Микробные сообщества лишайников арктической и субарктической зон северного полушарияНИР

Microbial communities of lichens of the Arctic and subarctic zones of the Northern hemisphere

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Определение численности, таксономического состава и локализации прокариотных сообществ кустистых лишайников Мурманской области - этап 2016 года
Результаты этапа: Основными задачами этапа работы 2016 года являлись: 1) Определение численности, таксономического состава и локализации прокариотных сообществ кустистых лишайников, отобранных в районе хребта Хибины Мурманской области методом флуоресцентной микроскопии (FISH) и метом анализа библиотек гена 16S рРНК. 2) Выделение в монокультуры и характеристика бактерий, доминирующих в составе бактериальных сообществ по результатам флуоресцентного и молекулярного анализа. Выявление штаммов бактерий, способных к гидролизу олиго- и полисахаридов, проведено их таксономическое и функциональное описание. Составлена коллекции штаммов бактерий, выделенных из трех зон талломов: апикальной, стволовой и деградирующей. 3) Создание коллекции водных и спиртовых экстрактов талломов лишайников для последующего химического анализа и использования в физиологических экспериментах. 4) Получение аксеничных культур фото- и микобионтов, создание коллекции для последующей постановки модельных экспериментов. 5) Определение методом рендомизированного и направленного скрининга функциональных генов прокариот для последующего создания и анализа библиотек клонов. Успешно выполнены были пункты плана с 1 по 3, и, частично, 1 и 4. Для выполнения 5-го и второй части 1-го пункта оказалось недостаточным финансирование. Впервые обнаружена структурная дифференциация бактериальных сообществ в талломах кустистых и листоватых лишайников в зависимости от степени деструкции таллома. Филогенетическая структура бактериального компонента лишайников оказалась лабильной. Наиболее характерным изменениям численности подвержены бактерии групп Acidobacteria, Actinobacteria, Cytophaga-Bacteroidetes и Грам-положительных бактерий с низким соотношением ГЦ. Динамика численности быстрорастущих бактерий филогенетических групп Gammaproteobacteria и Betaproteobacteria оказалась связанной со степенью деструкции таллома. Впервые получены данные о специфической приуроченности бактерий гидролитического комплекса и ацидобактерий к определённой стадии существования таллома конкретного вида. Получение таких данных позволяет сделать косвенный вывод об участии главных симбионтов лишайника в формировании специфического бактериального комплекса в течение всего периода жизнедеятельности. Впервые благодаря раздельному скринингу гомогенатов и смывов талломов удалось выявить различия между эпифитной и эндофитной бактериальной микрофлорой талломов 4 видов лишайников. Впервые показана связь между эпибионтным и эндобионтным бактериальными сообществами в зависимости от стадии разложения талломов лишайников. Показано, что доля эндобионтов - бактерий группы Alphaproteobacteria уменьшается с увеличением степени деструкции таллома, тогда как эпифитный пул представителей этой группы остаётся практически неизменным. Установлено, что с увеличением степени деструкции (особенно в терминальной стадии) значительно возрастает численность бактерий филогенетических групп Acidobacteria и Actinobacteria как в эпифтной, так и в эндофитной части сообщества. Впервые для изученных видов лишайников показано различие в динамике инвазивных (активно проникающих в таллом) и неинвазивных (развивающихся в виде плёнок на поверхности таллома) групп гидролитиков. Установлено, что представители группы Acidobacteria являются постоянными компонентами как эпифитного, так и эндофитного сообщества изученных видов лишайников. Их численность зависит исключительно от двух факторов – вида лишайника и степени разложения таллома. Установлен их исключительный вклад (до 45%) в гомогенатах растущей зоны лишайника Alectoria ochroleuca и разлагающегося таллома Nephroma arcticum (до 35%). Ацидобактерии принимают активное участие а процессах деструкции таллома на всех этапах его разложения. Кроме того, они являются компонентом эндобионтного микробного сообщества растущей части лишайников, и их функция по-прежнему остаётся