ИСТИНА

Представленный проект направлен на изучение механизмов функционирования рецепторов, активируемых протеазами (protease-activated receptors, ПАР) в условиях глутаматной эксайтотоксичности. В последнее десятилетие большое внимание уделяется бета-аррестинам, которые обеспечивают не только интернализацию и инактивацию рецепторов, но и участвуют в запуске внутриклеточного сигналинга. Нарушение мозговых функций в результате инсультов, травм и развития нейродегенеративных заболеваний в своем анамнезе содержат повреждение нейронов мозга в результате эксайтотоксичности, вызванной высокими концентрациями глутамата. Как показано ранее, агонисты ПАР. обладают протекторным действием. В ходе выполнения проекта будет изучено участие бета-аррестинов 1 и 2 типа в протекторном действии агонистов ПАР, активированного протеина С, фактора Ха и низких концентраций тромбина. Будет исследовано вовлечение бета-аррестинов в развитие токсичности, вызванной Glu и оценен тип бета-аррестинов и глутаматергических рецепторов, коррекция активности которых обеспечивает протекторное действие агонистов ПАР. В результате выполнения проекта будет сформирована концепция участия бета-аррестинов в развитии глутаматной эксайтотоксичности и аррестин-зависимом механизме протекторного действия агонистов ПАР. Полученные данные о новых аспектах механизма нейропротекторного действия агонистов ПАР позволят не только расширить представления о защитном действии протеаз, но и могут послужить основой для разработки новых подходов к терапии повреждений мозга, учитывающих аррестин-зависимые внутриклеточные процессы.

The presented project is aimed at studying the mechanisms of functioning of protease-activated receptors (PARs) in conditions of glutamate excitotoxicity. In the last ten years, much attention has been paid to beta-arrestins, which not only provide internalization and inactivation of receptors, but also participate in the induction of intracellular signaling. Disruption of brain functions as a result of strokes, trauma and development of neurodegenerative diseases, contain damage to brain neurons as a result of excitotoxicity caused by high concentrations of glutamate. As shown earlier, PAR agonists have a protective action. In the course of the project, the participation of beta-arrestins of type 1 and type 2 in the protective action of PAR agonists, activated protein C, factor Xa and low concentrations of thrombin will be studied. The involvement of beta-arrestins in the development of Glu-induced toxicity will be investigated and the type of beta-arrestin and glutamatergic receptors, whose activity provide the protective effect of PAR agonistsis will be study. As a result of the project, the concept of participation of beta-arrestins in the development of glutamate excitotoxicity and the arrestine-dependent mechanism of the protective action of the PAR agonists will be formed. The obtained data on new aspects of the mechanism of neuroprotective action of PAR agonists will allow not only to broaden the understanding of the protective action of proteases, but also can serve as a basis for developing new approaches to the therapy of arrestine-dependent brain injuries.

В результате проведенных исследований будут получены следующие основные результаты: Впервые будет проанализировано участие адапторных белков – бета-аррестинов, в нейропротекторном действии агонистов ПАР. Будет дан сравнительный анализ участия бета-аррестина-2 в защитном действии агонистов ПАР - активированного протеина С (АПС), фактора Ха и низких концентраций тромбина в условиях глутаматной эксайтотоксичности. Комплексный анализ состояния нейронов в условиях дефицита бета-аррестина-2 и избирательной активации (или блокады) определённых типов глутаматергических рецепторов, позволит оценить вклад данного адапторного белка в нейротропный эффект каждого из исследуемых типов рецепторов Glu. Будут получены новые данные о сигнальной функции бета-аррестина как «переключателя» эффекта агонистов ПАР с нейродегенеративного на нейропротекторный характер действия. В рамках данного проекта будут полученные данные об участии бета-аррестинов-1 и -2 типа в АПС-зависимой регуляции активации NF-kBp65 в нейронах при глутаматной токсичности. В условиях токсического действия Glu на нейроны также впервые будет охарактеризовано влияние бета-аррестина-2 на соотношение про- и анти-апоптотических белков при протекторном действии протеаз гемостаза (АПС, тромбина и фактора Ха). Будут получены данные о вовлечении бета-аррестина-2 в регуляцию кальциевого гомеостаза и функций митохондрий в нейронах в условиях глутаматной эксайтотоксичности. Использование современных приемов и методических подходов, позволит получить уникальные сведения о регуляции экспрессии бета –аррестинов-1 и -2 типа агонистами рецепторов Glu и ПАР. Таким образом, в ходе выполнения проекта будет сформировано представление о вовлечении бета-аррестинов в регуляторные процессы нейронов, контролируемые активацией разных типов рецепторов Glu и специфическими рецепторами протеаз гемостаза - ПАР. Раскрытие механизмов протекторного действия протеаз в условиях эксайтотоксичности позволит существенно повысить действие как уже имеющихся нейропротекторных препаратов, так и разработать на основе представленных новых данных новые средства, корректирующие внутриклеточный сигналинг через регуляцию бета-аррестинов.

