![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Реакции эмбриональных клеток на механические напряжения (МН) – один из ведущих факторов морфогенеза и клеточной дифференцировки, однако механизмы этих реакций лишь только начинают изучаться. Предполагается вести работу в следующих направлениях: - исследование активных реакций эмбриональных клеток на МН; - поиск механозависимых генов; - выявление рецепторов, сигнальных путей и молекулярных генераторов МН в эмбриональных клетках; - моделирование клеточных реакций на МН - исследование структурных белков, обеспечивающих механическое сопряжение клеток и тканей - исследование МН на процессы нарушения симметрии частей тела и органов в развитии животных -исследование молекулярных механизмов нарушения симметрии частей тела и органов в развитии животных
The response of embryonic cells to mechanical stress (MS) is one of the factors affecting morphogenesis and cell differentiation, however, the mechanisms of these changes are only just at beginning to be studied. It is supposed to conduct work in the following areas: - study of the active response of embryonic cells to MS; - search for mechanically dependent genes; - identification of receptors, signaling pathways and molecular generators of MS in embryonic cells; - modeling of cellular reactions to MS - study of structural proteins that provide mechanical conjugation of cells and tissues - study of MS on the processes of symmetry breaking of body parts and organs in the development of animals - investigation of the molecular mechanisms of symmetry breaking in body parts and organs in the development of animals
Работа, предшествующая выполнению данного этапа НИР, была направлена на решение некоторых вопросов механобиологии. Было проведено детальное исследованние микродеформации тканей в разных областях зародышей (боковых и дорсальных)на разных стадиях нормального развития (от ранней гаструлы до поздней нейрулы) для установления роли активных и пассивных компонентов в формировании паттернов МН. Была изучена вариабельность становления главной оси тела в ходе развития полипа Dynamena pumila по паттернам экспрессии генов Wnt3 и Frizzled3 (маркеров антерио-постериорной оси). Исследованы молекулярные механизмы понижения порядка симметрии при морфогенезе верхушки роста побега колонии Dynamena pumila. Начата разработка методов количественной регистрации клеточных движений и морфологических характеристик в эмбриональных тканях шпорцевой лягушки с использованием конфокальной микроскопии и автоматического анализа изображений. Было прослежено влияние искусственных деформаций на морфогенез осевых зачатков у Xenopus. Были продолжены исследования влияния блокатора форминов семейства Dia SMIFH2 на установление право-левой оси организма у амфибий.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения. |
Результаты этапа: | ||
2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения. |
Результаты этапа: Исследовали градиенты деформаций, формирующихся по ходу развития зародыша амфибий, которые охватывают области порядка сотен микрон и существуют в течение 2-4 часов (макроградиенты). Они по большей части совпадают с главными осями зародыша – анимально-вегетативной, An-Veg (переходящей в передне-заднюю, Ant-Post) и вентро-дорсальной (V-D). Клетки движутся вверх по макроградиентам - в период гаструляции в An-Veg направлении к бластопору, а в период нейруляции – в V-D направлении в сторону замыкания нервной трубки. В результате этих движений градиенты сначала сглаживаются, а потом инвертируются, и тогда движение клеток в прежних направлениях прекращается. По нашим наблюдениям, клетки не останавливаются, а разворачиваются (в зависимости от отсутствия или наличия латеральных препятствий) либо на 90град, либо на 180град, то есть в переднем направлении на стадии поздней гаструлы и в переднем и заднем направлениях на стадиях поздней нейрулы и ранней хвостовой почки. В этих направлениях формируются новые восходящие градиенты. Изменения направлений движения клеток наступают через 20-30 мин после изменения формы макроградиентов. Реальные значения деформаций в малых областях ткани, расположенных по ходу градиента, существенно отличаются от средних значений, то есть макроградиенты модулированы более кратковременными и локальными деформациями. Измерения подтвердили это предположение, причем было обнаружено, что по ходу развития происходит постепенный переход от модуляций, которые условно можно