|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Развитие технологии редактирования генома мышейНИР
Development of mice genome editing
- Руководитель НИР: Сергиев П.В.
- Участники НИР: Аверина О.А., Григорьева О.О., Калабушев С.Н., Комарова Е.С., Кузнецова С.А., Марьясина С.С., Пермяков О.А., Чичерин И.В.
- Подразделение: Институт функциональной геномики
- Срок исполнения: 1 января 2019 г. - 31 декабря 2026 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 0000000
- Номер ЦИТИС: АААА-А19-119012490166-2
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Развитие технологии редактирования генома мышей
- Приоритеты и перспективы НТР Российской Федерации согласно Стратегии НТР РФ: переход к высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
- Критическая технология России: Геномные, протеомные и постгеномные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 31.23.27 Пептиды, белки
- 31.23.29 Нуклеиновые кислоты и их компоненты
- 31.27.15 Структура и функции биополимеров
- 34.15.25 Молекулярная биология гена
- Классификатор OECD: Биотехнологии в медицине, Биохимия и молекулярная биология
-
Ключевые слова:
функциональная геномика, редактирование генома, клеточные линии, crispr/cas9, направленные мутации, трансгенные и нокаутные мыши
functional genomics, transgenic and knockout mice, crispr/cas9, genome edition, directed mutations, cell lines -
Описание:
Развитие технологии генетического редактирования геномов млекопитающих является важнейшим шагом на пути к пониманию функциональной роли неизвестных ранее генов, продуктов генной экспрессии и метаболитов и открывает перспективы создания организмов с новыми свойствами, востребованными фундаментальной наукой, биотехнологией и медициной. Использование технологии генетического редактирования делает возможным усовершенствование значимых для сельского хозяйства видов животных, а также создание животных моделей генетических заболеваний человека для поиска эффективных средств лечения. В ходе выполнения НИР будут отработаны методы и условия получения трансгенных и нокаутных линий мышей. Будут созданы и исследованы линии мышей с измененным геномом, содержащим: отдельные инактивированные гены; чужеродные гены, встроенные в заранее заданное положение генома; гены, содержащие направленные мутации. Будут изучены фенотипические проявления измененного генома. Будет исследована функциональная роль белков и РНК продуктов генной экспрессии.
-
Abstract:
The development of the technology of genetic editing of mammalian genomes is an important step towards understanding the functional role of previously unknown genes, products of gene expression and metabolites and opens up prospects for the creation of organisms with new properties demanded by fundamental science, biotechnology and medicine. The use of genetic editing technology makes it possible to improve animal species of importance for agriculture, as well as the creation of animal models of human genetic diseases for the search for effective means of treatment. In the course of research, methods and conditions for obtaining transgenic and knockout lines of mice will be worked out. Lines of mice with a modified genome containing separate inactivated genes, alien genes embedded in a predetermined position of the genome and genes containing targeted mutations will be created and investigated. The phenotypic manifestations of the altered genome will be studied. The functional role of a number of proteins and RNA products of gene expression will be investigated.
-
Планируемые результаты:
В результате выполнения проекта будет усовершенствована технология редактирования генома мышей. Будут разработаны новые методики для увеличения выхода оплодотворенных яйцеклеток, пригодных для микроинъекций компонентов систем генетического редактирования. Будут оптимизированы условия приготовления растворов для микроинъекций, повышающие скорость процесса микроинъекций, выживаемость яйцеклеток после микроинъекций, эффективность генетического редактирования и получения нокаутных линий мышей. В целях увеличения эффективности получения мышей с редактированным геномом будут оптимизированы условия содержания и ссаживания популяций мышей-доноров яйцеклеток, самцов-производителей, вазэктомированных самцов и самок-суррогатных матерей. С помощью технологии геномного редактирования будут получены и охарактеризованы линии мышей с инактивированными генами с неизвестными функциями и генами, мутации в которых влияют на склонность к развитию патологий человека, для создания моделей данных патологий. Будут представлены данные секвенирования и выявленные аллельные варианты инактивированных генов, полученные в результате направленного разрезания генома системой CRISPR/Cas9. Будут созданы модели генетически обусловленных заболеваний человека. Для этого мутации или полиморфные варианты генов, встречающиеся у человека и вызывающие заболевание или повышающие предрасположенность к развитию заболевания, будут воссозданы у мыши. Такие линии мышей будут изучены, охарактеризованы и использованы в дальнейшем для создания моделей для доклинических испытаний. Кроме того, линии мышей с измененным геномом будут использованы для фундаментальных исследований функции генов. Понимание функциональной роли неизвестных ранее генов открывает дорогу к созданию организмов с новыми свойствами, востребованными биотехнологией и медициной.
