| 1 |
29 ноября 2018 г.-31 декабря 2018 г. |
исследований. Экспериментал ьные исследования по анализу мышиных моноклональны х антител к белку PRAME и конструирован ию гуманизирован ных аналогов |
| Результаты этапа: В результате выполнения этапа № 1 работ по Соглашению о субсидии от 29 ноября 2018 г. № 075-02-2018-256 на тему "Разработка комплексного подхода для терапии онкологических заболеваний на основе гуманизированных антител к универсальному опухолевому антигену PRAME и CAR-T технологии" проведен аналитический обзор информационных источников по теме проекта, выбрано направление исследований, разработан План экспериментальных исследований, направленный на получение гуманизированных антител к белку PRAME и CAR-цитотоксических клеток, проведены патентные исследования по теме проекта и составлен отчет о патентном поиске.
Обобщая рассмотренные информационные источники, полученные за последнее время, проведенный анализ подтверждает актуальность и научную новизну выбора объектов исследования, а также способов реализации задач проекта. По результатам проведения патентных исследований установлено, что объект исследования по ПНИ может быть объектом для патентования.
В экспериментальной части работ проведены исследования цитотоксической противоопухолевой активности мышиных моноклональных антител к белку PRAME. С помощью MTT-теста на различных клеточных опухолевых линиях была исследована панель из 11 мышиных мАТ к белку PRAME. По результатам исследования для дальнейшей работы в качестве кандидатов для создания гуманизированных антител и CAR-цитотоксических клеток на их основе было отобрано два мАТ, 5D3 и 6H8. Проведен молекулярно-генетический анализ отобранных антител. Амплифицированы и выделены фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные домены легких и тяжелых цепей кандидатных моноклональных антител. На основе полученных нуклеотидных последовательностей вариабельных доменов кандидатных мышиных мАТ было проведено конструирование химерных аналогов моноклональных антител к белку PRAME. была разработана система экспрессии химерных аналогов моноклональных антител к белку PRAME. Были получены экспрессионные векторы на основе плазмиды pcDNA3.4, кодирующие легкие и тяжелые цепи химерных мАТ 6H8 и 5D3.
Проведены наработка и очистка лабораторных образцов химерных аналогов химерных аналогов моноклональных антител 6H8 и 5D3 к белку PRAME для решения задач проекта в количестве 17,9 и 12,8 мг, соответственно, после очистки выход химерных аналогов мАТ 6H8 и 5D3 по сравнению с целевыми белками, содержащимися в среде культивирования, составил 76,8% и 78%, соответственно.
Было проведено исследование экспрессии гена PRAME и белка PRAME опухолевыми линиями К562, Mel Hn, Mel Ibr, Mel Mtp, Mel P, Mel Si, U937, THP-1, а также клетками WI-38, транфицированными плазмидой, кодирующей белок PRAME. Было показано, что в клетках различных опухолевых человека (К562, U937, THP-1), эспрессирующих ген PRAME на высоком уровне, также детектируется экспрессия белка.
Был проведен иммуногистохимический анализ с использованием мышиных мАТ 5D3 и 6H8 к белку PRAME. Из проведенных исследований можно заключить, что в клетках опухолевых линий, а так же в клетках костного мозга больных острыми лейкозами белок PRAME расположен как внутри клеток (в ядре и цитоплазме), так и на поверхности цитоплазматической мембраны.
Был осуществлен химико-ферментативный синтез вариабельных фрагментов гуманизированных антител к белку PRAME 5D3-Hu и 6H8-Hu. С использованием полученных ДНК-фрагментов вариабельных доменов антител к белку PRAME. было произведено конструирование экспрессионных плазмид для получения гуманизированных антител к белку PRAME. Данные экспрессионные векторы будут использованы на следующих этапах проекта для экспрессии гуманизированных рекомбинантных антител 6H8-Hu и 5D3-Hu к белку PRAME в клетках млекопитающих, в частности в клетках CHO (клетки яичников китайского хомяка) методом транзиентной экспрессии, что позволит наработать лабораторные образцы гуманизированных антител для дальнейшего исследования их противоопухолевой активности и иммунохимических свойств.
Все работы 1-го этапа выполнены в полном объеме в соответствии с требованиями Технического задания и Плана-графика исполнения обязательств. |
| 2 |
1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. |
Разработка системы экспрессии гуманизированных антител и получение CAR- цитотоксических клеток |
| Результаты этапа: В ходе второго этапа ПНИ были наработаны лабораторные образцы различных вариантов гуманизированных антител, был проведен анализ противоопухолевой активности различных вариантов гуманизированных антител in vitro на различных клеточных моделях, в том числе с использованием мышиной меланомы B16F10 с искусственно введенной в неё генетической конструкцией, экспрессирующей ген PRAME человека, на различных линиях меланомы человека (MelKor, MelIbr, MelZ), на линиях лейкозов человека NOMO1, THP1, K563, на линиях сарком и карцином человека. В ходе работы было проведено конструирование системы экспрессии гуманизированного антитела-кандидата, разработан лабораторный технологический регламент получения гуманизированных антител, были получены генетические конструкции для экспрессии CAR, распознающих белок PRAME, а также был разработан лабораторный технологический регламент получения CAR-цитотоксических клеток. Также была разработана методика количественной оценки цитотоксической противоопухолевой активности гуманизированных антител к белку PRAME in vivo и методика ускоренного получения цитотоксических клеток, экспрессирующих CAR и CD20. Были наработаны экспериментальные образцы различных вариантов CAR-цитотоксических клеток, получена стабильная клеточная линия-продуцент гуманизированных антител к белку PRAME, была проведена селекция клонов-суперпродуцентов гуманизированных антител к белку PRAME, разработана методика количественной оценки нейтрализующей активности гуманизированных антител к белку PRAME in vitro, разработана методика количественной оценки цитотоксической активности CAR-цитотоксических клеток in vitro, была проведена наработка экспериментального образца гуманизированного антитела к белку PRAME, был проведен аналитический контроль качества экспериментального образца гуманизированного антитела к белку PRAME, оптимизация процесса культивирования клеточной линии-продуцента гуманизированных антител, был разработан план и проведены экспериментальные исследования биологической активности экспериментальных образцов гуманизированных антител к белку PRAME и CAR-цитотоксических клеток, была исследована биологическая противоопухолевая активности экспериментальных образцов гуманизированных антител к белку PRAME на клеточных моделях in vitro, исследована биологическая противоопухолевая активности экспериментальных образцов гуманизированных антител к белку PRAME на клеточных моделях in vivo, был проведен сравнительный анализ противоопухолевой активности экспериментальных образцов различных вариантов CAR-цитотоксических клеток в экспериментах in vitro на PRAME-экспрессирующих линиях опухолевых клеток человека, неопухолевых линиях, трансфицированных геном PRAME, и нетрансфицированных неопухолевых PRAME-негативных линиях, было проведено исследование противоопухолевой активности экспериментальных образцов CAR-цитотоксических клеток в экспериментах in vivo, было проведено исследование противоопухолевой активности комбинации гуманизированных антител к белку PRAME и CAR-цитотоксических клеток в экспериментах in vivo, были проведены маркетинговые исследования. |
| 3 |
1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. |
Исследование биологической активности гуманизированных антител к PRAME и CAR- цитотоксических клеток |
| Результаты этапа: |
