Мембранный транспорт и дистанционная передача сигналов в фотосинтезирующей клетке при локальных механических и световых воздействияхНИР

Membrane transport and long-distance signal transmission in photosynthesizing cells exposed to localized mechanical and light stimuli

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Этап 2016 г.
Результаты этапа: В работах коллектива за 2013–2015 г. найдено, что точечное мех. повреждение междоузлий Chara вызывает быстрое образование на поверхности клетки локальной щел. зоны с pH до 9.0–10.0. Быстрое возрастание рН от слабокислых или нейтральных значений при микроповреждении вероятно повышает мех. прочность клеточной стенки (КС), однако процессы, лежащие в его основе, в настоящее время мало изучены. 1. Для выяснения роли фотосинтеза в защелачивании среды при микроперфорации изучали влияние периодического локального освещения на рН в неперемешиваемом слое (НС) в области микроукола. Показано, что переходы от темноты к освещению оказывают слабое влияние на рН у поверхности клетки (pHo) в условиях сильного защелачивания после микроукола (при pHo ~10), но вызывают существенное возрастание рН (~0.5 ед.) на фоне слабощелочных значений (рН 8.0–8.5 ед.), которые достигаются через ~10 мин от момента перфорации. Предлагаемое объяснение состоит в том, что мех. повреждение клет. стенки активирует NADPH- зависимую оксидазу плазмалеммы (Suzuki 2011), сопряженную с трансмембр. переносом протонов. В этом случае входящий поток протонов и активность Н+-сопряженного фермента должны зависеть от электрохим. градиента ΔμH+ на плазматич. мембране (ПМ). При рНо ~10 и мембр. потенциале освещенных клеток около –180 мВ (цитоплазма отрицательна) распределение Н+ приближается к нернстовскому равновесию, что ограничивает максимальную скорость опосредованного переноса Н+. В процессе постепенного снижения рНо величина ΔμH+ на плазмалемме частично восстанавливается. В этих условиях доставка восст. соединений из хлоропластов в цитоплазму при запуске фотосинтеза оказывает стимулирующее влияние на перенос Н+ через ПМ. Позднее (через 30–40 мин после микроукола) сдвиги рН в ответ на локальное освещение уменьшаются вплоть до их полного исчезновения. Это говорит о восстановлении исходного состояния с неактивной NADPH оксидазой и о специфике сдвигов рН при локальном освещении в зоне повреждения. Результаты опубликованы (Физиология растений 2016). 2. Для выяснения роли движения цитоплазмы (циклоза) в защелачивании среды при микроперфорации клет. стенки измеряли рНо и флуоресценцию хлорофилла в области микроукола при локальном освещении участка клетки, расположенного выше в потоке на удалении 1.5 мм. Прослежены изменения рН в ответ на локальное освещение удаленного участка на разных временах после микроукола. Фотоиндуцированные сдвиги рНо отсутствовали в период максимального защелачивания НС, нарастали по мере постепенного снижения рНо в области укола до pH ~8.0 и полностью исчезали при восстановлении исходного уровня рН. Фотоиндуцированные сдвиги рН были меньше, чем при непосредственном освещении области перфорации (~0.1 pH), развивались с задержкой, определяемой переносом метаболита с потоком цитоплазмы, и совпадали по времени с изменениями флуоресценции F’ в области измерения. Результаты говорят о том, что экспортируемые из хлоропластов на свету метаболиты, оказывают одновременное влияние на флуоресценцию хлоропластов затененных областей и на транспорт Н+ через плазматическую мембрану. В роли интермедиата могут выступать восстановленные соединения и ассимиляты, окисляемые в цитоплазме с образованием нуклеотидов, необходимых для работы NADPH оксидазы. Хлоропласты служат поставщиком восст. эквивалентов, которые поступают к плазм. мембране как посредством диффузии, так и посредством переноса в потоке цитоплазмы. Результаты опубликованы (Физиол. раст. 2016, Protoplasma 2016). 