загадкой. Выделено и охарактеризовано 6 штаммов представителей Acidobacteria. Два штамма ацидобактерий, выделенных из срединной и разлагающейся частей Cladonia uncialis принадлежали описанному ранее роду Terriglobus, для которого приоритетными субстратами оказались пектин и бактериальные полисахариды. Два штамма ацидобактерий, филогенетически близких к роду Acidobacterium, получены из лишайника Cetraria islandica. Мы оцениваем их как перспективные для описания нового рода в пределах семейства Acidobacteriaceae. Два новых штамма ацидобактерий, приуроченных к Nephroma arcticum и Alectoria ochroleuca оказались филогенетически близкими роду Granulicella, описанному ранее руководителем данного проекта. Все штаммы были способны к деструкции полисахаридов: пектина, ксилана, бактериальных полисахаридов, маннана, ламинарина. Из природных экосистем полуострова Киндо для последующего анализа микробных сообществ отобрано и идентифицировано 39 видов эпигейных, эпилитных и эпиксильных лишайников. Список включает следующие виды: Arctoparmelia centrifuga (L.) Hale ; Bryoria lanestris (Ach.) Brodo et D. Hawksw; Cetraria islandica (L.) Ach.; Cladonia amaurocraea (Flörke) Schaer.; Cladonia arbuscula (Wallr.) Flot.; Cladonia cenotea (Ach.) Schaer.; Cladonia cornuta (L.) Hoffm; Cladonia deformis (L.) Hoffm. ; Cladonia grayi G. Merr. ex Sandst..; Cladonia pleurota (Flörke) Schaer.; Cladonia rangiferina (L.) F. H. Wigg.; Cladonia squamosa Hoffm.; Cladonia stellaris (Opiz) Pouzar et Vězda; Cladonia uncialis (L.) F. H. Wigg.; Evernia prunastri (L.) Ach.; Hypogymnia physodes (L.) Nyl.; Icmadophila ericetorum (L.) Zahlbr.; Lobaria scrobiculata (Scop.) DC.; Melanelia stygia (L.) Essl.; Melanohalea septentrionalis (Lynge) O. Blanco et al.; Nephroma arcticum (L.) Torss.; Nephroma parile (Ach.) Ach.; Parmelia saxatilis (L.) Ach.; Parmelia sulcata Taylor.; Peltigera aphthosa (L.) Willd.; Peltigera canina (L,) Willd.; Peltigera leucophlebia (Nyl.) Gyeln.; Peltigera malacea (Ach.) Funk.; Peltigera membranacea (Ach.) Nyl.; Phaeophyscia orbicularis (Neck.) Moberg.; Platismatia glauca (L.) W. L. Culb. et C. F. Culb.; Ramalina pollinaria (Westr.) Ach.; Sphaerophorus fragilis (L.) Pers.; Stereocaulon depressum (Frey) I. M. Lamb;Tuckermannopsis chlorophylla (Willd.) Hale; Umbilicaria hyperborea (Ach.) Hoffm.; Usnea subfloridana Stirt.; Vulpicida pinastri (Scop.) J.-E. Mattsson et M. J. Lai; Xanthoria sorediata (Vain.) Poelt. Из лишайников, отобранных в Мурманской области получены спиртовые и водные экстракты, содержащие, согласно литературным данным набор биологически активных соединений, включая: алекторовую, барбатовую, вульпиновую, гипотамноловую, грайяновую, изоусниновую, каператовую, колензоиновую, констиктовую, лихестериновую, лобаровую, норкаператовую, норстиктовую, париетиновую, пинастриновую, протолихестериновую, протоцетраровую, салациновую, скваматовую, стиктовую, тамноловую, урсоловую, усниновую, усниновую, физодаловую, физодовую, фумарпротоцетраровую, эверновую, метиловый эфир дигидроконстипатовой кислоты, эргостерол, фунгистерол, стигмастерол, ситостерол, лупаеол, амирин, дифенил и дифениловый эфир, карвон, камфора, борнеол, сесквитерпен, этилгематоммат, зеорин и беллидифлорин, атранорин, пара-скробикулин, мета-скробикулин, скробикулин, атранорин, зеорин транорин, хлоратранорин, атранорин, хлоратранорин, хлоратранол, 30-нор-21α-гопан-22-он, β-орсинолкарбоксилат, париетин, телосхистин, фаллацинал, эмодин. Активность экстрактов мы планируем тестировать на выделенных из лишайников штаммах бактерий и дрожжей. Выделены в чистые культуры микобионты трёх видов кустистых лишайников: Cladonia stellaris, Cladonia arbuscula и Cladonia rangiferina. Для выделения были использованы питательные среды, содержащие в качестве бактериостатических компонентов налидиксовую кислоту и ампициллин. Данные культуры мы планируем использовать в дальнейших экспериментах по воссозданию модельных лишайников на основе микобионтов, фотобионтов и выделенных из перечисленных видов лишайников бактерий и дрожжей. Все вышеизложенные результаты обладают значительной научной новизной. Это не удивительно, так как о биологии и функциях прокариот в составе микробных сообществ известно очень мало. Тот факт, что среди них есть стабильные и мобильные