обозначить как жидкофазные или некогерентные к твердофазным или когерентным модуляциям. Этот вывод был основан на измерениях (1) величин соответствующих деформаций; (2) корреляций между траекториями одновременных движений различных клеток; (3) спектрах Фурье по скоростям клеточных движений за последовательные 10-минутные отрезки времени. При изучении пейсмейкерной системы гидроидных полипов, обеспечивающей пульсационный рост на колониальном гидроиде Gonothyraea loveni показано, что блокаторы HCN каналов, такие как затебрадин и ZD7288 ингибируют ростовые пульсации верхушки роста столона. Этот эффект обладает дозозависимостью – по мере увеличения концентрации блокатора эффект усиливается. Интересно то, что низкие концентрации блокатора приводят не к увеличению периода пульсации, а к уменьшению амплитуды пульсации. Это может быть вызвано как уменьшением скорости течения гидроцели, так и нарушениями в системе функционирования верхушки роста. При некоторой концентрации блокатора (30 и 60 мкг/л для затебрадина, 60 и 300 мкг/л для ZD7288) пульсации сохраняются, но становятся нерезультативными. Это может свидетельствовать о том, что нерезультативной становится вторая фаза удлинения столона: в этой фазе удлинение происходит за счет удлинения энтодермального слоя. Переход к фазе сокращения сопровождается излиянием вакуолей эпидермальных клеток во внешнюю среду. Это действие очень быстрое, и во всех эпидермальных клетках оно происходит одновременно. В отличие от обеих фаз растяжения, которые наступают в проксимальных частях верхушки раньше, чем в дистальных, сигнал к этому действию должен проходить очень быстро. Напротив, сигнал к стадии растяжения может быть накопительным. Сигнал, передаваемый посредством HCN каналов, обладает электрической природой. Следовательно, он передается очень быстро и не нуждается в накоплении – и, если полагать схему регуляции прямой, а не опосредованной, то может быть сигналом именно к сбросу вакуолей и переходу в фазу сокращения. Это согласуется с данными об остановке пульсаций в фазу максимального растяжения при блокировании ростовых пульсаций. Идентифицированные нами гены HCN1 и HCN4 в верхушке роста подтверждает возможность передачи сигнала через щелевые контакты. При проведении сравнительного анализа экспрессии механочувствительного рецептора полицистина-1 среди амниот выявлено, что на стадиях гаструляции (стадии 3, 4) у кролика, PKD1 равномерно экспрессируется по бластодиску зародыша. Протоколы гибридизации in situ для зародышей кролика были любезно предоставлены профессором Кристофом Фибаном из университета Гёттингена, выдающимся специалистом в области эмбриологии млекопитающих. Однако интенсивной экспрессии в первичной полоске, как у птиц, мы не обнаружили. Интересным является факт, что в бластодерме присутствуют отдельные клетки с повышенной экспрессиией PKD1. На стадии 3, эти клетки локализуются в основном в области заднего узелка, а на стадии 4 - по краю бластодиска. Какова функция этих клеток покажут последующие исследования. Отличный паттерн экспрессии PKD1 наблюдается в раннем развитии свиньи, где PKD1 экспрессируется только во внезародышевых тканях. Возможно, такое разнообразие паттернов механозависмого рецептора PKD1 будет объяснено после дальнейших функциональных экспериментов. При исследовании роли морфогенетических движений и связанных с ними механических напряжений в формировании пространственной структуры осевых зачатков у зародышей шпорцевой лягушки с использованием методов прижизненной количественной регистрации движений индивидуальных клеток была создана экспериментальная модель, в которой содержался весь клеточный материал осевого комплекса, но были подавлены механические натяжения (МН), связанные в норме при гаструляции с клеточными движениями латеро-медиальной конвергенции. Такой моделью стал двойной эксплантат (сэндвич), изготовленный из двух симметричных полосок кольцевой презумптивной мезодермы, разрезанный по дорсо-медиальной и вентро-медиальной линиям. Подавление МН в нем определялось разрезом по дорсо-медиальной оси, что разрушало расположенный именно по этой оси главный аттрактор латеро-медиальной конвергенции. Контролем служили сэндвичи из того же материала, разрезанные в латеральных плоскостях, т.