3. Изучали изменения флуоресценции хлорофилла при дистанционной передаче метаболического сигнала, вызванного локальным освещением участка вдали от места наблюдения свечения. Построены трехмерные графики распространения волны возрастания фактической флуоресценции F’, вызванной непродолжительным (30 с) локальным световым импульсом. Показано, что механизм дистанционной регуляции фотосинтеза проявляет высокую чувствительность к ингибиторам актинового цитоскелета, а также к переходным изменениям скорости циклоза при возбуждении. Прослежены изменения амплитуды и полуширины аппроксимирующих динамику F’ гауссовых кривых в зависимости от расстояния d между источником света и зоной измерения флуоресценции, а также от скорости движения цитоплазмы. Показано, что увеличение длины пути d и снижение скорости циклоза под действием цитохалазина D вызывают уменьшение амплитуды и уширение полосы гауссовой кривой. Эти эксперим. результаты воспроизведены на основе упрощенной математической модели с учетом диффузии экспортируемого из освещенных хлоропластов метаболита (эффективный коэф. диффузии в цитоплазме ~3·10–6 см2 с) и его равномерного перемещения с потоком цитоплазмы. Эксперим. результаты опубликованы (Protoplasma 2016); рукопись статьи по результатам моделирования прошла первое рецензирование и находится на стадии доработки. Результаты моделирования индукционных изменений редокс состояния фотосистем I и II, фотогенерации мембранного потенциала и градиента протонов в хлоропластах опубликованы в журнале Photosynth. Research (2016). 4. Для выяснения возможного механизма восстановления пластохинона (PQ) и хинонного акцептора QA ФСII при поступлении восстановленных соединений из текущей цитоплазмы в хлоропласты слабо освещенных участков изучали ответные изменения флуоресценции F’ на фотостимуляцию удаленного участка при смене фоновых световых условий и действии ингибиторов. Показано, что переходные изменения флуоресценции F’ в ответ на освещение удаленного участка полностью устраняются при выключении фонового освещения незадолго (за 10 с) до приложения локального фотостимула. Это говорит о том, что восстановление QA обусловлено, вероятнее всего, фотохимическим процессом и связано с замедлением линейного потока электронов по ЭТЦ в связи с нехваткой терминальных акцепторов при доставке NADPH из цитоплазмы в строму хлоропластов. Поскольку активируемые светом ферменты, как правило, сохраняют активность на протяжении десятков секунд после затемнения, нефотохимическое восстановление QA при участии активируемых светом ферментов – NADPH–PQ редуктазы или ферредоксин–PQ редуктазы – представляется менее вероятным. Об этом же свидетельствует и тот факт, что опосредованные циклозом изменения флуоресценции в ответ на локальный фотостимул полностью сохранялись при обработке клеток ингибитором ферредоксин–PQ редуктазы, антимицином А. Длительная (3 ч) инкубация клеток в присутствии антимицина А сопровождалась небольшим усилением амплитуды опосредованных циклозом изменений флуоресценции. Результаты включены в рукопись, которая находится на стадии рецензирования. 5. Для проверки предположения об участии NADPH оксидазы плазмалеммы в быстрых ответных реакциях на микроповреждение КС исследовали влияние микроукола на концентрацию О2 у поверхности клетки с использованием амперометрических датчиков нано- и микроразмеров. Показано что микроперфорация КС приводит к резкому (на ~50%) локальному снижению уровня О2 у поверхности клетки, которое развивается одновременно с повышением рНо. Показано также, что изменения содержания О2, индуцируемые микроперфорацией КС, практически полностью подавляются дифенилениодониумом, известным ингибитором NADPH оксидазы плазмалеммы. Доставку восст. соединений (ассимиляты и NADPH) в цитоплазму из освещенных хлоропластов можно нарушить добавлением метилвиологена, который переключает СО2-зависимый поток электронов на путь восстановления О2 до воды. Обработка клеток хары этим ингибитором подавляла сдвиги рН в ответ на микроперфорацию. Вместе с тем, ингибитор дыхания митохондрий, цианид не оказывал заметного влияния на изменения рН при микроуколе, что подтверждает предполагаемую связь наблюдаемых изменений с активностью NADPH оксидазы плазмалеммы. Полученные данные планируется использовать для подготовки статьи в 2017 г.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Этап 2017 г.
