Исследование генетических основ уклоняющейся дорсовентральной полярности листа у мутантных и природных форм высших двудольных, обладающих унифациальными листьямиНИР

Genetical grounds of leaf dorsiventral polarity deviations in higher dicots with natural and mutant unifacial leaves

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 3 февраля 2016 г.-31 декабря 2016 г. Исследование генетических основ уклоняющейся дорсовентральной полярности листа у мутантных и природных форм высших двудольных, обладающих унифациальными листьями
Результаты этапа: I. Анатомические исследования 1. Изучено развитие бифациального чрешкового листа у Curio (Senecio) articulates. С этой целью были отработаны оптимальные методы подготовки материала для сканирующей электронной микроскопии, а также фиксации, подготовки и изготовлении препаратов серийных микротомных срезов терминальных почек для световой микроскопии, подготовлен и зафиксирован биологический материал для анализа, полученный из Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН. Установлено, что листовой зачаток возникает как параболоидный бугорок едва уплощенный на стороне, обращенной к апексу, что можно рассматривать как слабые признаки начала формирования у него бифациальной структуры. Однако примордий целиком сложен однотипными мелкими невакуолизированными клетками. На следующей стадии развития он удлиняется, округляется в поперечном сечении и становится полностью унифациальным. Верхушка листового примордия становится морфогенетически инертной, а продольный рост его локализуется в базальной части. В ходе этого роста примордий приобретает треугольное очертание поперечного сечения с основанием, обращенным к апексу, и тупые, но хорошо заметные края, разделяющие адаксиальную и абаксиальную стороны; зачаток становится на большем протяжении бифациальным, но его морфогенетически инертная верхушка остается унифациальной. По краям зачатка дифференцируется маргинальная меристема, формирующая зачатки полупластинок листа. Адаксиальные производные этой меристемы дифференцируются в водоносную паренхиму и палисадную хлоренхиму, а абаксиальные – в губчатую хлоренхиму, в результате чего внешняя бифациальность листа дополняется бифациальностью его гистологической организации. В нижней части формирующейся листовой пластинки в результате локального усиления функционирования маргинальной меристемы возникают лопасти, в целом сохраняющие бифациальное внешнее и внутреннее строение, но их верхушки утрачивают признаки бифациальности и становятся подобными унифациальной верхушке всего листа. Таким образом, лист Curio articulatus в своем развитии проходит стадию унифациального примордия и проявляет локальный переход от бифациальной структуры к унифациальной в верхушках развивающихся лопастей. 2. Проведено гистологическое изучение листа растений дикого типа и мутанта tae A. thaliana. Исследовано строение эпидермы с абаксильной и адаксиальной стороны методами световой и сканирующей микроскопии. Показаны существенные различия в строении эпидермы в листьях мутанта и растений дикого типа. На адаксиальной стороне листа у мутанта выявлены вкрапление клеток, по форме и размерам подобные эпидермальным клеткам абаксиальной стороны листа, что указывает на нарушение дорсовентральной полярности. Кроме того, показано, что часть выростов листа, характерных для мутанта tae, имеет щитовидную или игольчатую форму, что также указывает на сбой программы поляризации при развитии выростов. 3. Были начаты также анатомические исследования морфогенеза листа у растений Arabidopsis thaliana дикого типа и мутанта tae. Анализ проводили по всем системам тканей листовой пластинки. Показано, что листья мутанта tae обладают дорсовентральным строением, проявляющимся в расположении проводящих тканей в коллатеральных проводящих пучках и наличии палисадного и губчатого мезофилла. Не было обнаружено и отличий в строении адаксиальной и абаксиальной эпидермы. В то же время, листовая пластинка мутанта истончается к краям значительно сильнее, чем у листьев растений дикого типа. Таким образом, предположение о нарушении дорсовентральной разметки листа у данных мутантов, основанное на изучении поверхности эпидермы под сканирующим электронным микроскопом, не подтверждено полученными нами анатомическими данными. 4. Помимо исследования дорсовентральной полярности листовых пластинок нами было начато исследование анатомии лопастей листовой пластинки, развивающихся эктопически на ее абаксиальной и – реже – адаксиальной сторонах. В норме у A. thaliana на листьях формируются эпиламинарные структуры лишь одного типа – двулучевые (Мальпигиевы) трихомы. В их основании развиваются крупные пьедесталы, состоящие как из эпидермальных, так и из субэпидермальных клеток. Для мутантов tae характерно формирование необычных листоподобных эпиламинарных структур в основании листа и по краю листовой пластинки, преимущественно на адаксиальной стороне. При этом они могут достигать довольно крупных размеров и также покрыты двулучевыми трихомами. По большей части формирование листоподобных выростов коррелирует с расположением проводящих пучков. Нами было обнаружено формирование листоподобных выростов второго и, возможно, даже третьего порядка. В месте будущего развития выроста у обоих мутантов имеют место антиклинальные деления клеток субэпидермального слоя, что приводит к формированию очага меристематической активности. На ранних стадиях они анатомически чрезвычайно сходны с пьедесталами трихом. Выросты имеют четкие края и бифациальную природу, но субэпидермальная ткань представлена массивом однотипных клеток, более или менее подобных клеткам хлоренхимы соответствующией стороны листовой пластинки. Однако по мере развития листоподобного выроста он в нем происходит восстановление дорсовентральной полярности, проявляющееся в дифференциации палисадного и губчатого мезофилла. II. Генетические исследования 5. Создан биологический материал Arabidopsis thaliana для картирования гена tae и анализа генных взаимодействий. Проведены скрещивания мутанта tae с растениями расы Columbia, а также c мутантами as1 и sa (аллель as2), у которых, согласно результатам ранее проведенных исследований, имеются изменения дорсовентральной поляризации листа, получены гибриды F1 и гибридные популяции F2. В популяции F2 от скрещивания с мутантами as1, sa отобраны одиночные и двойные мутации, необходимые для дальнейшего анализа генных взаимодействий в F3-F4 поколениях. Путем скрещиваний и отборов получены растения мутанта tae, несущие в геноме транскрипционно слитые (химерные) гены KN1::GUS и DR5::GUS. 6. Фенотипический анализ растений Arabidopsis thaliana мутанта tae подтвердил варьирующую экспрессивность фенотипа при неизменном генетическом фоне, точные причины которой пока не установлены. Семена, собранные с одного гомозиготного мутантного растения из чистой линии, прошедшей 5 возвратных скрещиваний на родительскую расу Blanes, при выращивании в один сезон, но с разницей посева в 3 недели иногда демонстрировали совершенно разную экспрессивность, хотя даже в условиях низкой экспрессивности мутанты можно отличить от растений дикого типа не по сужению листовой пластинки, а по наличию в розетке листьев с хорошо выраженной асимметрией. Частота выщепления растений мутантного фенотипа в F2 от скрещивания с расой Blanes также варьировала от 25% до 12%. Мы считаем, что дефицит мутантов может объясняться недоучетом части растений с низкой экспрессивностью мутантного признака при моногенном наследовании признака на фоне расы Blanes. Показано, что в F2 от скрещивания tae с линией Columbia частота выщепления растений мутантного фенотипа достоверно ниже (2,7%), чем ожидаемое при дигенности (6,3%). Однако эти различия могут быть вызваны как сниженной экспрессивностью мутантного признака, так и обнаруженной нами сниженной жизнеспособностью мутантных растений на этом генетическом фоне. 7. Проведен сравнительный анализ полиморфизма ресеквенированного генома расы Blanes (по данным из http://1001genomes.org/) относительно линии Columbia для создания маркеров для генотипирования мутации tae в условиях сниженной экспрессивности мутантного признака. Анализировали геном 2-ой хромосомы, поскольку именно в ней, согласно ранее полученным данным, локализована мутация tae. На основе выявленного полиморфизма созданы ДНК-маркеры и исследована их способность выявлять полиморфизм между ДНК мутанта tae и расой Columbia. Показано, что 3 кодоминантных ДНК-маркера – RLP26, RSA и PFA-DSP2 (табл. 1) выявляют полиморфизм фрагментов генов с соответствующими названиями по сайтам рестрикции (эндонуклеазы HpySE526I, RsaI и FaeI, соответственно) между мутантом tae и расами дикого типа (Blanes, Columbia, Dijon для RLP26; Blanes и Dijon для RSA; и Columbia и Dijon для PFA-DSP2). 