ИСТИНА

Проект направлен на фундаментальные, но малоизученные аспекты метилирования ДНК у млекопитающих ДНК-метилтрансферазой Dnmt3a: создание и разработку ингибиторов фермента, исследование влияния противораковых препаратов на функционирование Dnmt3a и определение механизма действия мутантных форм Dnmt3a, найденных при раке. Планируется провести реактивацию некоторых генов с использованием ранее полученных ненуклеотидных ингибиторов Dnmt3a – димерных бисбензимидазолов, а также исследовать ингибиторные свойства новых нуклеозидных аналогов, встроенных в ДНК. Полученные в проекте данные внесут вклад в развитие эпигенетической противоопухолевой терапии, расширят понимание природы цитотоксичности противораковых препаратов и позволят сделать предположения о вкладе мутаций в Dnmt3a в онкогенез и прогрессирование опухолей.

The project aims to examine fundamental aspects of DNA methylation in mammals by DNA methyltransferase Dnmt3a: the creation and development of enzyme inhibitors, study the effect of anti-cancer drugs on the Dnmt3a functioning and determining the mechanism of action of Dnmt3a mutants, found at cancer.It is planned to hold a reactivation of certain genes with previously constructed non-nucleotide inhibitors of Dnmt3a - dimer bisbenzimidazoles, and explore the inhibitory properties of novel nucleoside analogue, embedded in the DNA. The results obtained in the project will contribute to the development of epigenetic anti-cancer therapy, expand the understanding of the nature of cytotoxicity of anticancer drugs and will make assumptions about the contribution of mutations in Dnmt3a in oncogenesis and tumor progression.

Успешное использование димерных бисбензимидазолов,DBP(n), для ингибирования Dnmt3a позволит осуществить реэкспрессию генов, «молчащих» в раковых клетках. В плане поиска новых ингибиторов Dnmt3a впервые будет опробован нуклеозидный аналог, пирроло-dC, действие которого не связано с блокированием стадии образования ковалентного интермедиата реакции метилирования. Впервые при изучении цитотоксичности противораковых препаратов (на примере тиогуанина) будет рассматриваться вопрос об эпигенетической составляющей их действия – влиянии на функционирование МТазы Dnmt3a в клетке. Полученные результаты позволят расширить понимание природы цитотоксичности противораковых препаратов на основе тиопурина in vivo и ответить на вопрос, может ли sG, внедренный в ДНК, нарушать (хотя бы частично) эпигенетический путь регуляции генов. Будут получены данные о механизмах, которые объяснили бы вклад мутаций в Dnmt3a в развитие опухолей. Мы планируем ответить на вопросы, сохраняется или изменяется каталитическая активность у выбранных мутантных форм Dnmt3a-CD и какие стадии метилирования могут быть при этом нарушены.

Нами накоплен большой многолетний опыт в изучении МТаз: получение конструктов и выделение ферментов, исследование механизма метилирования и ингибирования, изучение ДНК-белковых контактов, разработка методики анализа метилирования, аффинная модификация аналогами субстратов, моделирование структуры комплекса МТаза-ДНК, сайт-направленный мутагенез МТаз. Написаны обзоры по прокариотическим МТазам и ингибированию эукариотических МТаз. Детально охарактеризованы серии димерных бисбензимидазолов DB(n) и DBP(n): показана их способность ингибировать в микромолярных количествах реакцию метилирования 30-звенного ДНК-субстрата, проникать в нормальные м раковые клетки. В рамках предыдущего гранта (13-04-00727) начато исследование влияния SG на работу МТазы Dnmt3a. Было показано, что включение SG в CpG-сайт рядом с метилируемым цитозином приводит к снижению уровня метилирования. Было высказано предположение, что этот эффект обусловлен нарушением контакта Dnmt3a-CD с 6-оксогруппой гуанина. Разработан подход определения функциональной значимости отдельных аминокислот в функционировании МТаз, который мы применили в случае M.SssI (Darii et al, 2009) и в случае Dnmt3a (в предыдущем проекте РФФИ). Этот подход будет использован для изучения мутантных форм Dnmt3a, найденных при раковых заболеваниях.