ИСТИНА

Настоящий проект направлен на решение актуальной и фундаментальной проблемы молекулярной медицины – механизмы повреждения и защиты нейронов мозга при ишемии/гипоксии. Патологии мозга – ишемия, инсульт, травма, нейрогенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона) в странах с высоким и средним уровнем жизни вышли на второе место по летальности и прочно заняли первое место по инвалидности и потере трудоспособности. В настоящем проекте будет проверена гипотеза о том, что глутаматная эксайтотоксичность индуцирует реактивный астроглиоз, как фактор усугубляющий поражение нейронов. Известно, что глутаматная эксайтотоксичность - это один из ведущих патогенетических механизмов при церебральной ишемии, черепно-мозговой травмы и нейродегенеративных заболеваниях, связанный с активацией глутаматных рецепторов, в частности, NMDA рецепторов, и запуском внутриклеточных сигнальных каскадов, приводящих к гибели нейронов. Однако, подавляющее большинство исследований было проведено на культуре нейронов, и существуют только неполные и противоречивые данные, указывающие на возможную роль астроцитов в этом процессе. Настоящее исследование направлено на изучение нейро-астроцитарных взаимодействий в условиях глутаматной эксайтотоксичности, в том числе выделения АТФ нейронами, астроцитами и последующей активации ионотропных P2X7 рецепторов (Р2х7R) внеклеточным АТФ и индукции реактивного астроглиоза. Будет изучено, как глутамат- и OGD (кислородно-глюкозная депривация) -индуцируемые внутриклеточные изменения (Са2+, рН, митохондриальная дисфункция, митохондриальный потенциал, изменения метаболизма) связаны с нейро-астроцитарными взаимодействиями и активацией астроглиоза, а также будет иследовано влияние ингибирования реактивного астроглиоза при глутаматной эксайтотоксичности как нового подхода к защите нейронов от поражения. Конкретные задачи исследования: 1. Изучить временные и дозовые зависимости изменений содержания внеклеточного АТФ при глутаматной эксайтотоксичности на смешанных астроцитарно-нейрональных культурах коры головного мозга. 2. Исследовать влияние внеклеточного АТФ, активации Р2х7 рецептора на выживаемость, изменения ионного гомеостаза и на экзоцитоз глутамата и экспрессию глиального фибринального кислого белка (GFAP) и S100b в первичных культурах астроцитов коры головного мозга. 3. Выявить значение митохондриальных изменений в активации астроглиоза в первичных культурах нейронов при глутаматной эксайтотоксичности и кислородно-глюкозной депривации (OGD). 4. Оценить влияние ингибирования астроглиоза на выживаемость нейронов, ионный гомеостаз и функции митохондрий при глутаматной эксайтотоксичности и OGD. Исследование будет выполнено на астроцитах и смешанных культурах нейронов и астроцитов (разное количество последних) с использованием современных методов исследований, включая биохимические и иммуноцитохимические методы исследований, вестернблотт, флуоресцентную микроскопию, а также исследования метаболизма (скорость поглощения кислорода клетками коры головного мозга или гиппокампа, гликолиз). Полученные результаты будут опубликованы в ведущих отечественных и зарубежных научных журналах и представлены на конференциях как в России, так и за рубежом.

The project aims to study the actual and fundamental problem of molecular medicine - the mechanisms of damage and protection of brain neurons in ischemia / hypoxia. Pathologies of the brain - ischemia, stroke, trauma, neuroregenerative diseases (Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy) in the countries with high or middle standard of living took second place in lethality and firmly occupied first place in disability. In this project, the hypothesis that glutamate excitotoxicity induces reactive astrogliosis as a factor aggravating neuronal damage will be tested. It is known that glutamate excitotoxicity is one of the leading pathogenetic mechanisms in brain ischemia, brain traumatic injury and neurodegenerative diseases associated with activation of glutamate receptors, in particular, NMDA receptors, and triggering intracellular signaling cascades leading to neuronal death. However, the overwhelming majority of studies have been carried out on the culture of neurons, and there are only incomplete and contradictory data indicating on the possible role of astrocytes in this process. The present study is aimed to study a neuro-astrocytic interaction in conditions of glutamate excitotoxicity, including the release of ATP by neurons, astrocytes and subsequent activation of ionotropic P2X7 receptors (P2x7R) by extracellular ATP and induction of reactive astrogliosis. It will be studied how glutamate and OGD (oxygen-glucose deprivation) -induced intracellular changes of Ca2 +, pH, mitochondrial dysfunction (mitochondrial potential, metabolic changes) are associated with neuro-astrocytic interactions and astrogliosis activation, and the effect of inhibition of reactive astrogliosis with glutamate excitotoxicity as a new approach to protecting neurons from injury. Specific objectives of the study: 1. To study temporal and dose dependences of changes in the content of extracellular ATP for glutamate excitotoxicity on mixed astrocytic-neuronal cultures of the cerebral cortex. 2. To investigate the effect of extracellular ATP, activation of the P2x7 receptor on survival, changes in ion homeostasis and glutamate exocytosis, and expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and S100b in primary cultures of astrocytes in the cerebral cortex. 3. To determine the significance of mitochondrial changes in the activation of astrogliosis in primary cultures of neurons with glutamate excitotoxicity and oxygen-glucose deprivation (OGD). 4. To evaluate the effect of astrogliosis inhibition on neuronal survival, ion homeostasis, and mitochondrial functions for glutamate excitotoxicity and OGD. The study will be performed on astrocytes and mixed cultures of neurons and astrocytes (different amounts of the latter) using modern research methods, including biochemical and immunocytochemical methods of research, western blot, fluorescence microscopy, and metabolic studies (oxygen consumption rate in cells of the cerebral cortex or hippocampus, glycolysis). The results will be published in leading domestic and foreign scientific journals and presented on conferences both in Russia and abroad.