группы, активность которых зависит от степени деструкции таллома и от вида лишайника, обладает абсолютной новизной в сравнении с зарубежными данными. Мы предлагаем новые стратегии исследования функциональной роли прокариотных микроорганизмов и дрожжей в лишайниках: исследование динамики численности и относительного вклада в микробное сообщество представителей крупных таксонов, для большинства представителей которых характерна определённая экологическая и функциональная нагрузка. Именно такой подход позволяет вычленить мобильные и стабильные группы микроорганизмов, обитающих в различных видах лишайников и лишайниках одного вида, отобранных в контрастных по своим характеристикам экосистемах. Статистический и филогенетический анализы в совокупности обладают приоритетной новизной по сравнению с традиционными метагеномными, филогенетическими методами, применяемыми мировым научным сообществом в отношении комплексных микробных систем и симбиозов. Сохраняя приоритет в культивировании ацидобактерий, в данной работе нами были выделены из лишайников новые штаммы этой группы, что является несомненным достижением мирового уровня первого этапа проекта.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Определение численности, таксономического состава и локализации микробных сообществ кустистых лишайников Мурманской области - этап 2017 года
Результаты этапа: Полученные в 2017 году важнейшие результаты 1. Впервые получены приоритетные по уровню новизны данные о таксономическом составе и численности дрожжевых сообществ лишайников Мурманской области. Впервые получены приоритетные по уровню новизны данные о таксономическом составе и численности дрожжевых сообществ лишайников Мурманской области. Данная работа является первым в мире исследованием дрожжевой микрофлоры северотаёжных лишайников. Впервые к дрожжевым сообществам применён подход, позволяющий учесть особенности распределения их численности и таксономического разнообразия в зависимости от онтогенетических особенностей лишайниковых талломов. Исследованы численность и видовое разнообразие дрожжевых грибов, обитающих на лишайниках на территории полуострова Киндо (Карелия). Всего было проанализировано 14 видов лишайников родов Bryoria, Cladonia, Hypogymnia, Icmadophila, Nephroma, Peltigera и Ramalina. Для оценки численности и разнообразия применены методы посева на агаризованные среды и идентификация по гену 18S рРНК. Показано, что по численности культивируемых форм дрожжевых грибов лишайники занимают промежуточное положение между растительным покровом и почвой. Средняя численность дрожжей на лишайниках составляла около 2.5 тыс. КОЕ/г, тогда как на растениях она превышала 8 тыс. КОЕ/г, а в почве едва достигала 1 тыс. КОЕ/г. Также существует значительная вариабельность дрожжевого населения различных частей лишайников рода Cladonia по численности, видовому разнообразию и структуре сообществ. Наибольшие численность и разнообразие дрожжей обнаружены в ростовой зоне. В ходе проведенного исследования с лишайников были выделены 15 видов дрожжевых грибов: 6 базидиомицетовых и 9 аскомицетовых видов. Дрожжевое население лишайников, в отличие от почв и растений, преимущественно состояло из аскомицетовых видов дрожжей, среди которых доминировал вид Candida sphagnicola и анаморфные дрожжевые формы рода Dothiora. Полученные результаты показывают, что дрожжевые грибы самых разных таксономических и экологических групп являются обязательным компонентом лихенобиоты, однако в лишайниковой дернине северотаёжных лесов создаются условия для сохранения и развития специфичных дрожжевых сообществ, которые значительно отличаются от типичных дрожжевых комплексов филлосферы растений, а также почв. Выделен и частично охарактеризован новый для науки таксон уровня вида или рода, филогенетически близкий к Phaffia sp. CBS 11768, выделенному из почвы в Германии, и отличающийся, примерно, на 8% от вида Phaffia rhodozyma по нуклеотидной последовательности D1/D2 доменов рДНК. Качалкин А.В., Глушакова А.М., Панкратов Т.А. Дрожжевое население лишайников полуострова Киндо // Микробиология, 2017. Т. 86, № 6. С. 762-769. 