий уровень которой наблюдается на всех стадиях роста при различных рН, в щелочных условиях характерна аккумуляция маннита и арабита. У алкалотолерантов ответ на изменение pH происходит только за счет изменения соотношения арабита и маннита, при этом маннит доминирует в нейтральных и кислых условиях, а арабит – в щелочных. В трофофазе у алкалофильного гриба S. tronii, в составе мембранных липидов доминируют небислойные фосфолипиды - фосфатидные кислоты, а в ответ на снижение рН среды существенно возрастает доля стеринов и сфинголипидов, что указывает на образование рафтов. 1.6. Распространение и экология. Щелочеустойчивые грибы обнаружены нами практически во всех исследованных регионах. Факультативные алкалофилы и алкалотолеранты распространены достаточно широко и входят в разные эколого-трофические группы. Облигатные алкалофилы колонизирует специфические ниши. Они имеют локальное распространение и приурочены к местам сильного содового засоления. Реконструкция эволюции ферментов показала, что растительные остатки, представляющие основной субстрат для большинства видов грибов, не являются предпочтительными для S. alkalinus. Грибы морских грунтов: физиология и таксономия. Проведен комплексный анализ микобиоты арктических морей России – Белого, Лаптевых, Восточно-Сибирского и Карского, от глубин 5-10 м до 200 м и более. Подтверждено присутствие грибов во всех изученных морских субстратах – как в пелагиали в качестве ассоциантов с фитопланктоном, так и в донных осадках в виде активно развивающегося мицелия, в том числе в области метановых сипов и на глубинах до 3000 м. Детальное изучение проведено видового состава микроскопических грибов Белого моря. - от литорали до глубоководных грунтов. Выявлены виды, активно функционирующие в грунтах, на органических субстратах (крахмале, целлюлозе, хитине, кусочках таллома ламинарии), они растут на средах с морской водой, при низких температурах и при разном уровне обеспеченности кислородом. В эту группу входят Paradendryphiella salina, Acremonium tubakii, A. potronii, Pseudeurotium hygrophilum, Pseudogymnoascus pannorum, Emericellopsis sphaerospora, Oidiodendron periconioides, Parengyodontium album, Lecanicillium muscarium, виды Tolypocladium и Sarocladium. 3.Грибы в донных грунтах озера Байкал. Проведен отбор проб донных грунтов озера Байкал и получены первые детальные данные о видовом разнообразии микобиоты этих экотопов и пуле грибной биомассы. Изоляты были идентифицированы по культурально-морфологическим и генетическим признакам. Дан анализ распространения видов по глубинам. Разнообразие грибов, выделенных из озера Байкал, превышает 80 видов. 4.Грибы в торфяниках болот северных регионов. Исследована структура комплексов, проведен таксономический анализ по морфолого-культуральным и генетическим признакам грибов в заболачивающихся прибеломорских водоемах, в торфяниках мерзлотных залежей Кольского п-ва и Республики Коми, подзона крайней северной тайги. Проведены эксперименты по изучению физиологии аcremonium-подобных видов. 5. В рамках программы экспериментов проведена работа по изучению влияния условий открытого космоса на жизнеспособность микромицетов (на космическом аппарате (КА) Фотон-4 М на 20 видах грибов из 14 родов, выделенных из строительных материалов на минеральной основе и агенты биоповреждений промышленных материалов). 6. Взаимодействие и состав микроводорослей и бактерий в плодовых телах ксилотрофных грибов. Исследование плодовых тел нескольких видов ксилотрофных базидиальных грибов показало высокое разнообразие водорослей (зеленые, эвгленовые и сине-зеленые), а также бактерий в тканях плодового тела. В них обнаружены не только фотосинтезирующие про- и эукариотические организмы, но и бактерии. Основные взаимодействующие партнеры (зеленые водоросли, цианобактерии и гифы грибов) способны к образованию обильных слизистых чехлов, предохраняющих клетки от высыхания и создающих питательную среду обитания для гетеротрофных организмов. 7.Азотное питание и дыхание грибов. На ксилотрофном и гумусовом сапротрофе впервые проведено сравнительное исследование функциональной роли основного и альтернативного дыхания в условиях голодания по азоту. Продемонстрировано преимущественное функционирование альтернативной дыхательной цепи (альтернативной цитохромоксидазы) у ксилотрофного гриба Stereum hirsutum в сравнении с гумусовым сапротрофом Coprinus comatus, у которого активно функционируют два пути транспорта электронов. Разработана тест-система, включающая две митохондриальные флуоресцентные пробы и протонный разобщитель, позволяющая эффективно метить митохондрии на флуоресцентно-микроскопическом уровне и анализировать их поляризованность, что впервые приблизило качественный уровень исследований митохондрий грибов к уровню работы с животными клетками. С помощью этой тест-системы подтверждено наличие у ксилотрофных базидиомицетов сверхдлинных (длиной до 100 мкм и более), нитевидно-сосудовидных разветвленных митохондрий, тянущихся вдоль гиф. Сверхдлинные митохондрии ксилотрофных базидиомицетов являются приспособлением к существованию данных грибов на лигно-целлюлозном субстрате, с крайне низким содержанием азота. На основе лабораторных опытов предложена модель псевдопоискового роста древоразрушающих грибов в условиях дефицита азота. 