-
Научный задел:
В Институте функциональной геномики МГУ успешно проводятся исследования по созданию трансгенных и нокаутных линий мышей с помощью технологии CRISPR/Cas9. Налажено получение линий мышей как с инактивированными генами, так и со встроенными нуклеотидными последовательностями в предопределенное место генома. К настоящему моменту созданы линии нокаутных мышей с инактивацией ряда конкретных генов. Помимо инактивации генов, проведено гораздо более сложное и трудоемкое редактирование геномов с созданием генов гибридных белков. Создана система содержания популяций мышей в условиях, свободных от специфических патогенов, которая успешно используется для получения животных с отредактированным геномом. К настоящему времени создано 17 линий трансгенных/нокаутных мышей. Таким образом, Институт функциональной геномики МГУ имеет необходимый задел и опыт работы по успешному созданию и исследованию линий мышей и клеточных линий с измененным геномом.
- Добавил в систему: Сергиев Петр Владимирович
Источник финансирования НИР
| госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Развитие технологии редактирования генома мышей |
| Результаты этапа: Разработаны новые методики для увеличения выхода оплодотворенных яйцеклеток, пригодных для микроинъекций компонентов систем генетического редактирования. Установлено, что в качестве производителей эмбрионов для процедуры редактирования генома мышей наилучшим образом подходят самки мышей инбредной линии FVB, зиготы которых имеют «чистую» незернистую цитоплазму и крупные, четко различимые пронуклеусы, являющиеся легкими мишенями для микроинъекций компонентов системы CRISPR/Cas9. Показано, что эмбрионы FVB имеют более высокую выживаемость после микроинъекции по сравнению с гибридами F1 C57Bl/6 х CBA. С целью получения максимального количества яйцеклеток был оптимизирован процесс гормональной стимуляции самок мышей для суперовуляции. Оптимизированы условия приготовления растворов для микроинъекций, повышающие скорость процесса микроинъекций и выживаемость яйцеклеток после микроинъекций. | ||
| 2 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Развитие технологии редактирования генома мышей |
| Результаты этапа: Выбрана, освоена и оптимизирована методология криоконсервации эмбрионов мышей на стадии оплодотворенных яйцеклеток, а также процедура оживления (размораживания) эмбрионов из глубокой заморозки с сохранением их жизнеспособности и генетического статуса линии. Усовершенствованная методология базируется на современной технологии витрификации Ориджио (CooperSurgical Company, США), разработанной для криоконсервации ооцитов, эмбрионов и бластоцист человека. Использование разработанного протокола криоконсервации эмбрионов мышей обеспечивает сохранность линий мышей с измененным геномом в течение длительного времени. Освоение технологии оживления криосохраненных эмбрионов позволяет восстанавливать линии мышей с сохранением их генетического статуса. Полученный результат является практически значимым, поскольку помимо длительного хранения, существенно упрощается транспортировка линий мышей с измененным геномом, что в результате приводит к значительному снижению стоимости их содержания, так как в настоящее время приходится поддерживать и размножать значительное число линий мышей. | ||
| 3 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Развитие технологии редактирования генома мышей |
| Результаты этапа: В ходе выполнения третьего этапа работы в соответствии с плановым заданием были разработаны подходы к созданию мышиной модели, пригодной для исследования патогенеза COVID-19 и испытания препаратов против SARS-CoV2. С этой целью были созданы две генетических конструкции, кодирующие рецептор короновируса SARS-CoV2 белок ACE2 человека (hACE2), а также проведено их встраивание в геном мыши с использованием технологии геномного редактирования CRISPR/Cas9. В результате экспериментов по генетическому редактированию было установлено, что обе эти конструкции встраиваются в геном мыши. Использование конструкции, содержащей между сильным промотором и геном hACE2 сигнал полиаденилирования, окруженный loxP-участками, позволило индуцировать экспрессию hACE2 тканеспецифично, в тех тканях, где экспрессируется ген Cre рекомбиназы. С использованием этой конструкции в рамках совместной работы с учеными из ИБГ РАН была создана линия мышей, гуманизированных по гену hACE2. Таким образом, в результате проведенного за отчетный период исследования была создана линия мышей, пригодных для использования в качестве модели для изучения механизма патогенеза COVID-19 и доклинических испытаний потенциальных антикоронавирусных препаратов. | ||
| 4 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Развитие технологии редактирования генома мышей |