2. Проведён анализ филогенетической структуры 4 видов лишайников Мурманской области (Хибины) и впервые предложен подход к оценке характера присутствия отдельных филогенетических групп бактерий в лишайниках. Проведён анализ филогенетической структуры 4 видов лишайников Мурманской области (Хибины) и впервые предложен подход к оценке характера присутствия отдельных филогенетических групп бактерий в лишайниках. Методом флуоресцентной in situ гибридизации изучены бактериальные сообщества четырёх видов лишайников Мурманской области. Показано, что максимальная численность бактерий зависит от вида лишайника и зоны таллома. Выявлены доминирующие группы бактерий: Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria. В работе впервые определены критерии оценки факультативности и облигатности присутствия бактерий в микробных сообществах лишайников и предложены подходы к классификации бактериальных сообществ лишайников на основании взаимозависимости разных групп бактерий. В качестве главного критерия при оценке облигатности группового присутствия бактерий предложен коэффициент вариации численности бактерий-представителей отдельных значимых филогенетических групп при оценке численности в трёх зонах таллома лишайника – зоне роста, старения и разложения. Корреляционный, дисперсионный анализы и анализ коэффициентов вариации долей участия представителей отдельных филогенентических групп бактерий выявил положительную связь между гидролитическим и негидролитическим блоками бактериального сообщества, а также установлено наличие взаимной конкуренции двух групп гидролитического блока – актинобактерий и фирмикут. Выявленный корреляционным анализом характер взаимодействия отдельных групп бактерий показал положительную связь представителей Proteobacteria с Actinobacteria, а характер и сила корреляции численности представителей Proteobacteria и Firmicutes зависела от вида лишайника и химического состава таллома. Результаты исследования показали, что необходима детализация получаемых данных с применением более специфичных зондов (на отдельные роды и группы внутри порядков). Панкратов Т.А.. Бактериальные комплексы лишайников Хибин на примере Cladonia uncialis, C. portentosa, Alectoria ochroleuca, и Nephroma arcticum // Микробиология, 2018. Т. 87, № 1. (в печати). 3. Выделение нового для науки таксона – рода и вида в пределах семейства Beijerinckiaceae. Применение нового состава питательных сред и технологии культивирования, испытанные ранее при выделении труднокультивируемых и «некультивируемых» групп бактерий, позволило выделить из лишайников набор штаммов, относящихся к семействам Acidobacteriaceae, Beijerinckiaceae, Oxalobacteraceae, Acetobacteraceae и других. Из лишайников Ramalina pollinaria и Cladonia cornuta, собранных на территории ББС МГУ, выделен и частично охарактеризован представитель нового рода и нового вида азотфиксирующей, факультативно метилотрофной бактерии ‘Azomethylobacterium lichenicolous’ в пределах семейства Beijerinckiaceae. Это психроактивный микроорганизм, способный к деструкции лишайниковых полимеров, а также ламинарина. Его способность к фиксации молекулярного азота подтверждает тезис о значительном вкладе бактерий порядка Rhizobiales в снабжение лишайников биологически доступным азотом. Синтез этими бактериями каротиноидных пигментов позволяет предположить их участие в защите таллома лишайника от ультрафиолетового излучения. В настоящее время проверяется способность этих штаммов к фиксации метана и молекулярная оценка наличия и структуры генов, кодирующих метанмонооксигеназы. Pankratov T.A., Berestovskaya Ju.J., Kostrikina N.A.Grouzdev D.S. Azomethylobacterium lichenicolous gen. nov, sp. nov., a new facultative methylotrophic member of the family Beijerinkiaceae from lichen talli Ramalina pallinaria and Cladonia arbuscula (IJSEM, 2018, in preparation). 4. Выделен и охарактеризован новый для науки род и вид семейства Acidobacteriaceae, способный к гидролизу микробных полисахаридов, целлюлозы. Выделен и охарактеризован новый для науки род и вид семейства Acidobacteriaceae, способный к гидролизу микробных полисахаридов, целлюлозы. Новый штамм, в дополнение к ранее выделенному из сфагнового болота, получен из разлагающейся части таллома лишайника Cladonia sp. Новая культура характеризуется медленным ростом, способностью к потреблению узкого спектра сахаров (раффиноза, рамноза, фруктоза, глюкоза, ксилоза), а также к гидролизу микробных полисахаридов, ламинарина, целлюлозы. Для этого нового рода показан ярко выраженный, зависимый от субстрата клеточный полиморфизм, что отличает его от прочих ранее описанных родов и видов внутри семейства Acidobacteriaceae. Belova S.E., Pankratov T.A., Dedysh S.N. Polymorphosoma tundrae gen. nov, sp. nov. – a new member family Acidobacteraceae from lichen and cellulolytic environment (IJSEM, 2018, in preparation). 