е. сохранившие аттрактор. Каждая серия состояла из 20 образцов, изготовленных на стадиях 10 –10,5 (ранняя гаструла). Тогда как в контрольной серии постоянно возникал полноценный осевой комплекс, в большинстве ( 80%) образцов с разрушенным аттрактором осевые органы отсутствовали. Таким образом, нарушение поля механических напряжений в области дорсального организатора и, как следствие, нарушение паттерна движений клеток этой области, при сохранении всего массива клеток, приводит к подавлению формирования осевых структур. При искусственном растяжении образцов разрушенным аттрактором в дорсо-вентральном направлении, т.е. перпендикулярно естественному направлению растяжения. в эксплантатах в 75% случаев формировались осевые структуры (против 20 % в релаксированных), причем в 40% возникала только хорда, в 10% только сомиты, в 35% хорда и сомиты вместе. Осевые структуры в растянутых сэндвичах со стадии ранней гаструлы располагались в контакте друг с другом и были ориентированы в направлении искусственного растяжения. Это позволяет сделать вывод, что МН, независимо от своего направления, способствуют формированию осевых структур. В связи с обнаруженным подавлением формирования хорды в релаксированных эксплантатах со ст.10, на которой уже хорошо выражена экспрессия специфического маркера хорды гена Chordin, мы исследовали экспрессию гена в нашей модели методом гибридизации in situ. Уже через 4 часа были видны различия в уровне экспрессии в образцах релаксированной и растянутой серий: экспрессия в нерастянутых образцах была ниже, чем в растянутых. Через 24 часа в нерастянутых эксплантатах с разрушенным аттрактором экспрессия гена Chordin была локализована полярно в исходно дорсальной области эксплантата, тогда как в растянутых экспрессия была высокой и хордальная метка была вытянута от дорсального к вентральному концу сэндвича. При продолжении исследования морфомеханических факторов в установлении планарной полярности клеток ресничного эпителия архентерона и их роли для формирования право-левой асимметрии у зародышей Xenopus исходили из того, что зона лево-правого организатора (ЛПО) архентерона гаструлы-нейрулы Xenopus находится в поле механических напряжений (МН), генерируемых хордой и осевой мезодермой, удлиняющихся в передне-заднем направлении. МН через РСР-каскад могут влиять на полярность клеток ЛПО и расположение ресничек. Для проверки этой гипотезы мы перенатягивали с помощью стеклянных игл область ЛПО в направлении перпендикулярном исходному. Растяжения выполнялись как на целых зародышах, начиная со стадии 12, так и на экслантатах дорсальной стороны. Образцы культивировались до ст.19-20. Организацию ресничек в ЛПО исследовали методами сканирующей электронной и лазерной конфокальной микроскопии, а нарушение право-левой асимметрии целых зародышей методом гибридизации in situ с зондом на ген Xnr1. Результаты показали, что растяжение в перпендикулярном направлении никак не влияет на количество и длину ресничек, а только на их расположение, что свидетельствует о механозависимой активации PCP каскада. Результатом переориентирования ресничек являлось нарушение экспрессии Xnr1, который в норме экспрессируется только на правой стороне латеральной мезодермы, а в эксперименте экспрессия исчезала совсем. При исследовании влияния фармакологического блокатора форминов Dia2 SMIFH2, участвующих в поддержании право-левой асимметрии клеток, на распределение ресничек в ПЛО показано, что работа форминов критична для нормального становления лево-правой асимметрии тела на стадии гаструлы-нейрулы, то есть во время работы ресничного организатора в крыше гастроцели. Как показали морфологические измерения, длина ресничек и положение ресничек на клетках принципиально не меняются при воздействии ингибитором форминов SMIFH2. Меняется (а именно уменьшается) сама доля ресничных клеток в области ЛПО. Данные полученные со сканирующей микроскопии, конфокальной микроскопии и гистологии свидетельствуют, что доля ресничных клеток уменьшается оттого, что сама область ЛПО оказывается не полностью раскрытой, и часть клеток, которые на этой стадии в норме должны были бы находиться на внутренней поверхности крыши гастроцели, оказываются перекрыты клетками энтодермы и пространственно лишаются возможности экспонировать реснички в полость гастроцели. Изучение морфологии области ЛПО, развивавшейся и функционировавшей под воздействием модуляторов форминов, показало, что наиболее вероятным эффектом нарушения работы форминов является ослабление левонаправленного тока жидкости в гастроцели за счёт уменьшения числа ресничных клеток, что должно приводить к нарушениям экспрессии гена Xnr1. По нашим наблюдениям, наиболее частым нарушением экспрессии, доля которого быстро возрастает при повышении концентрации ингибитора форминов, является фенотип с полным отсутствием экспрессии Xnr1 – то есть эмбрион как будто имеет две правых стороны. | ||