8. Показано тесное сцепление маркера RLP26 (положение на физической карте 2-ой хромосомы соответствует 14024 тпн) с геном TAE с помощью типирования 15 растений мутантного фенотипа, отобранных в F2 о скрещивания с расой Columbia. Расстояние от гена TAE до маркера RLP26 составило менее 2сМ. Эти результаты подтверждают наши ранее полученные о локализации мутации tae на хромосоме 2 A.thaliana. Тот же маркер RLP26 был использован для проверки гипотезы о дигенности мутантного признака tae на генетическом фоне расы Columbia. С этой целью в F2 (tae х Col) были отобраны 33 растения дикого фенотипа, которые были генотипированы с использованием созданного маркера RLP26. Среди этой выборки выявлено 2 растения, показавшие гомозиготность по аллелю RLP26, сцепленному с мутацией tae. Следовательно, гомозиготность только по одной мутации из хромосомы 2, которую мы назвали tae, не вызывает появление мутантного фенотипа на фоне расы Columbia. По-видимому, фенотип tae является результатом взаимодействия рецессивных аллелей двух полимерных генов, один из которых (ген tae) по нашим данным локализован в хромосоме 2 в тесном сцеплении с маркером RLP26. Положение второго гена, условно обозначенного символом Р, пока не известно. III. Биоинформатический анализ 9. С помощью биоинформатического анализа баз данных генов, кДНК, EST и белков осуществлен поиск нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, гомологичных генам и их продуктам, которые контролируют поляризацию листа у арабидопсис. Поскольку большинство ключевых генов поляризации принадлежит к обширным семействам регуляторных генов, представленным в геноме арабидопсис десятками копий, проведены исследования по выявлению тех последовательностей белков/ДНК, которые характерны именно для генов поляризации у двудольных. Показано, что гены поляризации, контролирующие развитие верхней стороны листа, принадлежат к семейству HD-ZipIII. У A.thaliana к этому семейству относятся 5 генов, 3 из которых (REV, PHB, PHV) участвуют в контроле поляризации, а 2 имеют иные функции. Среди генов поляризации ген REV является самым древним. Его ортологи обнаруживаются как у двудольных, так и однодольных. Сравнивая паралоги по числу синонимичных замен, приходящихся на синонимичный сайт (Ks), можно примерно оценить время дупликаций. Гены PHB и PHV по нашим расчетам возникли после обособления предковой формы семейства капустных от других представителей порядка капустоцветных (Brassicales). 10. Подсчет примерного времени дупликации по формуле T =Ks/2 (  - скорость молекулярной эволюции, составляющая для A. thaliana 1.5Ч10−8 замен на синонимичный сайт в год, Koch et al., 2000, Mol Biol Evol., 17, 1483-1498) показал, что дупликация, давшая начало этим генам произошла примерно 14,8 млн лет назад (величина Ks при сравнении паралогов PHB и PHV составила по нашим расчетам 0,44502). Т.е. гены PHB и PHV являются специфичными для семейства капустные (Brassicaceae). Особенностью всех белков HD-ZipIII является наличие домена MEKHLA (148 аминокислот) на С-концевом участке белка. Доменов, отличающих белки, вовлеченные в поляризацию, от других белков HD-ZipIII ранее выявлено не было. Мы провели детальное сравнение аминокислотного состава белков HD-ZipIII (группа REV), контролирующих поляризацию, с белками, не связанными с этой функцией (группа CNA) из двудольных видов. В результате были выявлены 3 консервативных значимых замены аминокислот в домене MEKHLA, отличающие группу REV от группы CNA, 5 замен одиночных аминокислот в домене START и др. Наиболее интересной является консервативная замена 10 соседствующих амикокислотных остатков на участке между доменами START и MEKHLA (некоторые исследователи выделяют эти участки в виде отдельного домена SAD). Мы надеемся, что дальнейшие биоинформатические исследования в 2017 г позволят проверить значимость выявленных аминокислотных замен в белках группы REV для приобретения новой функции контроля поляризации (см. планы на 2017 г). 11. На основе проведенных исследований созданы серии вырожденных праймеров (24 праймера) для амплификации ортологичных генов группы REV у крестовников (табл.2). Аналогичные исследования для генов нижней стороны листа позволили создать вырожденные праймеры для амплификации из крестовников фрагментов кДНК, ортологичных генам YAB3, YAB2, YAB5 Arabidopsis thaliana (табл. 3). IV. Работа с РНК, кДНК и ДНК крестовника 12. Отработаны оптимальные методы для выделения и очистки ДНК и РНК из суккулентных листьев растений крестовника. Выделена РНК и на ее основе созданы библиотеки кДНК из двух видов крестовника (Curio fecoides и C.articulatus), которые использовались в качестве матрицы для амплификации с вырожденными праймерами и стандартными «микс-праймерами» из набора RACE (Евроген). При анализе продуктов амплификации с кДНК из C.articulatus выявлено три фрагмента (один – ген верхней стороны (F_997, 700 пн) и второй- ген YABBY (F_2021, на геле два фрагмента 500-600 пн и 900 пн)., которые являются возможными претендентами на роль искомых последовательностей. Для большинства других праймеров (в общей сложности опробованы более 20 вырожденных праймера) продуктов амплификации либо не обнаружено, либо выявлены множественные неспецифические продукты.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Исследование генетических основ уклоняющейся дорсовентральной полярности листа у мутантных и природных форм высших двудольных, обладающих унифациальными листьями
Результаты этапа: Развернутый отчет 1. Анатомо-гистологическое исследование листа Arabidopsis thaliana Исследование было основано на использовании современных методов световой и электронной сканирующей микроскопии. Для электронной микроскопии листья обезвоживали в серии спиртов увеличивающейся концентрации, заменяли спирт ацетоном и высушивали в критической точке в HCP-2 Drier (Hitachi). Высушенный материал напыляли смесью Au и Pd в IB-3 Ion Coater (EIKO) и анализировали под сканирующим электронным микроскопом Camscan-S2 (Cambridge Instruments). Для световой микроскопии листья дегидратировали в серии спиртов увеличивающейся концентрации, замещали спирт ксилолом через серию их смесей и пропитывали парафином. Микротомные срезы окрашивали последовательно карболовым фуксином и гематоксилином по Делафильду и заключали в канадский бальзам (методика согласно Барыкиной и др., 2004). У мутанта tae выявлены локальные отклонения как во внешнем, так и во внутреннем строении листовых пластинок. Во внешнем строении это проявляется в асимметричном подавлении роста базальной части листовой пластинки в ширину, сочетающимся с рассогласованным расширением адаксиальной и абаксиальной сторон. Последнее приводит к подгибанию края такого участка листовой пластинки на абаксиальную сторону. В зоне подавленного роста пластинки в ширину на многих листьях развивается с адаксиальной стороны эктопический вторичный край. На большем своем протяжении он представлен узким и низким валиком, параллельным первичному краю, но локально обычно разрастается в более или менее крупную васкуляризованную лопасть (рис. 1). В редких случаях развиваются два параллельных вторичных края, различающихся по толщине, высоте и анатомическому строению (Fedotov et al., 2017). Наиболее вариабельно анатомическое строение края листовой пластинки мутантных растений. В нормально развитых участках листовой пластинки край обычно анатомически сходен с таковым у растений дикого типа, но палисадная хлоренхима состоит из более коротких клеток, а вместо субмаргинального плотного тяжа хлоренхимы располагается один слой изодиаметрических хлорофиллоносных клеток, губчатая хлоренхима очень рыхлая. Иногда край острый, с прерывистым слоем палисадной хлоренхимы и губчатой хлоренхимой на месте субмаргинального слоя клеток. В участках, где листовая пластинка недоразвита, первичный край чаще всего более острый, без палисадной хлоренхимы и субэпидермального слоя хлорофиллоносных клеток, а нередко он вообще лишен мезофилла и представлен только