|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Исследование механизмов старения и тестирование геропротекторов или геропромоторов в экспериментах на клеточных культурах и клетках зародышевого путиНИР
The study of aging mechanisms and testing geroprotectors or geropromoters in experiments with cell cultures and cells of germ-line
- Руководитель НИР: Хохлов А.Н.
- Участники НИР: Белоконь Е.Е., Винькова Е.Н., Захидов С.Т., Клебанов А.А., Колесников А.В., Моргунова Г.В., Муджири Н.М., Прохоров Л.Ю., Сизов А.Д.
- Подразделение: Сектор эволюционной цитогеронтологии
- Срок исполнения: 1 января 2016 г. - 31 декабря 2020 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 31-1-16
- Номер ЦИТИС: АААА-А16-116021660098-8
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Физиологические механизмы деятельности, развития и устойчивости организма человека и животных
- Приоритеты и перспективы НТР Российской Федерации согласно Стратегии НТР РФ: переход к высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
- Критическая технология России: Клеточные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.19.05 Методы и аппаратура в цитологии
- 34.03.27 Биология старения
- 34.19.19 Цитофизиология
- 34.19.21 Особенности поведения клеток в культуре
- 34.21.15 Половые клетки и оплодотворение
- Классификатор OECD: Цитология, Геронтология, Биология развития
-
Ключевые слова:
развитие, клеточные культуры, половые клетки, днк, старение, жизнеспособность клеток
development, germ cells, cell culture, aging, cell viability, dna -
Описание:
Планируется провести на цитогеронтологической модели "стационарного старения" сравнительные исследования нескольких групп методов определения жизнеспособности культивируемых клеток и способов подсчета живых клеток; использовать несколько красителей (трипановый синий, метиленовый синий, нейтральный красный, MTT и родамин 123). Предполагается продолжить усовершенствование метода оценки способности культивируемых клеток к колониеобразованию. Часть экспериментов провести на световом и конфокальном микроскопах, часть - на проточном цитофлуориметре. Запланировано сравнение данных, получаемых при подсчете живых клеток на ростовой поверхности и в суспензии. Предполагается продолжить исследования влияния потенциального геропротектора "Quinton Marine Plasma" на пролиферацию и "стационарное старение" культивируемых клеток, а также эксперименты по определению в данной модельной системе "возраста" культуры с помощью оценки активности ассоциированной со старением бета- галактозидазы.
-
Abstract:
It is planned to carry out, with the help of the "stationary phase aging" cytogerontological model (stationary cell cultures), comparative studies of some groups of cell viability tests as well as some approaches to counting live cells. It is supposed to use several dyes and probes (trypan blue, methylene blue, neutral red, MTT, and rhodamine 123) and, in addition, to continue the experiments concerning improvement of the method of colony-forming ability evaluation for cultured cells. Some experiments should be carried out with light and confocal microscopy and some – with flow cytometry. It is scheduled a comparative analysis of data obtained when counting live cells on the growth surface and in suspension. It is also planned to continue investigations of the effect of a potential geroprotector "Quinton Marine Plasma" on the proliferation and "stationary phase aging" of cultured cells as well as experiments on determination, in this model system, of the culture "age" with the help of assessing activity of the senescence-associated β-galactosidase.
-
Планируемые результаты:
1. Усовершенствование модели “стационарного старения” клеточных культур - в частности, условий культивирования и поддержания клеток в длительном эксперименте. 2. Анализ кинетики вымирания и построение кривых выживания культуры клеток в опытах с разными условиями культивирования и в экспериментах по определению геропротекторных свойств изучаемых препаратов. 3. Внедрение демографических подходов в математический анализ продолжительности жизни культуры клеток с расчетом соответствующих показателей. 4. Поиск потенциальных геропротекторных препаратов с помощью разрабатываемой модели. 5. Поиск подходящих для модели биомаркёров клеточного “возраста”. 6. Тестирование разных способов определения жизнеспособности клеток; выбор способа, оптимального для экспериментов с использованием модели “стационарного старения” культур клеток. 7. Опубликование статей в рецензируемых научных журналах (2-3 статьи в год), выступление на международных конференциях с докладами (2-3 конференции международного охвата в год).