3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения. |
Результаты этапа: При изучении динамики поверхностных клеток эктодермы зародышей амфибий при нормальном развитии и в модельных системах с измененными паттернами механических натяжений проведены дополнительные цейтраферные микрофотосъёмки дорзальной и спинной сторон зародышей шпорцевой лягушки от стадии поздней бластулы до стадии хвостовой почки и растянутых двойных эксплантатов крыши бластоцеля с ранней гаструлы. В программе Image J прослежены на полученных цейтраферах траектории отдельных клеток и рассчитаны их координаты. В программе Statistica с учетом дополнительных данных проведён статистический анализ. Измеряя напряженные линейные деформации (вызванные различиями в скоростях передвижения клеток) во внешнем клеточном слое эмбрионов Xenopus на стадии зародыша ранней хвостовой почки, мы обнаружили несколько долгосрочных растягивающих градиентов скорости перемещения клеток, модулирующих краткосрочные смещения клеток относительно друг друга, которые в свою очередь значительно увеличивают скорость локальных деформаций. Экспериментальная релаксация напряжений приводила к нарушениям обнаруженных градиентов, однако при этом сохранялись и даже усиливались локальные перемещения клеток. Во время развития, некогерентный режим поведения клеток, характеризующийся обширными смещениями клеток относительно друг друга и плохо коррелирующими траекториями клеток, сменялся на более согласованный режим с противоположными характеристиками. В частности, смена соседей при перемещениях клеток становилась более синхронной и приобретала периодичность в несколько десятков минут. Полученные результаты подтвердили ранее обнаруженное явление наличия микродеформаций в эпиэктодерме и существование характерных градиентов механических напряжений. При исследовании морфогенетических механизмов гаструляции гидроидного полипа Dynamena pumila изучена вариабельность становления главной оси тела по паттернам экспрессии генов - маркеров орального и аборального полюсов. Развитие эмбрионов Dynamena pumila характеризуется эквифинальностью и вариабельностью морфогенезов, а также предполагается, что ведущим фактором упорядочивания клеточных перегруппировок являются механические напряжения. Для описания вариабельности при становлении главной оси тела Dynamena были клонированы участки генов Wnt3 и Frizzled 3 (Fzd3) являющиеся маркерами орального и аборального полюсов у книдарий соответственно. Исследование проводили методом гибридизации in situ. Оказалось, что Wnt3 и Fzd3 имеют крайне вариабельный паттерн развития до стадии препланулы. Более того, ни один из маркеров не коррелировал с появлением морфогенетических очагов эпителизации зародыша и их экспрессия не соответствовала морфологически различимым полюсам эмбриона. Полярная экспрессия обоих генов устанавливалась только к стадии препланулы, причем заживление последнего очага эпителизации всегда наблюдалось на границе экспрессии этих генов. Таким образом, мы показали, что в отличие от всех остальных исследованных книдарий, молекулярная разметка орально-аборальной оси происходит непосредственно перед формированием личинки, а также морфогенетические механизмы гаструляции никак не зависят от механизмов становления полярности тела у Dynamena. Также возникает вопрос, когда и как специфицируются зародышевые листки у Dynamena при наличии таких уникальных механизмов развития. Для этого был выбран ген-маркер эндодермы FoxA. При первоначальном исследовании оказалось, что этот ген экспрессируется как в поверхностных клетках, так и во внутренних клетках эмбриона до стадии поздней гаструлы. Только во внутренних клетках эмбриона FoxA детектировался только перед стадией препланулы. Таким образом, окончательное расположение зародышевых листков происходит только перед началом формирования личинки, что тоже не соответствует данным, имеющимся на сегодняшний день для исследованных книдарий. Были исследованы механизмы тройчатого морфогенеза мутовки побега полипа Dynamena pumila гистологическими и иммуногистохимическими методами. Оказалось, что разделение зачатка происходит не за счет формирования эпителиальных инвагинаций на дистальном слое эктодермы, как считалось раньше, а в результате врастания