Результаты этапа: 1. Показано, что изменения флуоресценции хлорофилла F’, отражающие перенос метаболического сигнала с потоком цитоплазмы от места локального освещения в затенённые части клетки, проявляются наиболее ярко под наружными кислыми зонами и практически отсутствуют в области расположения щел. зон. Несмотря на отсутствие изменений F’ в области щел. зон, реакция плазматической мембраны на удаленное локальное освещение сохранялась и проявлялась в переходном возрастании рНо при прохождении «облученной» цитоплазмы через область измерений рН и F’. Следовательно, подавление анализируемого сигнала флуоресценции в области щел. зон связано не с прекращением латерального переноса веществ в потоке цитоплазмы, а с нарушением обмена метаболитов между хлоропластами и цитоплазмой или с нарушением процессов, ведущих к восстановлению хинонного акцептора QA при поступлении восстановительных эквивалентов в строму затененных хлоропластов. Установлено, что различия в амплитуде сигналов флуоресценции F’ под кислыми и щел. зонами не связаны напрямую с неравномерным распределением клеточных структур, таких как харосомы. Об этом говорит обратимая модуляция опосредованных циклозом изменений F’ и рНо в разных частях клетки при переходах между зональным и равномерным распределением рН. В отличие от этого, распределение харосом нарушается лишь при длительных (несколько суток) экспозициях клеток на свету или в темноте. При сглаживании профиля рНо после периода темновой адаптации амплитуда циклоз-зависимых изменений F’ на слабом фоновом свету в области исходных щел. зон возрастала, а в области исходно кислых зон – снижалась. Предположено, что различия в проявлениях дальней регуляции могут быть обусловлены неравным количеством метаболитов (триозофосфаты и восстановительные эквиваленты), экспортируемых из хлоропластов в участках с активным и неактивным фотосинтезом, а также различиями рН цитоплазмы в зонах выведения и поглощения протонов. Результаты опубликованы в журнале Biochim. Biophys. Acta – Bioenergetics (2017). Результаты математического моделирования изменений флуоресценции F’ в ответ на локальное освещение удаленного участка клетки в зависимости от скорости движения цитоплазмы и от времени с момента предшествующей генерации потенциала действия, вошедшие в отчет за 2016 г., опубликованы в электронном виде на сайте журнала Functional Plant Biology (2017) в разделе Online Early. 2. Установлено, что продольные профили рН на поверхности междоузлий Chara и квантового выхода (КВ) фотореакции ФСII зеркально симметричны при относительно высоких интенсивностях света. Однако корреляция КВ ФСII и рНо исчезает при низких интенсивностях общего освещения: распределение КВ ФСII по длине клетки становится полностью однородным, несмотря на сохранение отдельных щелочных пиков в продольном профиле рНо. Это говорит о том, что фотосинт. перенос электронов контролируется содержанием СО2 при сравнительно высокой освещенности, но не зависит от содержания СО2 в примембранных слоях среды при низкой освещенности, когда лимитирующим фактором фотосинтеза становится световой поток, а не доступность СО2. Результаты опубликованы в журналах Biochim. Biophys. Acta (2017) и Plant Signaling and Behavior (2017). 3. С помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии, рН-микросенсоров и микрофлуорометрии с импульсно-модулированным освещением, показано, что пространств. координация КВ ФСII и потоков Н+ через плазм. мембрану исчезает на слабом свету, при локальном мех. повреждении клеточной стенки (КС), а также при действии хим. агента, вортманнина, нарушающего метаболизм фосфоинозитидов. Понижение освещенности сглаживало продольный профиль КВ ФСII при сохранении перепадов рН; с другой стороны, повреждение КС кончиком стеклянной микропипетки вызывало быстрое локальное повышение рНо на 2–2,5 ед. рН, напоминающее формирование щел. областей в нативной клетке. Несмотря на кажущееся сходство, щел. зоны интактных клеток исчезали при действии вортманнина, а подщелачивание среды при микроперфорации было нечувствительно к этому препарату. Кроме того, сглаживание профиля рНо при действии вортманнина сопровождалось усилением пространственной неоднородности КВ ФСII и скорости фотосинт. переноса электронов, что указывает на сложность взаимодействий между хлоропластами и плазм. мембраной. Сделан вывод о том, что образование щел. областей на поверхности клетки при действии света и микроповреждении обусловлено разными ионотранспортными системами. Результаты опубликованы (Plant Signaling and Behavior, 2017). 4. С помощью электрохимических микродатчиков О2 и рН изучены физ.-хим. процессы, развивающиеся при микроповреждении клеточной стенки (КС) междоузлий гигантских клеток водоросли Chara corallina. Показано, что локальное снижение конц-ии О2 на поверхности клетки при микроперфорации КС протекает одновременно с возрастанием рНо или опережает сдвиги рНо. Вызванные повреждением изменения рО2 были нечувствительны к диурону (ингибитор потока электронов на акцепторной стороне ФСII) и к цианиду (ингибитор митохондриальной цитохромоксидазы), но подавлялись под действием метилвиологена, а также при понижении гидростатического давления внутри клетки путем добавления сахарозы в наружный раствор. Результаты подтверждают предположение об участии NADPH оксидазы плазм. мембраны в ранних ответных реакциях растит. клетки на повреждение. Эти данные были представлены на международных конгрессах и симпозиумах и опубликованы в виде тезисов в журналах European Biophysics Journal (2017) и FEBS Journal (2017).