-
Научный задел:
Изучены цитогенетические последствия раздельного и совместного действия наночастиц золота и алкилирующего мутагена-радиомиметика дипина на сперматогенные клетки мышей линии 129/IMG, мутантных по гену ДНК-полимеразы йота. Установлен новый тип хромосомной аномалии, цитогенетически выявляемой во время профазы I мейоза: отделение полового бивалента XY (полового тельца) от основного генома в пахитенных сперматоцитах. Проведены эксперименты по сравнению нескольких способов оценки жизнеспособности "стационарно стареющих" культивируемых клеток, в том числе методом определения способности клеток к образованию колоний. Установлено, что для подсчёта количества живых и мёртвых клеток необходимо снимать адгезивные культуры клеток с поверхности роста, чтобы избежать искажения получаемых результатов. К данным о кинетике вымирания клеток применён новый способ их обработки, который позволяет проводить сравнение кривых выживания и определять показатели, характеризующие продолжительность жизни клеток в непересеваемой культуре. Для математического моделирования и расчётов разработаны две компьютерные программы. Подобраны оптимальные условия культивирования для проведения экспериментов с использованием модели "стационарного старения". Подробно изучено влияние экзогенного 8-оксо-2’-дезоксигуанозина на пролиферацию и "стационарное старение" культивируемых клеток китайского хомячка B11-dii FAF28. Определены локализация накопления экзогенного 8-оксо-2'-дезоксигуанозина в клетках, а также динамика поглощения ими этого соединения из культуральной среды. Установлено, что препарат снижает среднюю продолжительность жизни культуры клеток на 6%. Проведено исследование, направленное на определение митогенных и цитотоксических свойств двух потенциальных геропротекторов – метформина и рапамицина. Обнаружены геропротекторные свойства у изотонического препарата “Квинтон” – он увеличивает среднюю и максимальную продолжительность жизни культуры клеток на 7% и 11% соответственно.
- Добавил в систему: Ратанина Мария Александровна
Источник финансирования НИР
| госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Исследование механизмов старения и тестирование геропротекторов или геропромоторов в экспериментах на клеточных культурах и клетках зародышевого пути |
| Результаты этапа: В отчетном периоде работы в секторе эволюционной цитогеронтологии проводились по двум направлениям: 1) Изучение цитогенетических последствий раздельного и совместного действия наночастиц золота (НЧЗ) и алкилирующего мутагена-радиомиметика дипина на сперматогенные клетки мышей линии 129/IMG, мутантных по гену ДНК-полимеразы йота. Полученные результаты свидетельствуют о способности НЧЗ повышать спонтанный уровень хромосомных мутаций в сперматогенных клетках мышей изученной линии. Показано также, что, в отличие от ситуации у мышей-гибридов CBAхC57BL/6, у мутантных мышей линии 129/IMG при совместном с дипином действии НЧЗ не наблюдается ни антимутагенных, ни комутагенных проявлений. При цитогенетическом анализе популяции клеток печени у мышей линии 129/IMG обнаружено почти 8-кратное увеличение частоты встречаемости гепатоцитов со следами хромосомных аномалий по сравнению с физиологически устойчивыми мышами-гибридами CBAхC57BL/6. Кроме того, подсчет частоты встречаемости ядер разной плоидности (под контролем цитофотометрии) показал, что у этих мутантов число высокоплоидных ядер заметно выше, чем у мышей-гибридов. Полученные результаты, скорее всего, свидетельствуют о том, что у взрослых мышей линии 129/IMG в печени продолжаются пролиферативные процессы. По результатам работы подготовлена и сдана в печать статья "Наночастицы золота: мутаген, антимутаген, комутаген?". 2) Продолжение исследований, направленных на обоснование целесообразности использования модели "стационарного старения" культивируемых клеток для изучения механизмов старения и тестирования потенциальных геропротекторов. Проведены эксперименты по сравнению нескольких подходов к оценке жизнеспособности "стационарно стареющих" культивируемых клеток – с использованием метиленового синего, трипанового синего, бромида этидия, нейтрального красного, МТТ, компьютерного анализа "прижизненных" цифровых фотографий неокрашенных клеток, методики измерения активности ассоциированной со старением бета-галактозидазы, а также метода определения способности клеток к образованию колоний (в нашей модификации, обеспечивающей получение информации о точном распределении изучаемых клеток по пролиферативной активности). После анализа как результатов собственных исследований, так и многочисленных литературных данных (нами опубликован специальный обзор на эту тему) сделан вывод, согласно которому различные методы оценки жизнеспособности культивируемых клеток дают достаточно сильно различающиеся результаты при исследовании одной и той же клеточной популяции. Это позволяет полагать необходимым создание адекватной батареи тестов на жизнеспособность клеток, хотя оценка колониеобразующей способности остается самым надежным из таких методов (для пролиферирующих клеток). Кроме того, нами показано, что индуцированный этанолом окислительный стресс приводит к тому, что "молодые" клетки становятся такими же, как "старые", по показателю активности ассоциированной со старением бета-галактозидазы. Изучено