адаксиальной и абаксиальной эпидермами или даже всего одним слоем клеток эпидермальной природы. В редких случаях край, наоборот, более толст, чем у растений дикого типа, и выполнен субэпидермальным плотным тяжом изодиаметрических хлоренхимных клеток, к которому примыкают адаксиальная непрерывная палисадная хлоренхима и абаксиальная рыхлая губчатая хлоренхима. Вторичный край обычно выполнен губчатой хлоренхимой, более плотной, чем таковая в первичном крае, или плотной хлоренхимой из изодиаметрических клеток, но изредка он сложен всего двумя слоями эпидермы и лишен мезофилла (Fedotov et al., 2017). Таким образом, проведенное исследование показало, что механизм асимметризации листовых пластинок мутанта tae кардинально отличается от такового у активно изучаемых разными исследовательскими коллективами мутантов as и bop (Ha et al., 2003, 2007; Jun et al., 2010). В отличие от мутантов as1 и as2, у мутанта tae асимметрия листовой пластинки обусловлена не локальным разрастанием ее в ширину, а наоборот, ранним прекращением роста в ширину основания одной из полупластинок, сопряженным с истончением края, недоразвития в нем мезофилла вплоть до полного отсутствия последнего и рассогласованием роста адаксиальной и абаксиальной сторон с неизбежным подворачиванием вследствие этого данного края на абаксиальную сторону листа. От мутанта bop мутант tae отличается образованием не лопастей у средней жилки, а вторичного края, которые проходит по адаксиальной стороне листа рядом с местом его заворачивания на абаксиальную сторону и локальным разрастанием вторичного края в лопасти. Таким образом, проведенное исследование показало глубокое отличие фенотипического проявления мутации tae от других мутаций, нарушающих своевременное выключение экспрессии генов KNOX. 2. Анализ экспрессии трансгенов KN1::GUS и DR5::GUS в листьях мутанта tae Работа проводилась на растениях A. thaliana дикого типа и мутанта tae, несущих в геноме транскрипционно слитые гены KN1::GUS и DR5::GUS, активация промоторов у которых наблюдается соответственно в недетерминированных клетках и тканях с высоким содержанием цитокининов (KN1::GUS) и в тканях, где концентрируется активный ауксин (DR5::GUS). Для тестирования активности репортерного гена uidA (GUS), кодирующего бета-глюкуронидазу, использовали метод гисто-химического анализа. Исследовали все стадии развития листа, начиная с зачатков листьев 3-х дневного проростка и заканчивая листьями растений репродуктивного возраста. Наиболее существенные различия по экспрессии обоих слитых генов наблюдались в листьях взрослых растений. У дикого типа оба трансгена показывали точечную экспрессию только в кончиках зубчиков листа, где располагаются гидатоды (рис. 2А, 3А). У мутанта, DR5::GUS экспрессировался значительно шире по периферии листа (рис. 2Б-Г). Диффузные локальные участки накопления активного ауксина наблюдали и в других участках листа (рис. 2Д), в том числе – на периферии молодых активно растущих выростов (рис. 2Г, стрелка). Ранее проводились исследования экспрессии DR5::GUS в молодых листьях мутантов as1 и as2. Было показано, что асимметричное распределение ауксина предшествует асимметричному росту листовой пластинки у этих мутантов и связанной с этим асимметрии клеточных делений (Zgurski et al., 2005). Наши исследования не выявили существенной разницы в распределении ауксина в листьях мутанта и дикого типа на ранних стадиях их развития, но обнаружили асимметрию в распределения ауксина по листовой пластинке на поздних стадиях развития листа. Это, по-видимому, отражает те процессы образования вторичных краев и лопастей, которые у мутанта tae активизируются именно на поздних стадиях развития листа. Выявленное нами с помощью трансгена DR5::GUS накопление ауксина по периферии листовой пластинки у мутанта tae удивительно похоже на картины экспрессии DR5::GUS, выявленные у растений дикого типа после действия ингибиторов полярного транспорта ауксина (Zgurski et al., 2005; Caggiano et al., 2017). Это сходство позволяет предполагать нарушения полярного транспорта ауксина у tae. Экспрессию KN1::GUS наблюдали вдоль центральной жилки, особенно в проксимальной части листа, а также на периферических участках листа – в очагах образования эпиламинарных структур и почек (рис. 3Б-Е). Выявленная экспрессия KN1::GUS в листе мутанта tae, а также совпадение доменов экспрессии KN1::GUS с участками новообразований свидетельствуют о недетерминированности клеток листа мутанта tae, обусловленной эктопической экспрессией гена KN1. Аналогичные исследования ранее проводились для двойного мутанта bop1 bop2 (Ha et al., 2010) и одиночных мутантов as1 и as2 (Guo et al., 2008). В этих исследованиях было показано, что в листьях мутантов сохраняется экспрессия KN1::GUS – в основании листа (у bop1 bop2) или вдоль средней жилки (у as1, as2). Это указывает на участие всех исследованных ранее и в данном проекте генов в ограничении экспрессии гена KN1/BP (один из KNOX генов) в листе и сохранение недетерминированности клетками листа. 3. Картирование гена tae Важным направлением исследований в отчетном году было тонкое картирование рецессивной мутации tae на физической карте 2-ой хромосомы с использованием ДНК-маркеров RLP26, RSA и PFA-DSP2 (CAPS или ПЦР-ПДРФ-маркеры, выявляющие рестрикционный полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК). Эти маркеры созданы в 2016 г. (в 1-ый год работы над проектом) и выявляют полиморфизм между мутантом tae и растениями рас Dijon (Dj) и Columbia (Col). Для картирования использовали ДНК, выделенную из мутантных растений популяции F2 от скрещивания мутанта tae с расой Dj и Col. Анализ 156 хромосом выявил наличие одной рекомбинантной хромосомы по маркеру RLP26 (растение №44 – гетерозигота по RLP26) и одной – по маркеру PFA-DSP2 (растение №151), что ограничило поиск гена tae небольшим участком 2-ой хромосомы, где локализованы всего 9 генов (рис. 4, табл.1). Для большинства из них биологическая функция не известна. Более того, биоинформатический анализ показал, что многие из рассматриваемых генов не аннотированы (по несколько моделей аннотации на каждый ген), что затрудняет дальнейший биоинформатический анализ. В связи с этим мы продолжили картирование, создав еще один ДНК-маркер к гену GH9B8. Анализ той же выборки мутантов, что и с вышеуказанными маркерами обнаружил одну рекомбинантную хромосому в растении №44. Поскольку между маркерами PFA-DSP2 и GH9B8 лежат всего 2 гена (AT2G32980 AUG2 и AT2G32970), именно они были рассмотрены нами как гены-кандидаты. Секвенирование гена AT2G32980 (AUG2) не выявила несинонимичных замен в гене у мутанта tae, т.е. остается один ген в качестве кандидата - ген AT2G32970. Для гена AT2G32970 в базах данных имеется информация о том, что его продуктом является G1/S-специфический циклин E. К сожалению, эта информация ложная, и белок не показывает сходства ни с другими белками растений, ни с белками животных. Для AT2G32970 представлены 4 модели аннотирования и 9 вариантов альтернативного сплайсинга. Во втором интроне имеется фрагмент транспозона. Наши попытки амплифицировать геномную и кДНК-последовательность из мутанта tae и дикого типа (экотип Blanes) пока не увенчались успехом, что может быть связано с ошибками секвенирования референсного генома экотипа Col, неоднозначным аннотированием гена и различиями структуры геномов двух экотипов. Для амплификации геномной ДНК мы использовали 2 пары праймеров к гену AT2G32970, однако лишь одна из пар давала ПЦР-продукт, причем кроме фрагмента ДНК ожидаемой массы амплифицировался и более легкий фрагмент, хотя и с меньшим выходом. Секвенирование более тяжелого фрагмента выявило несколько синонимичных замен в растениях расы Blanes по сравнению с референсной расой Col. Те же замены обнаружены и у мутанта tae. Амплификация кДНК давала лишь один фрагмент. Эти исследования могут указывать на наличие паралога у гена AT2G32970 (в базах данных гомологи отсутствуют) и на ошибки в секвенировании референсного генома Col. Работа по изучению структуры гена AT2G32970 будет продолжена в 2018 г. Мы исследовали также уровень транскрипции гена AT2G32970 в растениях мутанта tae и дикого типа методом ПЦР-РВ. РНК выделяли из молодых листьев 7 и 10-дневных растений (соответственно, 1-2-ой лист и 3-4-ый лист) размером 2-3 мм в длину. Выявлено более чем 2-кратное снижение экспрессии AT2G32970 в обоих вариантах эксперимента (рис. 4). Эти результаты служат косвенным подтверждением успешности выбранной стратегии позиционного выделения гена tae. Однако для доказательства идентичности гена TAE гену AT2G32970 исследования должны быть продолжены с использованием методов клонирования. 