3 1 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. Мембранный транспорт и дистанционная передача сигналов в фотосинтезирующей клетке при локальных механических и световых воздействиях
Результаты этапа: Для понимания причин неравных изменений флуоресценции F’ в Хп, лежащих под кислыми и щел. зонами, изучали циклоз-зависимые изменения F’, выбирая различные сочетания значений рНо в местах расположения световода и в зоне регистрации свечения (при равных расстояниях между оптоволокном и местом регистрации F’). В четырёх выбранных конфигурациях выводимый из Хп метаболит перемещался в разных вариантах: (1) двигался с потоком в пределах наружной кислой зоны, (2) переходил из кислой зоны в щелочную, (3) двигался в пределах щел. зоны, и (4) проходил из щел. зоны в кислую. Эти варианты опыта позволяли разграничить влияние рНо на начальные и конечные стадии передачи сигнала. Если главным фактором служит достаточное содержание СО2 для синтеза триозофосфатов, то в конфигурациях (1 и 2) ожидаются изменения F’ одинаково высокой амплитуды, а в вариантах (3 и 4) изменения F’ должны быть малы. Результаты опытов не подтверждают эту гипотезу. Величина рНо в зоне образования фотометаболитов (в зоне расположения световода) не играла заметной роли, тогда как рНо области, где метаболит поступает в строму пластид (зона измерения F’) чётко коррелировала с амплитудой сдвигов F’. В конфигурациях 1 и 4 изменения F’ были большими и почти равными, а в конфигурациях 2 и 3 изменения были слабыми. Следовательно, различия ответов F’ нельзя объяснить тем, что Хп кислой зоны образуют под ярким лучом намного больше ассимилятов, чем Хп участков с высоким рНо. Результаты говорят о том, что нарушения дальней передачи индуцированного светом сигнала в участках клетки с рНо ~10.0 вызваны понижением рН цитоплазмы и активности участвующих ферментов, а не дефицитом СО2, лимитирующим синтез метаболитов в области яркого освещения. Результаты опубликованы (Protoplasma 2018). Для выяснения путей восстановления пластохинона (PQ) и акцептора QA ФСII при импорте NADPH и триозофосфатов из цитоплазмы в затенённые Хп изучали изменения флуоресценции F’ в ответ на локальные фотостимулы в отсутствие фонового освещения и при действии ингибиторов. В плане на 2018 г. отмечали, что восстановление хинонов после поступления восст. соединений в строму Хп может быть обусловлено не только фотохим. процессом, но и темновым потоком электронов от NADPH в пул переносчиков между ФСII и ФС I. Устранение фонового освещения исключает восстановление QA фотосистемой II. При выключении фонового света одновременно с включением локального освещения ответная реакция F’ на локальное освещение сохранялась, но была меньше, чем при фоновой подсветке. Скорость спада сигнала F’ была намного ниже, чем в контроле на фоновом свету. Замедление релаксации сигнала F’ обусловлено тем, что на фоновом свету в окислении QA участвует ФСI, тогда как в темноте ФСI неактивна и окисление PQ и QA осуществляет терминальная оксидаза (PTOX). Обработка клеток антимицином А, подавляющим циклич. поток электронов на участке от ферредоксина до PQ, слабо сказывалась на изменениях F’ на фоновом свету, но устраняла реакцию F’ на удаленное локальное освещение в темновых условиях. Следовательно, циклоз-зависимое восстановление QA in vivo может осуществляться и фотохимическим и нефотохим. механизмами, а при действии антимицина А сохраняется лишь фотохим. путь. Темновые изменения F’ исчезали также в присутствии нигерицина, который ускоряет отток электронов из пула PQ, снижая градиент