хитиновых септ. Две пары хитиновых септ начинают расти от внешнего перисарка к центру зачатка. В результате слияния противоположных септ происходит разделение ткани верхушки роста на три части: боковые дифференцируются в гидранты, центральный остается верхушкой роста. Известно, что Wnt канонический путь участвует в спецификации орально-аборальной оси тела у книдарий, однако участвует ли он в морфогенезе сложно устроенных колоний гидроидных полипов до сих пор не известно. Сначала мы исследовали экспрессию генов-компонентов канаонического каскада, оказалось, что действительно в разметке зачатка участвуют как минимум три гена: Brachyury2, TCF и Beta-catenin. Активация канонического Wnt каскада во время формирования первичного полипа блокировала формирование новой верхушки роста и формировались первичные колони без верхушк роста. При длительной активации данного каскада азакенпауллоном пространственная организация колонии сменялась с моноподиально разветвлённой колонии на столониальную колонию. Таким образом мы получили не просто не существующий в природе фенотип, а сменили план строения тела с одного на другой, характерный для других видов гидроидов. Блокирование канонического Wnt iCTR14 приводило к полной блокировке роста и морфогенеза, однако, последующее отмывание блокатора способствовало возобновление роста. В этом случае вместо верхушки роста побега формировалась верхушка роста столона. Данные результаты свидетельствуют о том, что канонический Wnt каскад является не только «головным организатором», как считалось до этого, но и его активность является параметром позиционной информации, участвующей в разметке всего тела. Начата разработка методов количественной регистрации клеточных движений и морфологических характеристик в эмбриональных тканях шпорцевой лягушки с использованием конфокальной микроскопии и автоматического анализа изображений. Для контрастной визуализации клеточных границ были применены механизмы визуализации клеточной мембраны генетическими-кодируемыми маркерам GAP43-GFP и ядер - H2B-mCherry. Визуализированные ядра выступают опорными точками в алгоритме ручной коррекции артефактов распознования, вызванных неравномерностью сигнала. Далее были оптимизированы методики цейтраферной сьемки на инвертированном конфокальном микроскопе Olympus FV-10i. Вместо стандартной 40 мм чашки Петри с субстратом в виде 3% агарозы были использованы 35 мм чашки Петри с дном из покровного стекла, заполненные 1% агарозой с низкой температурой плавления. Зародышей со снятыми желточными оболочками вносили в агарозу и затем ориентировали вблизи покровного стекла с помощью запаянной стеклянной пипетки Пастера. Указанная методика позволила провести прижизненные регионспецифичные цейтраферные съёмки поздних гаструляционных движений. Дальнейшая работа в этом направлении подразумевает повышение выживаемости эмбрионов после экспериментального воздействия, а также съёмки гаструляционных движений на более ранних стадиях развития. Для возможности последующей регистрации механозависимых клеточных движений in vivo с помощью конфокального микроскопа разработан и частично реализован проект автоматизированной установки, позволяющей осуществлять контролируемое двухосевое растяжение подложки с прикреплёнными эксплантатами ткани. Режим деформации подложки будет подобран с учётом анализа упомянутых выше цейтраферных съёмок гаструляционных движений в интактных зародышах для достижения наибольшего сходства экспериментального воздействия с условиями нормального развития. Была исследована роль механических напряжений в ходе формирования осевого комплекса амфибий. Для этого использовали модель двойного эксплантата из латеральных губы средней гаструлы шпорцевой лягушки. Для визуализации ткани сомитов и хорды была использована методика гибридизации in situ. Для этого были клонированы участки генов MyoD в качестве маркера сомитов и гена Chordin в качестве маркера клеток хорды. Оказалось, что все составляющие осевого комплекса располагались на выгнутой стороне деформированных эксплантатов. Также деформация стимулировала формирование сомитов. В деформированных эксплантатах наблюдалось достоверное увеличение количества сомитов на 10% по сравнению с недеформированными. Различий в размерах сомитов отмечено не было. Расположение хорды и сомитов в недеформированных эксплантатах было рандомизированным. Таким образом, деформация эмбриональной ткани приводит к стимуляции морфогенетических процессов и необходима