4. Создание пулов ДНК для картирования второго полимерного гена, который вместе с мутацией tae обуславливает мутантный фенотип tae В 2016 г. были получены данные о дигенности мутанта tae. Для картирования второго полимерного гена p, который присутствует в гомозиготном состоянии в расе Blanes и вместе с мутацией tae обуславливает мутантный фенотип tae, проведен анализ F2 от скрещивания мутанта tae с расой Col с использованием ДНК-маркеров, сцепленных с геном tae RLP26, GH9B8 и PFA-DSP2. Гомозиготность по маркерам показали не только растения фенотипа tae (исследованы 23 растения), но и 18 растений дикого фенотипа. Среди растений дикого типа обнаружены также 44 гетерозиготы по всем 3-м ДНК-маркерам, а также 18 гомозигот по дикой аллели, что подтверждает предположение о наличии в расе Col несцепленного гена, взаимодействующего с геном tae. Анализ F3 потомства 7 таких растений показал наличие 4-х семей с моногенным расщеплением, что соответствует ожиданию и подтверждает полимерное взаимодействие рецессивных аллелей двух генов (tae и p) при формировании фенотипа tae. Мы не исключает существование и третьего гена-модификатора, который также не имеет своего проявления, но влияет на экспрессивность фенотипа tae. На это указывают выявленные в F3 существенные различия растений по времени проявления фенотипа tae. Однако для проверки этого предположения необходимо изучить наследование выявленных различий в экспрессивности фенотипа tae в половом потомстве. Растения F3 из двух семей с моногенным расщеплением использовали для создания пулов ДНК (три пула из мутантных растений, отличающихся по экспрессивности признака и один пул из растений дикого типа для каждой из семей). Эти 8 пулов ДНК будут использованы для картирования второго полимерного гена р в 2018 г. 5. Исследование влияния генов AS1 и AS2 на проявление мутантного фенотипа tae Гены AS1 и AS2 контролируют детерминацию клеток листа, поляризацию и рост листовой пластинки, т.е. выполняют функции, предположительно, сходные с таковыми для ранее не исследованных полимерных генов TAE и Р. В исследовании использовали мутации as1 и sa из коллекции кафедры генетики МГУ (аллели генов AS1 и AS2, соответственно), которые путем скрещиваний переводили в генотип расы Blanes (гомозигота по полимерному гену р), а затем скрещиванием с мутантом tae, прошедшим 5 возвратных скрещиваний на Blanes, получали растения, несущие несколько мутаций одновременно. Генотип мутантов tae sa и tae as1 подтверждали с помощью ДНК-маркеров, сцепленных с соответствующими генами (маркеры к полимерному гену р отсутствовали, т.к. мутация еще не картирована). Исследования проводили с использованием методов световой микроскопии и сканирующей электронной микроскопии. Растения двойного мутанта tae sa на ювенильной стадии развития и до стадии появления цветоносов формировали суженные листья розетки, напоминающие лист мутанта tae (рис. 6А-Д). Некоторые растения двойного мутанта имели типичные для tae листья с недоразвитием одной из полупластинок (рис. 6Е). Это сходство двойного мутанта с одиночным мутантом tae указывает на эпистатическое взаимодействие генов на ранних этапах формировании листа, т.е. на участие генов TAE и AS2 в контроле последовательных этапов одного морфогенетического процесса. После перехода растений в репродуктивную стадию развития рост листьев розетки одиночных мутантов tae и sa прекращался, в то время как у двойного мутанта наблюдали продолжение роста отдельных листьев как в ширину, так и в длину, изгибы и скручивание листьев, что, по-видимому, связано с эктопическими клеточными делениями. В результате растения двойного мутанта имели очень разнообразные по форме и размеру листья (рис. 7А). На репродуктивной стадии развития растения двойного мутанта, как и растения одиночных мутантов tae и sa, начинали образовывать лопасти на листьях, причем, интенсивность образования эпиламинарных структур была существенно выше, чем у мутанта tae и sa (рис. 7Б), а их форма – значительно разнообразней (рис. 7В). Часто выросты были гребневидными или имели форму щитовидных листьев, которые изредка встречались у tae, но не sa (рис. 7В, стрелки). Существенное увеличение частоты эпиламинарных структур на листе tae sa (синергизм) указывает на комплементарное действие генов AS2, TAE и Р в контроле детерминированности клеток листа. Благодаря высокой частоте образования эпиламинарных структур у tae sa появилась возможность начать исследования закономерностей развития вторичного края на листьях. Получены предварительные данные в пользу существования связи между нарушением дорcовентральной полярности листа и образованием вторичного края. Предположение о существовании такой связи впервые было высказано при исследовании мутанта львиного зева (Waites, Hudson, 1995). Мы планируем продолжить эти исследования в 2018 г. Мутация as1 имела совершенно другое влияние на фенотип tae. На ранних стадиях развития проростков и ювенильных растений молодые листья формой напоминали мутант tae, но быстро прекращали рост. Выростов на листьях не выявлено. Растения характеризовались миниатюрностью, пониженной жизнеспособностью и были стерильными. Такой неожиданный фенотип, по-видимому, объясняется серьезными нарушениями пролиферации клеток листовых зачатков, причины которых не ясны и требуют дополнительных исследований. Выявленное взаимодействие с геном AS2 (и, по-видимому, AS1) свидетельствует о том, что полимерные гены TAE и Р могут быть новыми компонентами генного модуля AS1/AS2 – KNOX, от работы которого зависит уровень детерминированности клеток листа (а значит, и его форма), рост листа в длину, формирование проводящей системы. Сегодня изучению функции и молекулярных механизмов действия генов AS1, AS2, продукты которых действуют в составе одного белкового комплекса, уделяется большое внимание (см., например, Husbands et al., 2015; Zhang, Tadeg, 2015; Li et al., 2016; Matsumura et al., 2016). Однако многие аспекты действия генов AS1, AS2 еще не ясны. В том числе не ясно, как именно гены AS1, AS2 осуществляют координацию клеточных делений при формировании плоской структуры листовой пластинки и подавляют образование эктопических выростов листа, а также контролируют дорзовентральную полярность листа (Ikezaki et al., 2010). Показано, что эти эффекты AS1, AS2 (которые очевидны при детальном анализе фенотипа мутантов) не связаны с их влиянием на экспрессию генов KNOX (Ikezaki et al., 2010), т.е. должны существовать другие гены-мишени и/или другие взаимодействующие гены. Полимерные гены TAE и P могут быть такими новыми генами, которые во взаимодействии с генами AS1, AS2 контролируют развитие эктопических эпиламинарных структур и координируют деления клеток при развитии листа. Интересно, что в ходе онтогенеза изменяется характер взаимодействия генов. Это, очевидно, связано с тем, что, как и ген AS2, гены TAE/P контролируют несколько признаков (на ранних этапах развития листовой пластинки определяют ее форму, а на поздних – подавляют развитие эктопических эпиламинарных структур). На каждом из этапов гены действуют вместе: сначала – последовательно (эпистаз), а позже – комплементарно. 6. Биоинформатический анализ генов/белков семейства HD-ZipII Продолжен биоинформатический анализ генов/белков семейства HD-ZipII, направленный на анализ консервативности выявленных диморфных аминокислотных различий между белками клад REV (белки, вовлеченные в контроль поляризации) и CAN (не участвует в контроле поляризации). Анализировали ортологичные белки как двудольных (в общей сложности 149 белковых последовательностей), так и однодольных видов с бифациальным листом, а также голосеменных. Для двудольных при сравнении белков клады REV и CNA нами выявлена в общей сложности 21 консервативная замена в доменах SAD, START и MEKHLA (Близнина, Куприянова, 2017). Большинство замен выявлено в домене SAD (табл. 2). При анализе однодольных растений выявлены последовательности, ортологичные белкам REV двудольных (уровень сходства более 65%). Для подавляющего большинства белков показано присутствие в START, SAD и MEKHLA-доменах тех же аминокислот, которые есть в белках REV двудольных и различают их от клады CNA (табл. 3). Анализ последовательностей клады CNA банана (Musa acuminata subsp. malaccensis), сорго (Sorghum bicolor) и щетинника (Setaria italica) выявил ожидаемые аминокислотные различия по большинству позиций. В большинстве найденных последовательностей из злаковых растений (три вида риса, кукуруза, пшеница) и ананаса (Ananas comosus) выявлены те же аминокислоты, что и в белках клады REV (табл. 3). Эти данные могут указывать на утрату (эрозию) генов клады CAN у многих видов однодольных (злаков, в первую очередь). 