также влияние экзогенного 8-оксо-2’-дезоксигуанозина (8-oxo-dG, известный биомаркер окислительного стресса и сопряженных с ним повреждений ДНК) на пролиферацию и "стационарное старение" культивируемых клеток китайского хомячка. Впервые показано, что эффект 8-oxo-dG зависит от пролиферативного статуса культуры. Селективное воздействие препарата именно на "старые", накопившие большое число повреждений, клетки свидетельствует в пользу существования потенциальной возможности использования 8-oxo-dG в качестве геропротектора, способного избирательно "очищать" организм от дефектных клеток. Наиболее вероятным теоретическим объяснением снижения соотношения 8-oxo-dG/dG в ДНК под действием экзогенного 8-oxo-dG является активация репаративных систем, осуществляющих более эффективное удаление модифицированного основания из ДНК. Однако возможен и вариант антиоксидантной активности, которую 8-oxo-dG сам по себе способен проявлять, окисляясь далее с раскрытием цикла до оксазолонов и гидантоинов. Для выяснения этого проводятся дополнительные эксперименты. По результатам работы в отчетном периоде вышло 12 научных публикаций. | ||
| 2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Исследование механизмов старения и тестирование геропротекторов или геропромоторов в экспериментах на клеточных культурах и клетках зародышевого пути |
| Результаты этапа: С помощью методов учёта сперматогониальных и мейотических микроядерных аберраций изучена чувствительность хромосомного материала дифференцирующихся половых клеток у мышей линии 129/IMG с нонсенс–мутацией в гене ДНК-полимеразы йота к действию модельного химического мутагена дипина. Обнаружено, что в семенниках мышей 129/IMG через 14, 28, 56 и 100 сут после мутагенного воздействия частота встречаемости хромосомных аномалий статистически достоверно не повышается по сравнению с уровнем, наблюдаемым при спонтанном мутагенезе. Завершены пилотные исследования по изучению прямого и комбинированного действия генетически активных соединений на наследственные структуры мейотических клеток и гепатоцитов половозрелых самцов мышей 129/JY (J – Jackson Laboratory, Bar Harbor, CA, USA; Y – питомник в Светлых Горах). В рамках цитогеронтологической модели "стационарного старения" проведено сравнение двух способов подсчёта живых клеток – на ростовой поверхности и в суспензии. Показано, что подсчёт количества живых и мёртвых клеток на поверхности роста с использованием разных красителей (метиленового синего, трипанового синего) менее предпочтителен, так как клетки наползают друг на друга и это вносит дополнительную погрешность в получаемые результаты. Проведено исследование, направленное на определение локализации накопления 8-оксо-2'-дезоксигуанозина в трансформированных клетках китайского хомячка линии B11-dii FAF28. Построены кривые выживания культуры тех же клеток в присутствии экзогенного 8-оксо-2'-дезоксигуанозина; показано, что это соединение не влияет на выживаемость клеток. Подобран краситель, наиболее подходящий для выявления ацидофильных везикул в клетках – нейтральный красный. Исследовано влияние рН культуральной среды на кинетику "стационарного старения". Обнаружено, что добавление буфера HEPES в культуральную среду позволяет клеткам быстрее выходить на "плато", однако на "долголетии" культуры это никак не сказывается – максимальная продолжительность жизни клеток, растущих на среде с буфером, сопоставима с этим показателем для контрольной группы. | ||
| 3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Исследование механизмов старения и тестирование геропротекторов или геропромоторов в экспериментах на клеточных культурах и клетках зародышевого пути |
| Результаты этапа: Результаты этапа: Установлен новый тип хромосомной аномалии, цитогенетически выявляемой во время профазы I мейоза: отделение полового бивалента XY (полового тельца) от основного генома в пахитенных сперматоцитах. Изучена реакция половых хромосом XY (или полового тельца) в развивающихся сперматогенных клетках у мышей-гибридов F1 CBA×C57BL/6 и мутантных мышей линии 129 на действие модельного мутагена дипина. Завершены эксперименты по изучению последствий влияния наночастиц золота на структурную организацию хроматина спермиогенных клеток мутантных мышей линии 129. В рамках модели "стационарного старения" показано, что подсчёт количества живых и мёртвых клеток предпочтительнее производить в суспензии снятых с поверхности роста клеток, так как это позволяет избежать завышения доли живых клеток. Выбран подходящий зонд для окраски лизосом с их последующей визуализацией в конфокальном микроскопе, лучше всего для этой цели подходит акридиновый оранжевый. Проведено исследование, направленное на определение митогенных и цитотоксических свойств двух потенциальных геропротекторов – метформина и рапамицина – в концентрациях, известных из литературных данных. Также осуществлён поиск культур клеток, подходящих для моделирования "стационарного старения". Разработана компьютерная программа для математического моделирования роста клеточной культуры (всреде Delphi на языке Pascal). Данную программу можно использовать для описания динамики роста монослойных клеточных культур и подсчёта числа делений, пройденных каждой клеткой. В среде "R" разработан алгоритм аппроксимации экспериментальных данных, который позволяет обрабатывать результаты экспериментов, полученные в рамках как клеточно-кинетической модели, так и модели "стационарного старения", а также получать для клеточных популяций параметры, имеющие определённый биологический смысл. | ||