для правильной пространственной разметки осевого комплекса. Были продолжены исследования влияния блокатора форминов семейства Dia SMIFH2 на установление право-левой оси организма у амфибий по выявлению методом гибридизации in situ экспрессии генов Xnr1 и Pitx2, в норме экспрессирующихся в боковой мезодерме с левой стороны тела. Было проведено не менее 5 повторностей эксперимента с выборкой не менее 70 зародышей в каждой точке. Мы выяснили, что критическим этапом функционирования форминов в развитии является стадия средней-поздней гаструлы, во время формирования лево-правого организатора, а не стадии дробления как считалось до этого. Блокирование форминов во время гаструляции приводило к рандомизации становления лево-правой асимметрии и нарушению экспресии генов Xnr1 и Pitx2.Так как многие нарушения при становлении лево-правой оси у позвоночных связаны именно с нарушенем гена FoxJ1, отвечающего за формирование ресничек в лево-правом организаторе, мы исследовали его экспрессию после блокирования форминов. Мы не обнаружили достоверного нарушения его экспрессии. Таким образом, можно предположить, что критическое значение формины имеют для регуляции динамики актинового цитоскелета во время морфогенеза крыши гастроцеля и области лево-правого организатора | ||
4 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения. |
Результаты этапа: Продолжено изучение движений клеток эктодермы зародышей X. laevis в нормальном развитии и при экспериментальной деформации ткани. Оптимизированы параметры цейтраферной съёмки на инвертированном конфокальном микроскопе Olympus FV-10i (интенсивность лазера, время и частоту съёмки). Экспериментально подобраны количественные параметры введения введения РНК флуоресцентных маркёров - по 200 пг для обоих используемых маркёров (GAP43-GFP и H2B-mCherry) в 4,6 нл в две точки на эмбрионе. Провели прижизненную регионспецифичную съёмку ранних гаструляционных движений в нормальном развитии X. laevis в 3 повторностях. Для экспериментов с деформацией эксплантатов эмбриональной ткани реализовали проект автоматизированной установки для контролируемого растяжения эластичной подложки с прикреплёнными эксплантатами ткани, разрабатывается программное обеспечение для более эффективного управления процессом растяжения. Подобран и отработан протокол адгезии эксплантатов ткани к подложке (фибронектин с концентрацией 20 мкг/мл.) На 19 эксплантатах доказана эффективность разработанной методики растяжения эксплантатов. При исследовании установления право-левой оси организма на стадии гаструлы эмбриона курицы модулировали активность и динамику микрофиламентов во время морфогенеза гензеновского узелка при использовании SMIFH2 для ингибирования формина и IMM-01 для его активации. Влияние оценивали по анализу клеточных движений методом PIV при цейтраферной съемке развития эмбриона и по экспрессии генов nodal и shh. Установлено, что становление ассиметричной экспрессии shh происходит независимо от ассиметричной коллективной миграции клеток в гензеновском узелке При изучении вариабельности механизмов гаструляции и изменения порядка симметрии в развитии гидроидного полипа Dynamena pumila методом трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии исследована ультраструктура клеточных взаимодействий во время этих процессов. Подобрана условия обработки материала для СЭМ, при которых скол эмбриона проходит по границам клеток, не нарушая целостности мембраны. На латеробазальных поверхностях клеток 16-32-клеточных зародышей выявлены ламеллоподии, разделяющиеся на множество филлоподий. Вероятно, такие структуры формируют замки между клетками увеличивая площадь соприкосновения клеток и обеспечивая надежность межклеточных контактов. Эти структуры не были описаны ранее ни у одного представителя гидроидных полипов в раннем развитии С помощью оптимизированного метода СЭМ в области дна эпителиальных торов показано отсутствие колбовидных клеток, а, следовательно, что в формировании эпителиальных торов не участвует процесс инвагинации, как предполагалось ранее. Методом РЭМ начиная с 8-клеточной стадии и до гаструляции послежена динамика межклеточных контактов клеток, позволившая проследить процесс эпителизации зародыша. При изучении механизмов морфогенеза мутовки побега полипа Dynamena pumila исследована роль Wnt канонического каскада. Опыты с пульсовым воздействием активаторов (azakenpaullone) и ингибиров (iCTR14) канонического Wnt каскада на формирование первичных колоний показано, что тонкая настройка активности Wnt/β-catenin каскада определяет не только выбор между формированием столониальной и побегообразующей колонии, но и участвует в регуляции формирования разных типов побегообразующих колоний | ||