7. Разработка методов размножения in vitro Curio (Senecio) articulatus для получения массового материала для молекулярно-генетических и анатомо-гистологических исследований В работе мы столкнулись с нехваткой материала для проведения исследования развития листа C. articulatus на генетическом и анатомо-гистологическом уровнях в связи с медленным ростом растений в условиях оранжереи и лаборатории. Известно, что метод масс-клонального размножения растений in vitro нашел весьма эффективен для получения большого количества материала интересующих растений (Purohit et al., 2017). Этот метод давно используют при размножении суккулентов из семейства Cactaceae (Malda et al., 1999), но применительно к кретовникам его использовали только для размножения несуккулентного вида Senecio inaequidens (Hariprasath et.al., 2015), весьма далекого таксономически от Curio. Суккулентные крестовники подобными методами до сих пор не размножали. Нами был разработан оригинальный протокол регенерации C. articulatus из побеговых эксплантов. Материнские растения были взяты из коллекции ГБС РАН им. Цицина. В качестве эксплатнтов использовали молодые листья и участки верхней части побега. Стерилизацию растительного материала проводили по протоколу: 70% спирт – 1 мин, 4% раствор лизоформина – 12–15 мин в зависимости от размера и типа экспланта, промывка стерильной дистиллированной водой 3 раза по 10 мин. Все дальнейшие операции проводились в стерильных условиях в ламинаре. Листовые экспланты разрезали на 3-4 части так, чтобы плоскость разрезов пересекала как можно большее число проводящих пучков. Стеблевые экспланты получали путем поперечного разрезания верхней части побегов. Подготовленный материал помещали на питательную среду MS (Murashige and Skoog) с добавлением 30 г/л сахарозы и фитогормонов: BAP, KIN, IAA, NAA, 2,4-D – в различных комбинациях и концентрациях и выдерживали в темноте 2 недели при 240С. После указанного срока экспланты переносили в условия 16 часового дня 8 часовой ночи при той же температуре. Через 2 месяца культивирования экспланты пересаживали на среду MS с добавлением 20 г/л сахарозы и таким же содержанием фитогормонов. Еще через 2 месяца регенеранты (побеги) помещали на среду MS содержащую 20/л сахарозы и 1,5 мг/л 2ip. В ходе экспериментов было показано, что наиболее эффективной комбинацией регуляторов роста из использованных для индукции каллусогенеза у эксплантов обоих типов является 2 мг/л BAP вместе с 2 мг/л IAA. Она приводит к формированию морфогенного каллуса, обычно плотного, светло-зеленого оттенка. При этом на листовых эксплантах формировались уплотнения темно-зеленого цвета, при световой микроскопии в них удавалось выявить группы меристематических клеток. На стеблевых эксплантах на верхней плоскости формируется очень плотная по большей части неморфогенная раневая перидерма. При этом формирование морфогенного каллуса происходит на той части экспланта, который находится в соприкосновении со средой (рис. 8А). Спустя 4 месяца культивирования формируются одиночные побеги (примерно до 1 – 1,5 см). Для поддержания культуры побегов эффективным оказался перенос на среду, содержащую 1,5 мг/л 2ip. При этом происходит постепенный рост побегов (рис. 8Б), появляется возможность для дальнейшего микроклонального размножения. Использование BAP в комбинации с IAA в редких случаях приводила к активации боковых почек и формированию побегов из них. Так же в ходе экспериментов было показано, что использование 1 мг/л 2,4-D в качества индуктора каллусогенеза как в комбинации с BAP, так без него, приводит к формированию на эксплантах обоих типов неморфогенного каллуса. Обычно каллусная масса при этом рыхлая, светло-желтого оттенка. Использование 1 мг/л KIN в комбинации с 0,1 мг/л IAA не приводило к образованию каллуса на листовых эксплантнах, в то время как на стеблевых эксплантах образовывался слой раневой перидермы без следов формирования очагов роста. В редких случаях формировались придаточные корни. 8. Попытка клонирования генов поляризации из генома Curio articulatus Матричная РНК из молодых листьев микроклонированных растений S. articulatus использована для создания библиотеки кДНК (набор реактивов Mint RACE cDNA amplification set, Евроген), которую использовали в качестве матрицы для амплификации продукта с использованием вырожденных праймеров, созданных нами в 2016 г. При анализе амплифицированных продуктов выявлено несколько фрагментов ожидаемой длины, которые были очищены (набор Cleanup Mini, Evrogen) и клонированы в pAL-TA вектор (компетентные клетки, вектор, Т4 ДНК лигаза, Plasmid Miniprep фирмы Евроген) и далее секвенированы (Евроген). В общей сложности удалось клонировать 4 фрагмента, однако ни один из фрагментов не оказался продуктом генов поляризации: три из них (997H_1, 997H_2, 997H_3) имели высокую идентичность с последовательностью гена 26S рибосомальной РНК, один (997H_5) – с митохондриальной ДНК. Для последовательностей рибосомальных генов наибольшая идентичность (больше 96% для всех последовательностей) была найдена с частями последовательности гена 26S рибосамальной РНК у Curio integerrimus (GenBank ID KT179726.1). Множественное выравнивание полученных последовательностей рибосомальных генов относительно друг друга показало, что все последовательности соответствуют примерно одному и тому же участку последовательности гена С. integerrimus, но не полностью идентичны друг другу: последовательность 997H_1 имеет наибольшее сходство с последовательностью 997H_2, тогда как последовательность 997H_3 имеет наименьшее сходство с обеими последовательностями, но наибольшее – с последовательностью C. integerrimus (рис. 9). Таким образом, у C. articulatus синтезируются, как минимум, две альтернативные изоформы, соответствующие гену 26S рибосомальной РНК, что, возможно, связано с гибридным происхождением вида. 9. Исследование развития листа C. kleiniiformis в сравнении с развитием листа C. talinoides Curio (Senecio) kleiniiformis характеризуется слабо пельтатными 3(5)-лопастными листовыми пластинками и унифациальными черешками (рис. 10). Листья C. talinoides вальковатые унифациальные (рис. 11). Развитие листа ранее было исследовано только у C. talinoides методами сканирующей электронной микроскопии (Timonin et al., 2006, под названием Senecio spiculosus). Мы исследовали развитие листа у C. kleiniiformis и повторно у C. talinoides методами световой и сканирующей электронной микроскопии, что позволило выявить формирование их анатомо-гистологической структуры. Подготовку препаратов для микроскопии проводили по методике, адаптированной к работе с суккулентными крестовниками на предыдущем этапе работы по гранту (2016 г.) (Fedotov et al., 2016). Примордий листа C. kleiniiformis формируется на краю плоского апекса и быстро становится уплощенным в дорсовентральном направлении (рис. 12), причем даже в большей степени, чем примордий бифациального листа C. articulatus на сопоставимой стадии развития (Fedotov et al., 2016). Дифференциация примордия на Unterblatt и Oberblatt не выражена, и он развивается как широко-треугольная пластинка, постепенно утолщающаяся по всей длине кроме самого основания. На границе ее нижней и средней третей появляются зачатки основных лопастей листовой пластинки, занимающие латерально-адаксиальное положение (рис. 12). Вслед за этим верхушка примордия округляется в поперечном сечении, утрачивая бифациальную структуру (рис. 13) и развивается в мощный унифациальные Vorläuferspitze. От зачатков лопастей акро- и базипетально дифференцируются края листовой пластинки, более острые, чем края листового примордия, в них появляются трехсторонние субмаргинальные инициали (рис. 15), как и у изученного в прошлом году C. articulatus. Края акропетально дифференцируются косо-продольно и сходятся и соединяются под Vorläuferspitze (рис. 14). Базипетально края развиваются почти поперечно и смыкаются практически на уровне базальных краев основных лопастей (рис. 14). Вследствие этого лопасти приобретают косо-поперечное положение, а ниже их формирующийся черешок начинает утолщаться посредством функционирования адаксиальной меристемы округления (Rundmeristem). Этот процесс не захватывает самое основание развивающегося листа, которое остается тонким, его четкие края дугообразно смыкаются (рис. 16). Участок черешка между двумя участками смыкания краев еще более округляется в поперечном сечении и становится полностью унифациальным. Листовая пластинка анатомически подобна таковой у C. articulatus (Fedotov et al., 2016), но содержит более толстый слой адаксиальной водозапасающей ткани. Унифациальный черешок внешне и по анатомической структуре идентичен строению вальковатого листа C. talinoides (рис. 17). Основной объем его занимает центральная водоносная паренхима, окруженная тонким слоем хлоренхимы из однотипных изодиаметрических клеток. По границе паренхимы и хлоренхимы располагаются равномерно коллатеральные пучки, ксилемые части которых обращены центрипетально. Расположение проводящих пучков в мясистых листьях покрытосеменных растений разнообразно и не всегда коррелирует с фациальной структурой листа (Melo-de-Pinna et al., 2014; Melo-de-Pinna et al., 2016). Однако как характер васкулатуры, так и кольцевое расположение хлоренхимы, смыкание краев листового примордия, типично абаксиальная структура эпидермы на черешке C. kleiniiformis и вальковатом листе C. talinoides, характер генезиса этих листьев подтверждают унифациальность данных структур. Проведенное исследование генезиса листа C. kleiniiformis, обладающего унифациальным черешком и эксцентрической пельтатной листовой пластинкой выявило общее сходство с генезисом бифациального черешкового листа C. articulatus. Унифациальная структура черешка возникает вследствие специфического смыкания краев листового примордия на адаксиальной стороне и деятельности адаксиальной меристемы округления, подобной таковой в формирующемся вальковатом листе C. talinoides. Следствием становится морфологическое и анатомическое подобие черешка унифациальному листу C. talinoides. 10. Уточнение таксономического статуса C. articulatus Исследование морфогенеза листа крестовников было начато с C. articulatus, черешковые бифациальный лист которого ранее рассматривали как пример исходного типа листа в роде Curio (Тимонин, Озерова, 1993). Однако впоследствии был описан новый вид C. pondoensis (Manning, 2013) с бифациальными листьями, сильно отличающимися морфологически от листьев C. articulatus, а система крестовников претерпела кардинальные изменения (Pelser et al., 2007, 2010). Поэтому возникла необходимость подтверждения правомерности признания листа C. articulatus и его генезиса базовым типом, из которого эволюционно сформировались суб- и унифациальные листья большинства видов Curio. С этой целью был проведен молекулярно-филогенетический анализ данного рода с использованием оригинальных данных и базы данных GenBank с привлечением данных по близким родам и внешней группе (Tussilago farfara). Был использован наиболее часто применяемый в современной молекулярной филогенетике участок ITS1–5.8S RNA–ITS2 ядерной ДНК. Выделение, амплификацию очистку, и секвенирование этого фрагмента ДНК проводили соответственно протоколам фирм-изготовителей соответствующих расходных материалов. Полученные последовательности выравнивали в программе BioEdit с встроенной программой Crustal W и окончательно выравнивали вручную. Оригинально определенные последовательности были помещены в базу данных GenBank. Поскольку кладограммы в принципе не отражают сетчатую гибридизационную эволюцию, первичные данные были обработаны методом NeighborNet в программе Splittree4 с построением сплит-графа филогенетических отношений исследуемых таксонов. Полученный сплит-граф (рис. 18) показывает единство рода Curio, хотя и демонстрирующего наличие 3 внутриродовых групп. C. articulatus представляет базальную линию всего комплекса Curio (Ozerova et al., 2017). Поэтому организацию его листьев правомерно рассматривать как проявление исходного типа организации листа в этом роде, на базе которого формировались разнообразные суб- и унифациальные листья с более или менее глубоко нарушенной дорсовентральной полярностью. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 2004. – 312 с. Близнина А.И., Куприянова Е.В. Анализ дивергенции генов семейства HD-ZipIII при формировании бифациального листа // Сборник тезисов XХIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «ЛОМОНОСОВ–2017». Секция "Биология". – Москва: МаксПресс, 2017. – Электронная публикация: https://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2017/data/section_2_10738.htm Тимонин А.К., Озерова Л.В. Строение, происхождение и эволюция вальковатых листьев в секции Rowleyani C. Jeffrey рода Senecio L. // Изв. РАН. Сер. биол. 1993. № 3. С. 393–401. Caggiano M.P., Yu X., Bhatia N. et al. Cell type boundaries organize plant development // eLife. 2017. Vol. 6: e27421. – https://doi.org/10.7554/eLife.27421 Fedotov A.P., Ozerova L.V., Timonin A.C. Leaf development in Curio articulatus (L. f.) P.V. Heath (Asteraceae – Senecioneae) // Wulfenia. 2016. Vol. 23. P. 135–146. Fedotov A.P., Ezhova T.A., Timonin A.C. Bizarre lamina margins in tae mutant of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (Brassicaceae) // Wulfenia. 2017. Vol. 24. P. 153–170. Guo M., Thomas J., Collins G., Timmermans M.C.P. Direct repression of KNOX loci by the ASYMMETRIC LEAVES1 complex of Arabidopsis // Plant Cell. 2008. Vol. 20. No 1. P. 48–58. – doi:10.1105/tpc.107.056127 Ha C.M., Kim G.-T., Kim B.C. et al. The BLADE-ON-PETIOLE 1 gene controls leaf pattern formation through the modulation of meristematic activity in Arabidopsis // Development. 2003. Vol. 130. No 1. P. 161–172. Ha C.M., Jun J.H., Nam N.G., Fletcher J.C. BLADE-ON-PETIOLE 1 and 2 control Arabidopsis lateral organ fate through regulation of LOB domain and adaxial-abaxial polarity genes // Plant Cell. 2007. Vol. 19. No 6. P. 1809–1825. Ha C.M., Jun J.H., Fletcher J.C. Control of Arabidopsis leaf morphogenesis through regulation of the YABBY and KNOX families of transcription factors // Genetics. 2010. Vol. 186. No 1. P. 197–206. – doi:10.1534/genetics110.118703 Hariprasath L., Jegadeesh R., Arjun P., Raaman N. In vitro propagation of Senecio candicans DC and comparative antioxidant properties of aqueous extracts of the in vivo plant and in vitro-derived callus // South Africa J. Bot. 2015. Vol. 98. P. 134–141. Husbands A.I. et al. The ASYMMETRIC LEAVES complex employs multiple modes of regulation to affect adaxial-abaxial patterning and leaf complexity // Plant Cell. 2015. Vol. 27. No 12. P. 3321–3335. Ikezaki M. et al. Genetic networks regulated by ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) and AS2 in leaf development in Arabidopsis thaliana: KNOX genes control five morphological events // Plant J. 2010. Vol. 61. No 1. P. 70–82. – doi:10.1111/j.1365-313X.2009.04033.x Jun J.H., Ha C.M., Fletcher J.C. BLADE-ON-PETIOLE1 coordinates organ determinacy and axial polarity in Arabidopsis by directly activating ASYMMETRIC LEAVES2 // Plant Cell. 2010. Vol. 22. No 1. P. 62–76. – doi: 10.1105/tpc.109.070763 Li Z. et al. Transcription factors AS1 and AS2 interact with LHP1 to repress KNOX genes in Arabidopsis // J. Integr. Plant Biol. 2016. Vol. 58. No 12. P. 959–970. Malda G., Humberto S., Backhaus R. In vitro culture as a potential method for the conservation of endangered plants possessing crassulacean acid metabolism // Sci. Hort. 1999. Vol. 81. P. 71–87. Manning J.C. Two new combinations in Caputia and Curio (Senecioneae) // Bothalia. 2013. Vol. 43. No 1. P. 93. Matsumura Y. et al. A genetic link between epigenetic repressor AS1-AS2 and a putative small subunit processome in leaf polarity establishment of Arabidopsis // Biology Open. 2016. Vol. 5. No 7. P. 942–954. Melo-de-Pinna et al. Repeated evolution of endoscopic peripheral vascular bundles in succulent leaves of Aizoaceae (Caryophyllales) // Taxon. 2014. Vol. 63. No 5. P. 1037–1052. Melo-de-Pinna et al. Growth patterns and different arrangements of vascular tissues in succulent leaves // Int. J. Plant Sci. 2016. Vol. 177. No 8. P. 643–660. Ozerova L.V., Schanzer I.A., Timonin A.C. Curio alliance (Asteraceae: Senecioneae) revisited // Wulfenia. 