К настоящему времени в ходе работ нашей лаборатории по изучению влияния тромбина и АПС на функции нейронов при эксайтотоксичности [Киселева и др., 2004; Струкова и др., 2004; Strukova et al., 2007; Gorbacheva, 2008; Gorbacheva et al., 2010] было показано, что: 1. Протеазы гемостаза в зависимости от концентрации могут вызывать как протекторное, так и повреждающее действие на клетки нервной системы. Тромбин, и АПС в узком диапазоне низких концентраций (ниже 10 нМ), не достаточных для участия в процессах свертывания крови, защищают гиппокампальные и кортикальные нейроны от гибели, вызванной высокими концентрациями глутамата. Высокие концентрации протеаз вызывают гибель нейронов, сопоставимую с действием токсических концентраций глутамата. 2. Тромбин защищает гиппокампальные и кортикальные нейроны от глутаматной эксайтотоксичности через ПАР1. Два рецептора — EPCR и ПАР1 необходимы для нейропротекторного действия АПС на нейроны мозга крыс при эксайтотоксичности. 3. Тромбин через ПАР1 вызывает быстрое и транзиторное увеличение внутриклеточного кальция в гиппокампальных и кортикальных нейронах механизмом, опосредуемым преимущественно через IРз-рецепторы эндоплазматического ретикулума. 4. Действие токсических концентраций глутамата и тромбина на нейроны гиппокампа вызывает транслокацию в ядро одной из субъединиц NF-кВ — NF-KBp65. Низкие концентрации протеаз стабилизируют цитоплазматический комплекс NF-кВ. АПС защищает нейроны от гибели, блокируя активацию NF-кВ в нейронах, вызванную токсическими воздействиями. 5. Протекторное действие протеаз на клетки мозга при повреждении и эксайтотоксичности позволяет отнести их к клеточным регуляторам физиологических и патофизиологических процессов. Таким образом, тромбин реализует свое нейропротекторное действие в узком диапазоне очень низких концентраций с участием ПАР1-рецепторов. Тогда как в других эффектах поливалентного тромбина, могут быть задействованы другие типы рецепторов тромбина ПАР1 и ПАР4 или ПАР3 и ПАР4.

В результате проведенных исследований будут получены следующие основные результаты: Впервые будет проанализировано участие адапторных белков – бета-аррестинов, в нейропротекторном действии агонистов ПАР. Будет дан сравнительный анализ участия бета-аррестина-2 в защитном действии агонистов ПАР - активированного протеина С (АПС), фактора Ха и низких концентраций тромбина в условиях глутаматной эксайтотоксичности. Комплексный анализ состояния нейронов в условиях дефицита бета-аррестина-2 и избирательной активации (или блокады) определённых типов глутаматергических рецепторов, позволит оценить вклад данного адапторного белка в нейротропный эффект каждого из исследуемых типов рецепторов Glu. Будут получены новые данные о сигнальной функции бета-аррестина как «переключателя» эффекта агонистов ПАР с нейродегенеративного на нейропротекторный характер действия. В рамках данного проекта будут полученные данные об участии бета-аррестинов-1 и -2 типа в АПС-зависимой регуляции активации NF-kBp65 в нейронах при глутаматной токсичности. В условиях токсического действия Glu на нейроны также впервые будет охарактеризовано влияние бета-аррестина-2 на соотношение про- и анти-апоптотических белков при протекторном действии протеаз гемостаза (АПС, тромбина и фактора Ха). Будут получены данные о вовлечении бета-аррестина-2 в регуляцию кальциевого гомеостаза и функций митохондрий в нейронах в условиях глутаматной эксайтотоксичности. Использование современных приемов и методических подходов, позволит получить уникальные сведения о регуляции экспрессии бета –аррестинов-1 и -2 типа агонистами рецепторов Glu и ПАР. Таким образом, в ходе выполнения проекта будет сформировано представление о вовлечении бета-аррестинов в регуляторные процессы нейронов, контролируемые активацией разных типов рецепторов Glu и специфическими рецепторами протеаз гемостаза - ПАР. Раскрытие механизмов протекторного действия протеаз в условиях эксайтотоксичности позволит существенно повысить действие как уже имеющихся нейропротекторных препаратов, так и разработать на основе представленных новых данных новые средства, корректирующие внутриклеточный сигналинг через регуляцию бета-аррестинов.