Цель исследования: Изучение механизмов влияния астроцитов на повреждение нейронов коры головного мозга при гиперактивации глутаматных рецепторов и OGD, оценив при этом роль АТФ/Р2х7 R сигнализации в активации астроглиоза. Конкретные задачи исследования: 1. Изучить временные и дозовые зависимости изменений содержания внеклеточного АТФ при глутаматной эксайтотоксичности на смешанных астроцитарно-нейрональных культурах коры головного мозга. 2. Исследовать влияние внеклеточного АТФ, активации Р2х7 рецептора на выживаемость, изменения ионного гомеостаза и на экзоцитоз глутамата и экспрессию глиального фибринального кислого белка (GFAP) и S100b в первичных культурах астроцитов коры головного мозга. 3. Выявить значение митохондриальных изменений в активации астроглиоза в первичных культурах нейронов при глутаматной эксайтотоксичности и кислородно-глюкозной депривации (OGD). 4. Оценить влияние ингибирования астроглиоза на выживаемость нейронов, ионный гомеостаз и функции митохондрий при глутаматной эксайтотоксичности и OGD.

Проведенные нами исследования позволили во многом впервые показать, что индуцированная глутаматом отсроченная кальциевая дисрегуляция (ОКД) и синхронная с ней сильная митохондриальная деполяризация (МД) в нейронах in vitro являются результатом патогенных изменений внутриклеточных концентраций Са2+, Na+, Н+, АТФ, NAD(P)H, потенциалов митохондриальной и плазматической мембраны (Установлено, что причиной развития ОКД являются процессы, снижающие митохондриальный синтез АТФ и способность митохондрий захватывать и удерживать Са2+. Эндогенными факторами ускорения ОКД являются: усиление потребления NADH и разобщение окислительного фосфорилирования; активация фосфолипаз А2 (PLA2), приводящая к высвобождению арахидоновой кислоты, способной снижать эффективность работы протонных насосов; активация фермента поли(АДФрибоза)полимеразы-1 (ПАРП-1), расходующего NAD+ на репарацию ДНК и вызывающего дефицит NADH. Ингибиторы PLA2 и ПАРП-1 задерживают наступление ОКД. Установлена важная роль альфакетоглутарат дегидрогеназы в развитии ОКД (Bunik et al, 2010). Показано, что глутамат вызывает нарушение клеточного метаболизма, вызывая снижение скорости поглощения кислорода, максимального дыхания, скорости гликолиза, при этом инсулин защищает нейроны и увеличиывет эти показатели (Красильникова, Пинелис и соавт., 2017). Таким образом, результаты наших исследований показали, что культивируемые нейроны, в которых возникла ОКД, гибнут в результате апоптоза и некроза, причем вероятность смерти от некроза тем выше, чем длительнее фаза высокого [Ca2+]i плато (Сурин, Пинелис и соавт., 2014) . Имеется опыт по изучению механизмов действия нейропептидов при глутаматной нейротоксичности в содружестве с группой акад. Н.Ф. Мясоедова (ИМГ, РАН). Мы впервые показали, что семакс и некоторые его аналоги защищают нейроны, отодвигая начало ОКД и уменьшая количество нейронов с ОКД (Сторожевых и соавт., 2007; Bezuglov et al, 2015).

В 2018 г. будут получены: (1) данные об изменениях содержания внеклеточного АТФ в культуре астроцитов и нейро-астроцитарных культурах в нормальных условиях и при токсическом действии глутамата и OGD. Будут изучены изменения уровня внеклеточного АТФ при дозовой и временной стимуляции глутаматом в смешанных нейро-астроцитарных культурах коры головного мозга. (2) данные о выживаемости, об особенностях изменения внутриклеточного кальция, натрия и рН, выделения астроцитами глутамата, экспрессии белков GFAP, S100b, маркеров астроглиоза, а также изменения метаболизма в первичной культуре астроцитов коры головного мозга, обработанных различными дозами АТФ или его метаболита. (3) результаты статистического анализа полученных данных, которые будут использованы в будущих публикациях и подготовлен промежуточный отчет.