| 4 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Исследование механизмов старения и тестирование геропротекторов или геропромоторов в экспериментах на клеточных культурах и клетках зародышевого пути |
| Результаты этапа: В результате исследования сперматогенеза у мутагенизированных мышей F1 CBA x C57BL/6 и мутантных мышей линии 129, дефектных по гену ДНК-полимеразы йота, установили новый тип хромосомной аномалии, выявляемой во время профазы I мейоза. Это - индивидуализация гетерогаметической структуры XY, ее резкое отделение от основного генома в пахитенных сперматоцитах и сохранение в постмейотических клетках. Показано, что у мутантных мышей линии 129 высокодифференцированные, митотически инертные клетки Сертоли после мутагенного воздействия входят в митотический цикл, используя одновременно две программы деления - симметричного и асимметричного. К данным о вымирании культуры клеток адаптированы методы статистической обработки, применяемые в демографических исследованиях. С использованием нового способа обработки данных установлено, что 8-оксо-2'-дезоксигуанозин вызывает сокращение средней продолжительности жизни "стационарно стареющей" культуры клеток китайского хомячка на 6%, а изотонический препарат "Квинтон" увеличивает этот показатель на 7% и также увеличивает на 11% максимальную продолжительность жизни. Кроме того, в экспериментах, направленных на поиск оптимальных условий культивирования клеток при моделировании "стационарного старения", новая обработка данных позволила нам выбрать наиболее подходящую среду (модифицированную Дульбекко среду Игла). Также мы провели эксперимент по оценке влияния одного из главных метаболитов глутамина – хлорида аммония – на кинетику вымирания клеток. Установили, что под влиянием этого соединения не происходит преждевременного старения культуры клеток – кинетика вымирания не различается между контрольной и опытной группами. Начаты эксперименты по изучению кинетики роста и последующей гибели в стационарной фазе иммортализованных фибробластов человека штамма "1608". Опубликованы две обзорно-теоретические статьи о старении половых клеток. Продолжена разработка компьютерной программы, написанной в среде Embarcadero RAD Studio Delphi 10.1 Berlin на языке Pascal. В программу внедрён ряд модулей для расчёта основных параметров вымирания "стационарно стареющих" клеточных культур, а также для попарного сравнения характеристик старения двух клеточных популяций. За отчётный период по теме НИР сотрудниками сектора было опубликовано 6 статей в рецензируемых научных журналах (плюс одна подготовлена к печати), 2 статьи в сборниках научных работ, 5 тезисов докладов. Сделано 8 устных докладов на международных конференциях. Защищена кандидатская диссертация на тему "Поли(ADP-рибозил)ирование белков в культивируемых клетках: влияние "стационарного старения" и различных биологически активных соединений". | ||
| 5 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Исследование механизмов старения и тестирование геропротекторов или геропромоторов в экспериментах на клеточных культурах и клетках зародышевого пути |
| Результаты этапа: Продолжены эксперименты по тестированию геропротекторов с помощью модели “стационарного старения” клеточных культур как с построением кривых выживания и оценкой продолжительности жизни, так и с анализом биомаркёров клеточного старения. Выбраны из потенциальных геропротекторов препараты (рапамицин и метформин), ингибирующие комплекс mTOR (target of rapamycin) и активирующие AMPK (AMP-activated protein kinase). Проведены предварительные исследования того, как меняется под влиянием этих препаратов кинетика вымирания "стареющей" культуры клеток. В качестве биомаркёра был выбран липофусцин, являющийся показателем работы лизосом. Показано (с помощью красителя судана черного Б) накопление этого пигмента в "стационарно старых" трансформированных клетках китайского хомячка. Выполнены предварительные исследования изменения иммортализованных клеток человека (с активированной теломеразой) в модели "стационарного старения". Показано, что кинетика этого процесса очень сходна с таковой для клеток китайского хомячка. Это подчеркивает универсальность используемой модели. Осуществлено дальнейшее развитие математического аппарата, обеспечивающего "геронтологический" анализ кинетических закономерностей роста и гибели непересеваемой культуры клеток. Написаны обзоры о влиянии мягкого разобщения (главным образом – с помощью 2,4-динитрофенола) на старение и продолжительность жизни, а также о преимуществах использования культивируемых клеток китайского хомячка различных линий в геронтологических и биотехнологических исследованиях. За отчётный период по теме НИР сотрудниками сектора было опубликовано 5 статей в рецензируемых научных журналах и сборниках статей. Сделано 4 доклада на международных конференциях. Защищена кандидатская диссертация на тему "Кинетические аспекты моделирования старения в экспериментах на непересеваемой культуре клеток" (Г.В.Моргунова). | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".