Н+ на мембране тилакоидов. Прослежена зависимость амплитуды антимицин-чувствительных изменений F’ от длительности темновой фазы, предшествующей воздействию локального светового импульса, и показано, что выдерживание клетки в темноте в течение 5 мин полностью инактивирует опосредованные циклозом изменения F’ в затемненных клетках. Это говорит о световой зависимости ферментов, участвующих в нефотохимическом восстановлении QA. Результаты опубликованы (Protoplasma 2018). Влияние темновой и световой адаптации на пути фотосинт. переноса электронов у цианобактерий в сравнении с зелеными растениями рассмотрено в статье, опубликованной в журнале BBA-Bioenergetics (2018). При изучении дальнего транспорта метаболитов в клетках Chara исходно полагали, что соединения, выводимые из Хп на ярком свету, переносятся в потоке цитоплазмы в свободном виде. Вместе с тем известно, что многие субстраты и белки транспортируются в пределах клетки в составе везикул. Априори нельзя исключить участия везикулярного транспорта в дальней передаче регуляторного сигнала у харовых водорослей. В связи с этим было изучено влияние ингибиторов везикулярного транспорта на изменения флуоресценции F’ и изменения рНо, индуцируемые локальным освещением удаленного участка клетки. Некоторые ингибиторы везикулярного транспорта (LY294002, Ikarugamycin) замедляли движение цитоплазмы, что осложняло анализ результатов. Ясные результаты были получены при использовании брефелдина А (BFA), который не оказывал существенного влияния на скорость течения цитоплазмы. В контрольных условиях волна возрастания флуоресценции F’ распространялась в направлении потока со скоростью меньшей, чем скорость течения цитоплазмы. Обработка клеток ингибитором везикулярного транспорта BFA не оказывала существенного влияния на скорость течения, но заметно ускоряла скорость латеральной передачи регуляторного сигнала, что проявлялось в более раннем достижении переходного пика F’ от момента приложения светового импульса. Сделан вывод, что нарушение везикулярного транспорта под действием BFA не замедляет, а ускоряет латеральное перемещение регуляторного метаболита. Такое влияние BFA может быть связано с уменьшением суммарной эффективной поверхности эндоплазматических везикул, что ослабляет влияние неспецифического связывания и диссоциации фотометаболита на поверхности везикул и ускоряет его латеральный транспорт. Результаты опубликованы в книге Chloroplasts and Cytoplasm (2018). По итогам изучения сдвигов рН и рО2 после микроукола клеточной стенки подготовлена рукопись статьи. В дополнение к намеченным заданиям на 2018 г, флуориметрический метод регистрации дальнего транспорта фотометаболитов был применен для изучения трансклеточного переноса веществ. Показано, что измерения модулированной флуоресценции хлорофилла на препаратах сдвоенных (тандемных) интернодальных клеток открывают новый подход к изучению транспорта метаболитов через плазмодесмы - цитоплазматические каналы в клеточных стенках. Прямым методом определено время преодоления трансклеточного барьера для метаболитов, экспортируемых освещенными хлоропластами. Умеренное повышение осмотического давления среды вызывало закрывание плазмодесм, не оказывая влияния на внутриклеточный транспорт. Результаты представлены на международной конференции Biomembranes 2018. Статья по данному разделу прошла рецензирование в журнале Protoplasma и получила в целом положительную оценку; в настоящее время рукопись находится в редакции на повторном рассмотрении.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".