8. Механизмы старения грибов. Разработана методика иммунного дот-блотинга, что позволило установить особенности влияния оксидативных агентов на накопление карбонилированных белков (маркеров старения) в грибном мицелии. Считается, что при воздействии оксидативных агентов на живые организмы содержание маркеров гипероксидации должны быть выше. Однако для грибов, что при определенных условиях картина может быть прямо противоположной. Грибы очищают свои клетки от маркерных молекул в ответ на оксидативное воздействие. 9. Впервые продемонстрировано существование нескольких путей эндоцитоза у мицелиальных базидиомицетных грибов: микропиноцитоза (размер везикул до 20 нм) и макропиноцитоза (размер поглощенных везикул от 20-200 нм). Классический микропиноцитозный путь включает инвагинацию плазматической мембраны, формирование везикул, ранних и поздних эндосом, и деградацию поглощенного «груза» в вакуолях, либо возврат (рециклинг) компонентов плазмалеммы. Начальные этапы этого пути на структурном уровне можно наблюдать с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Эндоцитоз может идти по макропиноцитозному пути, когда происходит захват более крупных полимерных молекул, которые могут транспортироваться в эндосомах к вакуолям грибной клетки, где происходит их гидролиз до мономеров. Присутствие макропиноцитозного пути поглощения у грибов изменило в корне наши представления об исключительно внеклеточном пищеварении у грибов. 10.Впервые изучена ультраструктура биолюминесцентных видов грибов в динамике свечения (минимум и максимум) методом трансмиссионной электронной микроскопии. Сравнение с небиолюминесцентными родственными видами грибов показало, что доля клеток, содержащих мембранные структуры, напоминающие миелиноподобные тела в клетках животных, увеличивается на 13-35 % для светящихся грибов и уменьшается на 6-30 % для небиолюминесцентных видов, что может свидетельствовать о локализации биолюминесцентной ферментной системы в этих мембранах. 11. Эволюционный эксперимент длительному непрерывному культивированию Podospora anserina. Это аскомицетный гриб, проявляющий выраженное фенотипическое старение при росте на твердой среде, но обладающий неограниченной продолжительностью жизни в условиях погруженного культивирования (к настоящему времени 8,5 лет).. В течение первых 4 лет эксперимента 125 однонуклеотидных замен и 23 коротких зафиксировались в геномах восьми независимо эволюционирующих популяций. Шесть белков, которые влияют на рост и развитие гриба, подверглись эволюции более, чем в одной популяции. Данная тенденция проявилась в случае альфа-субъединицы G-белка FadA – новые аллели соответствующего гена закрепились в семи из восьми экспериментальных популяций. Эти замены затронули четыре аминокислотных остатка, что является беспрецедентно высоким уровнем параллелизма, который когда-либо был выявлен в условиях экспериментальной эволюции. Параллельная эволюция на уровне генов и метаболических путей, избыток нонсенс- и миссенс-мутаций, а также повешенная консервативность белков и их сайтов, в которых произошли изменения, позволяют предположить, что многие из обнаруженных замен адаптивны и обусловлены положительным отбором. 12.Коллекции грибов. Создана коллекция грибов из экстремальных местообитаний, которая включает 353 штамма, из которых 150 хранится в условиях криоконсервациии и полностью каталогизированы.Значительно (на 75 штаммов) расширена коллекция культивируемых базидиомицетов, перспективных для использования в пищевых и медицинских целях. Для криоконсервации при первичной закладке нового штамма концентрация глицерина должна быть 5 и 30%, что позволит минимизировать риск потери штамма. Затем, в случае длительного хранения штамма, необходим подбор оптимальной концентрации глицерина. 13. Поиск новых продуцентов и метаболитов грибов. Обнаружен и охарактеризован новый пептаибол, названный эмерициллипсином А, синтезируемый алкалофильным изолятом Emericellopsis alkalina. Эмерициллиписин А - линейный пептид, образует альфа-спираль и содержит 9 аминокислотных остатков. Он является новым антимикробным пептидом, проявляющим активность по отношению к плесневым и дрожжевым грибам. У морских изолятов рода Tolypocladium (T. cylindrosporum, T. inflatum) впервые установлена продукция циклоспоринов. Отобраны штаммы Sodiomyces alkalinus и Chordomyces antarcticum, способные продуцировать внеклеточные алкалостабильные протеазы, активные не только в щелочных условиях (рН 10-11), но и 30%-ном содержании хлорида натрия, воздействии ионного (SDS) или неионного (Triton-100) детергентов, добавке в реакционную среду перекиси водорода, коммерческого детергента Ariel и жидкого пятновыводителя Vanish Oxi Action, что указывает на их перспективность для практического применения. Изучены особенности циклов развития и формирования базидиом у 8-х видов базидиальных макромицетов, перспективных в пищевых и медицинских целях.