2017. Vol. 24. P. 29–52. Pelser P.B. et al. An ITS phylogeny of tribe Senecioneae (Asteraceae) and a new delimitation of Senecio L. // Taxon. 2007. Vol. 56. No 4. P. 1077–1104. Pelser P.B. et al. Patterns and causes of incongruence between plastid and nuclear Senecioneae (Asteraceae) phylogenies // Amer. J. Bot. 2010. Vol. 97. No 5. P. 856 – 873. Purohit S. et al. Micropropagation and genetic fidelity analysis in Amomum subulatum Roxb.: A commercially important Himalayan plant // J. Appl. Res. Med. Aromatic Pl. 2017. Vol. 4. P. 21–26. Timonin A.C., Ozerova L.V., Remizowa M.V. Development of unifacial leaves in Senecio L. s. lat. (Asteraceae) // Wulfenia. 2006. Vol. 13. P. 213–227. Waites R., Hudson A. phantastica: a gene required for dorsoventrality of leaves in Antirrhinum majus // Development. 1995. Vol. 121. P. 2143–2154. Zgurski J.M., Sharma R., Bolokoski D.A., Schultz E.A. Asymmetric auxin response precedes asymmetric growth and differentiation of asymmetric leaf1 and asymmetric leaf2 Arabidopsis leaves // Plant Cell. Vol. 2005. Vol. 17. No. 1. P. 77–91. Zhang F., Tadeg M. Repression of AS2 by WOX family transcription factors is required for leaf development in Medicago and Arabidopsis // Plant Signaling & Behavior. 2015. Vol. 10. No 7: e993291.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Исследование генетических основ уклоняющейся дорсовентральной полярности листа у мутантных и природных форм высших двудольных, обладающих унифациальными листьями
Результаты этапа: 1. Подготовительные работы. Создан биологический материал Arabidopsis thaliana для картирования гена tae и анализа генных взаимодействий. Проведены скрещивания мутанта tae с растениями расы Columbia, а также с мутантами as1 и sa (аллель as2), у которых, согласно результатам ранее проведенных исследований, имеются изменения дорсовентральной поляризации листа, получены гибриды F1 и гибридные популяции F2, F3 и F4. Путем скрещиваний и отборов получены растения мутанта tae, несущие в геноме транскрипционно слитые (химерные) гены KN1::GUS и DR5::GUS. Для получения массового материала, необходимого для проведения исследования, был разработан оригинальный протокол регенерации Curio articulatus из побеговых эксплантов. Был проведен таксономический анализ рода Curio методами молекулярной филогенетики, который позволил уточнить филогенетические отношения видов этого рода, характеризующихся разными типами листа и подтвердить плезиоморфность признаков организации бифациального листа Curio articulatus (Ozerova et al. 2017). Выделена РНК и на ее основе созданы библиотеки кДНК из двух видов крестовника (Curio ficoides и C. articulatus), которые использовались в качестве матрицы для амплификации с вырожденными праймерами. 2. Исследования генезиса листа мутантных растений tae на разном генетическом фоне. Детально проанализированы морфология и анатомия листьев мутанта tae Arabidopsis thaliana на разных стадиях развития в сравнении с растениями дикого типа (Fedotov et al., 2017). Показано, что на ранних стадиях развития листовые зачатки у мутантов и растений дикого типа сходны. Различия проявляются по достижении растущими листьями длины в 0.7-1 мм и нарастают по мере их дальнейшего развития. Мутация tae сильно нарушает латеральный рост листовой пластинки и приводит к рассогласованности плоскостного и маргинального ее роста, а также латерального роста адаксиальной и абаксиальной сторон. Мутация tae может модифицировать и жилкование листовых органов, проявляющееся в уменьшении числа основных боковых жилок в пластинке и увеличении числа пучков в черешке. Примерно у 20% мутантных растений выявлено образование на некоторых розеточных листьях адвентивных почек, не свойственных дикому типу данного вида. К окончанию фазы вегетативного роста на отдельных листьях розетки мутантных растений начинают развиваться эктопические вторичные края, формирующиеся на недоразвитом участке полупластинки с адаксиальной стороны. На 6ом-7ом листьях розетки нередко последовательно развивается несколько параллельных вторичных краев. В большинстве случаев вторичный край представлен низким гребнем, параллельным первичному краю, но изредка он ориентирован поперечно листовой пластинке. После вступления в фазу цветения эктопические гребни локально разрастаются, как правило, в небольшие эктопические лопасти, но отмечены также и чашевидные, воронковидные и игловидные выросты, а также крупные выросты, напоминающие небольшой лист с хорошо выраженной проксимодистальной полярностью и парой прилистников в основании. Листья мутанта в целом сохраняют дорсовентральное строение, но демонстрируют характерные специфичные нарушения дорсовентральной поляризации примордия: в адаксиальной эпидерме выявлены участки с измененной идентичностью клеток, которая выражалась в появлении клеток неопределенной идентичности, напоминающих клетки меристем, а также клеток, свойственных нижней стороне листа (прежде всего - примордиальных клеток устьиц), и многочисленными устьицами; палисадная ткань более рыхлая, чем у растений дикого типа, а под участками абаксиализированной адаксиальной эпидермы прерванная. Проведены детальные исследования строения клеток эпидермиса на верхней и нижней стороны листа мутанта tae и растений расы Blanes c использованием методов сканирующей микроскопии. Первичный край листовой пластинки мутантов в нормально развитых участках пластинки анатомически сходен с краем листовой пластинки дикого типа, а в участках, где листовая пластинка недоразвита, он часто лишен мезофилла и сложен только двумя смыкающимися эпидермами или одним слоем эпидермальных клеток. Вторичный край разрастается в низкий гребень с гомогенным мезофиллом и адаксиализированной эпидермой с одной стороны и абаксиализированной – с другой, причем их ориентация относительно первичного края непостоянна. В локальных листовидных разрастаниях вторичного края восстанавливается дорсовентральная структура мезофилла: развиваются палисадная ткань под «адаксиальной» эпидермой и губчатая ткань – под «абаксиальной». Кроме того, такие эктопические выросты васкуляризованы от проводящей системы листовой пластинки. 3. Подробно исследовано формирование листа и его анатомической структуры у Curio (Senecio) articulatus (Fedotov et al., 2016), Curio (Senecio) kleiniiformis и Curio (Senecio) talinoides. Установлено, что закладывающийся листовой примордий имеет слабо выраженное бифациальное внешнее строение и гомогенный мезофилл. С началом апикального роста примордий становится унифациальным за исключением самого основания. По завершении апикального роста дистальнее бифациального основания формируется зона интеркалярного нарастания, образующая листовую ось. Эта ось остается унифациальной у Curio talinoides и развивается в вальковатую листовую пластинку, а у остальных видов Curio приобретает бифациальное строение. По ее краям дифференцируются маргинальные меристемы, образующие зачатки полупластинок. Адаксиальные производные маргинальной меристемы дифференцируются в водозапасающую паренхиму и палисадную хлоренхиму, а абаксиальные – в губчатую хлоренхиму, в результате чего внешняя бифациальность дополняется дорсовентральной гистологической организацией. Маргинальные меристемы смыкаются под верхушкой формирующегося листа, которая остается унифациальной. В базальной части листовой оси маргинальные меристемы сближаются на адаксиальной стороне; у Curio articulatus между ними остается узкая адаксиальная сторона, простирающася к основанию листового зачатка в формирующийся бифациальный черешок, а у Curio kleiniiformis они сливаются, и развивающийся черешок унифациален. В основании листовой пластинки маргинальная меристема образует зачатки лопастей, верхушки которых утрачивают бифациальную структуру и морфологически и анатомически уподобляются унифациальной верхушке листа. В формирующемся бифациальном черешке дифференцируются продольно-антиклинальные меристемы, обусловливающие его нарастание в толщину. В унифациальном черешке латеральные меристемы не выражены. Унифациальные участки листа у всех видов полностью абаксиализированы как по признакам эпидермы, так и по структуре мезофилла. 4. Анализ матричной РНК из листовых примордиев Curio articulatus не позволил выявить продукты генов дорсовентральной поляризации примордия. 