| Результаты этапа: В соответствии с плановым заданием на четвертом этапе работы была выбрана, освоена и оптимизирована технология трансцервикального переноса бластоцист mNSET™ (mice Non-Surgical Embryo Transfer device, ParaTechs Corporation, USA). Оптимизация технологии включала использование двухсоставного катетера, системы локального освещения, кратковременного ингаляционного изофлуранового наркоза, а также гибкой трубки с фильтром на конце для выдувания оператором раствора с бластоцистами. Проведено тестирование усовершенствованной системы. Разработанная в ходе выполнения работы оптимизированная технология была использована для трансцервикального переноса бластоцист самки мыши с последующим успешным рождением потомства. Предложенная оптимизированная технология трансцервикального переноса будет востребована при создании новых линий мышей с измененным геномом, когда необходимо реализовать перенос эмбрионов на стадии бластоцист непосредственно в маточные трубы суррогатной мыши-матери. Полученный результат является практически значимым и может быть использован при проведении исследований в рамках научного сотрудничества с другими подразделениями МГУ и научными организациями. Отдельным этапом работы было изучение механизма сборки митохондриальных рибосом человека на стадии преинициации трансляции. Исследовали рибосомы из генетически отредактированных клеток, в которых ключевые метилтрансферазы были инактивированы. В ходе этой работы с помощью криоэлектронной микроскопии с разрешением 2,8–3,2 Å были определены структуры стабильных промежуточных соединений и комплексов, сформированных в процессе преинициации трансляции малой субъединицей миторибосомы человека SSU и шестью специфическими митохондриальными белками: фактором сборки RBFA, метилтрансферазами TFB1M и METTL15, периферическим миторибосомальным белком mS37 и митохондриальными факторами инициации трансляции mtIF2 mtIF3. Полученная за отчетный период информация о сборке и пространственной организации миторибосомы человека на стадии преинициации трансляции позволила создать модель взаимодействия миторибосомных компонентов в функционирующей миторибосоме. Результаты этой работы могут быть использованы для понимания процессов развития патологий, связанных с дисфункцией миторибосом человека, и смогут найти применение при разработке лекарственных препаратов для лечения таких заболеваний, а также дать дополнительную информацию, полезную для разработки новых антибиотиков. | ||
| 5 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Развитие технологии редактирования генома мышей |
| Результаты этапа: В соответствии с плановым заданием на пятом этапе работы была освоена и адаптирована технология криоконсервации спермы мышей с измененным геномом с последующим размораживанием и искусственным оплодотворением мышиных яйцеклеток. Работа включала мониторинг научной литературы и внедрение освоенной технологии в регулярную практику. В ходе эксперимента в качестве мышей-доноров яйцеклеток были задействованы самки-доноры гибридов первого поколения мышиных инбредных линий С57Bl/6 и CBA (F1 С57BL/6/CBA), из которых после гормональной стимуляции выделяли ооциты. В качестве доноров спермы использовали самцов F1 С57BL/6/CBA. В результате выполнения работы был подобран оптимальный состав среды для криоконсервации и концентрация антиоксиданта, адаптирована методика криоконсервации спермы, ее размораживания и последующего искусственного оплодотворения (ЭКО). Было продемонстрировано, что в подобранных оптимальных условиях эффективность оплодотворения, а также выживаемость зигот и их развитие до стадии бластоцист составляют 88% и 85%, соответственно, что достоверно не отличается от аналогичных результатов ЭКО со свежей не криоконсервированной спермой (88% и 86%, соответственно). Технология криоконсервации спермы мышей с измененным геномом, освоенная в ходе выполнения плановых работ пятого этапа, будет востребована для надежного сохранения генофонда линий трансгенных и нокаутных мышей в нашем институте с последующим их восстановлением в любое время при необходимости дальнейшего изучения, в том числе и с использованием в будущем новых более современных методов получения и анализа экспериментальных данных. Полученный результат является практически значимым и может быть использован при проведении исследований в рамках научного сотрудничества с другими подразделениями МГУ и научными организациями. За отчетный период были также суммированы и проанализированы самые современные сведения о митохондриальных заболеваниях, вызванных мутациями в ядерных генах, и разработанных к ним животных моделях. Использование мутантных животных моделей открывает новые возможности в исследовании функций генов, кодирующих митохондриальные белки, молекулярных механизмов возникновения и развития митопатологий, что необходимо для усовершенствования диагностики и разработки подходов к лекарственной терапии. | ||
| 6 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Развитие технологии редактирования генома мышей |
| Результаты этапа: | ||
| 7 | 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. | Развитие технологии редактирования генома мышей |
| Результаты этапа: | ||
| 8 | 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. | Развитие технологии редактирования генома мышей |
| Результаты этапа: | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".