5 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения. |
Результаты этапа: Для исследования влияния микродеформаций, возникающих в результате клеточных движений и клеточных перегруппировок, на распределение механических сил в эмбриональных тканях X. laevis, осуществили цейтраферную сьемку (с помощью ЛСКМ Olympus FluoView 10i) клеточных движений в эпиэктодермe дорсальной области эмбрионов на стадиях 10,5 (средняя гаструла) и 14-15 (ранняя нейрула).Для визуализации клеток вводили мРНК мембранного (GAP43-GFP) и ядерного (H2B-mCherry) маркёров на стадиях от 2-4х бластомеров. Анализ движений клеток в дорсальной области средней гаструлы выявил тенденцию к ускорению клеточных движений отдельных групп клеток с ростом сонаправленности их смещений и, наоборот, замедлению движений при снижении сонаправленности. При этом в соседних группах могут одновременно наблюдаться противоположные по эффекту тенденции, а в соседних регионах тенденции могут меняться на противоположные. Это указывает на существование стадиеспецифичного распределения сил при активных морфогенетических движениях. Зарегистрированные на стадии нейрулы деформации и клеточные движения свидетельствуют о наличии механической силы в нервной пластинке, растягивающей её туловищную область. Проведены эксперименты по искусственному воспроизведению микродеформаций в эмбриональных эксплантатах лягушки с использованием визуализации мембран клеток и ядер генетически кодируемыми маркера. Для приложения механической нагрузки использована разработанная в нашей группе система для автоматизированной одноосевой деформации эластичных клеточных подложек эксплантатов с цейтраферной съёмкой клеток эксплантата. Результаты обрабатываются. Исследованы молекулярные механизмы морфогенеза мутовки побега полипа Dynamena pumila, обеспечивающие понижение порядка симметрии, в частности, роль Wnt канонического каскада с использованием ингибиторов (Azk и iCRT14). Методом RT-PCR, Q-PCR и NGS секвенирования в верхушке роста полипа на стадии морфогенеза показано понижение экспрессии гена неканонического кадгерина FAT4 и повышение экспрессии гомеобоксного гена Dlx. Методом Real-Time PCR Была охарактеризована экспрессия гена половой плазмы Germes в фолликулярном комплексе X. laevis. Показано, что на стадии малого роста ооцитов (I-III cт) уровень экспрессии Germes в фолликулярных клетках (ФК) примерно в 3 раза превышает таковую в самих ооцитах, а на стадии большого роста (V-VI стадии) они сопоставимы. Для визуализации в яичниках X. laevis белка Germes была получена антисыворотка, содержащая антитела против данного белка (для чего конструкт фрагмента гена Germes был слит с GST-tag, затем экспрессирован в бактериях, полученный белок хроматографически очищен и использован для иммунизации кроликов). Иммуноокрашивание выявило белок Germes в и в ооцитах, и в цитоплазме и плазматической мембране ФК, особенно в контактных зонах соседних ФК и ФК сооцитом. Т.о. впервые показана экспрессия одного из генов половой плазмы в соматических клетках ФК. Дополнительно в рамках темы с использованием блокатора форминов семейства Dia SMIFH2 на установление право-левой оси организма у амфибий, выявлемой методом гибридизации in situ экспрессии генов Xnr1 и Pitx2, в норме экспрессирующихся в боковой мезодерме с левой стороны тела, и на регуляцию формирования ресничек (по паттерну экспрессии гена FoxJ1) в лево-правом организаторе. Блокирование форминов стадия средней- поздней гаструлы приводило к рандомизации становления лево-правой асимметрии и нарушению экспрессии генов Xnr1 и Pitx2, однако не обнаружили достоверного нарушения экспрессии гена FoxJ1, хотя до этого считалось, что многие нарушения при становлении лево-правой оси у позвоночных связаны именно с этим геном, отвечающим за формирование ресничек в лево-правом организаторе. Показано, что модуляция уровня форминов, влияющих на активность и динамику микрофиламентов, во время морфогенеза гензеновского узелка у курицы воздействием SMIFH2 (ингибитор) и IMM-01 (активатор) не вызывало нарушений ни коллективных клеточных движений и ни паттернов экспрессии генов nodal и shh (показатели становления лево-правой асимметрии тела). |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".