5. Молекулярно-генетическое картирование мутаций tae1 и tae2. Генетический анализ мутанта tae показал, что фенотип tae обусловлен наличием двух рецессивных мутаций (tae1 и tae2) в гомозиготном состоянии. Гомозиготы по одной из мутаций не имеют фенотипического выражения. С использованием ДНК-маркеров осуществлено тонкое молекулярно-генетическое картирование гена TAE1 во 2-ой хромосоме Arabidopsis thaliana, позволившее выйти на ряд генов-кандидатов, среди которых основные – AT2G32970 и AT2G32980. Несинонимичных замен, отличающих линию tae от родительской расы Bla, в геномной последовательности этих генов не выявлено. В то же время, в гене AT2G32970 выявлено 3 однонуклеотидных полиморфных сайта, которые отличают tae и Bla от референсной расы Col. Оценить влияние этих замен на функцию белка сложно, поскольку ген аннотирован неоднозначно (в базах данных для этого гена представлены 4 модели аннотирования); в базах данных для мРНК AT2G32970 имеется 9 вариантов альтернативного сплайсинга, а во втором интроне можно обнаружить фрагмент транспозона. В связи с этими неоднозначными результатами для идентификации гена TAE1 проанализирована нуклеотидная последовательность еще нескольких генов (AT2G32980, AT2G33000, AT2G33010) расположенных на выявленном участке локализации гена TAE1, у растений дикого типа расы Blanes и мутанта tae. Значимые изменения нуклеотидной последовательности обнаружены в кодирующей части гена AT2G33010. В 1-ом экзоне этого гена обнаружена делеция и инсерция - каждая протяженностью 9 пн, отсутствующая в растениях расы Columbia, но присутствующая как в растениях мутанта tae, так и у исходной расы Blanes. Функция гена не известна, он предположительно кодирует убиквитин-ассоциированный белок с доменом TS-N. Выявленные перестройки приводят к изменению аминокислотной последовательности белка. Поскольку по нашим данным характер наследования мутантного фенотипа tae меняется при переводе на генетический фон Columbia, обнаруженное изменение последовательности гена AT2G33010 может быть одним из двух генетических изменений, обуславливающих фенотип tae на генетическом фоне расы Blanes. Тем не менее, мы не исключаем того, что ген TAE1 может быть идентичен гену AT2G32970. С использованием ДНК-маркеров проведены исследования по картированию гена TAE2, мутация в котором tae2 в гомозиготе обуславливает фенотип tae при объединении с гомозиготной мутацией tae1. Для картирования использовали специально созданные в 2017 г пулы ДНК с растений мутантного фенотипа из поколения F3 tae x Col, отобранные по гомозиготности к ДНК-маркерам, сцепленным с мутацией tae1 (отчет прошлого года). В общей сложности для картирования использованы 23 ДНК-маркера (CAPS и SSLP), но полиморфизм между родительскими линиями показывали только 9 ДНК-маркеров. Показано отсутствие сцепления с ДНК-маркерами из верхнего и нижнего плеча 1-ой хромосомы, с маркерами нижнего плеча 3-ей хромосомы, маркерами верхнего и нижнего плеча 4-ой и 5-ой хромосом. Т.о., ген TAE2 может быть локализован в верхнем плече 3-ей хромосомы или в середине самых длинных 1-ой и 5-ой хромосом, для которых нам пока не удалось создать ДНК-маркеров, способных выявить полиморфизм между мутантом и расой Col. 6. Анализ транскрипции генов, контролирующих морфогенез листа в растениях дикого типа и мутанта tae. Проведен анализ транскрипции в листьях разного возраста 3-х групп генов с использованием метода ОТ-ПЦР-РВ: (1) генов PRS и WOX1, контролирующих рост пластинки в ширину, (2) генов, контролирующих развитие верхней (REV. PHB, PHV) и нижней стороны листа (FIL/YAB1 и YAB3), (3) гомеобоксных генов класса I KNOX контролирующих состояние плюрипотентности клеток (KN1, KN2, KN6, STM). РНК выделяли из листьев длиной 2-3 мм от 7-дневных проростков, листьев длиной 6-7 мм от 14-дневных ювенильных растений и листьев 17-22 мм от 21-дневных растений, не достигших репродуктивной стадии. Листья 14- и 21-дневных растений перед выделением РНК разделяли на 3 части – черешок, базальная часть листовой пластинки, дистальная часть листовой пластинки. В пластинке листа 14- и 21-дневного мутанта выявлено достоверное снижение экспрессии генов PRS и WOX1, контролирующих рост пластинки в ширину, что позволяет объяснить нарушения у мутанта образовательной функции маргинальной меристемы и сужение листовой пластинки, выявленные ранее с использованием анатомо-гистологического анализа. Экспрессия генов класса I KNOX в листьях 7- и 14-дневных растений не выявлена, что свидетельствует об эпигенетическом замолкании генов плюрипотентности в клетках листа, характерном для растений дикого типа. В черешках 21-дневных растений мутанта обнаружена повышенная по сравнению с диким типом экспрессия гена KN1, что подтверждает приобретение клетками мутанта состояния плюрипотености и объясняет причину формирования на листьях мутанта выростов и почек. Повышение уровня экспрессии гена KN1 в листьях мутанта подтверждено и с использованием репортерного гена GUS, транскрипционно слитого с промотором гена KN1. Существенное повышение экспрессии KN1::GUS наблюдали в зрелых листьях - главным образом вдоль средней жилки, особенно в проксимальной части листа, а также на периферических участках листа – в очагах образования эпиламинарных структур и почек. Выявленная экспрессия KN1::GUS в листе мутанта tae, а также совпадение доменов экспрессии KN1::GUS с участками новообразований свидетельствуют о недетерминированности клеток листа мутанта tae, обусловленной эктопической экспрессией гена KN1. В черешке и проксимальной части листовой пластинки растений мутанта 14 и 21-дневного возраста обнаружено повышение экспрессии генов, контролирующих развитие как нижней стороны листа, так и верхней стороны (кроме PHV), что согласуется с результатами анализа морфологии эпидермальных клеток верхней и нижней сторон листа, показавшего наличие среди клеток верхней стороны листа клеток неопределенной идентичности, а также клеток, характерных для нижней стороны листа (примордиальных клеток устьиц). Поскольку разграничение доменов экспрессии генов верхней и нижней сторон листа, как и замолкание гена KN1, обусловлено эпигенетическими механизмами, мы предполагаем, что у мутанта нарушены процессы, поддерживающие стабильность эпигенетического замолкания генов. 7. Анализ генных взаимодействий. Эпигенетическая репрессия генов плюрипотентности в клетках листового зачатка, а также генов абаксиальной идентичности в адаксиальной части листа инициируется генами AS1 и AS2, продукты которых (транскрипционные факторы) образуют комплекс и привлекают к генам-мишеням белки, изменяющие состояние хроматина. В связи с этим, было изучено взаимодействие генов TAE1/2 с генами AS1 и AS2. Анализ взаимодействия генов TAE1/2 с геном AS1 проводили путем сравнения развития тройных мутантов с мутантами as1 и tae. Впервые установлено, что гены начинают взаимодействовать рано, и их функция необходима для поддержания функции апикальной меристемы (АМ) побега. В отличие от родительских линий, у тройного мутанта клетки АМ часто утрачивали недетерминированность на ювенильной стадии развития проростка, что приводило к остановке развития растений. Подбор условий культивирования растений позволил преодолеть этот критический период и исследовать влияние мутаций на развитие листа. Показано, что листья мутанта характеризуются выраженным нарушением идентичности эпидермальных клеток верхней стороны листа и недетерминированностью - формируют вторичный край и выросты. Характерной особенностью тройного мутанта является постепенное уменьшение размера листьев, что можно объяснить нарушением функции АМ побега и снижением числа инициальных клеток в примордиях листьев верхних ярусов. Комплементарное взаимодействие генов TAE1/2 показано и в случае с геном AS2. Оно проявлялось в утрате детерминированности клеток и в более выраженном нарушении поляризации листа, развитием щитовидных структур на поверхности листьев. Известно, что белки AS1 - AS2 действуют в составе одного белкового комплекса и привлекают к генам – мишеням белки PRC2, модифицирующие хроматин, гетерохроматиновый белок LHP1 (компонент PRC1) и ДНК-метилтрансферазы. Мы предполагаем, что взаимодействуя с генами AS, гены TAE1/2 поддерживают стабильность эпигенетических изменений, необходимых для сохранения созданных в процессе развития клеточных паттернов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".