5. Впервые получены данные о численности отдельных представителей фотобионтов в лишайниках рода кладония. Выделены в бактериологически чистые культуры водоросли родов Asterochloris и Chlorella, являющиеся фотобионтами лишайников рода Cladonia. Проведено сравнение численности фотобионтов в верхней и нижней зонах роста лишайников. Эти исследования обладают значительной научной новизной, так как ранее методика количественного учёта водорослей в различных частях таллома и при сравнении лишайников субарктических и аридных зон не применялась. Впервые получены аксеничные культуры водорослей из талломов лишайников. 3.7. Участие в научных мероприятиях по тематике Проекта за период, на который предоставлен грант (каждое мероприятие с новой строки, указать названия мероприятий и тип доклада) 1-й международный микробиологический конгресс, Пущино, 17-19 октября 2017 г., стендовый доклад, Панкратов Т.А., Качалкин А.В. System Biology and Bioinformatics the ninth international young scientists school SBB-2017, Yalta, Republic of the Crimea, 25-30 June 2017, стендовый доклад, Il'ina E.S., Korchikov E.S. 3.10. Адреса (полностью) ресурсов в Интернете, подготовленных авторами по данному проекту, например, http://www.somewhere.ru/mypub.html Нет 3.11. Библиографический список всех публикаций по Проекту, опубликованных за период, на который предоставлен грант, в порядке значимости: монографии, статьи в научных изданиях, тезисы докладов и материалы съездов, конференций и т.д. Панкратов Т.А., Качалкин А.В., Корчиков Е.С., Добровольская Т.Г Микробные сообщества лишайников (Обзор) // Микробиология. 2017. Т. 86. № 3. С. 265–283. Pankratov, T.A., Kachalkin, A.V., Korchikov, E.S., Dobrovol’skaya, T.G., Microbial communities of lichens // Microbiology (Moscow), 2017, vol. 86, no. 3, pp. 293–309. Качалкин А.В., Глушакова А.М., Панкратов Т.А. Дрожжевое население лишайников полуострова Киндо // Микробиология, 2017. Т. 86, № 6. С. 762-769. Kachalkin, A.V., Glushakova A.M., Pankratov T.A. Yeast population of the Kindo peninsula Lichens // Microbiology (Moscow), 2017, Vol. 86, No. 6, pp. 786–792. Панкратов Т.А., Качалкин А.В. Микробные сообщества лишайников субарктической зоны России: структура и особенности локализации // 1-й микробиологический Конгресс, Материалы межд. Конференции, 17 – 19 октября 2017 г., Пущино. C. 69-70. Il'ina E.S., Korchikov E.S. Mycobiont and photobiont of lichen Cladonia arbuscula getting in vitro. Abstracts:System Biology and Bioinformatics the ninth international young scientists school SBB-2017, Yalta, Republic of the Crimea, 25-30 June 2017. P. 39.3.14.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Идентификация бактерий, дрожжей и анализ численности отдельных таксономических и физиологических групп бактерий в лишайниках Мурманской области, ЯНО и Самарской области - этап 2018 года
Результаты этапа: Завершено таксономическое описание и валидация нового рода бактерии семейства Acidobacteriaceae – Acidisarcina polymorpha. Клоны, филогенетически близкие к новому таксону ранее были найдены в различных природных средах, включая разлагающийся дебрис лишайников и почвы под ними, а также в торфяных почвах. Представители этого класса и порядка широко распространены в эпифитной и эндофитной частях талломов лишайников, что подтвердили исследования геномного секвенирования. Новый микроорганизм обладает способностью осуществлять гидролиз полисахаридов: хитина, целлюлозы, пектина, ксилана, бактериальных капсульных полисахаридов. Проведен полногеномный анализ микроорганизма. Выявлен ряд ферментов (гликозилгидролаз), отвечающих за разрушение гликозидных связей в полисахаридах. Для выделенных бактерий характерны высокая экологическая лабильность и выживаемость в суровых условиях окружающей среды. Это объясняется рядом особенностей и специфических приспособлений. Ультраструктурная особенность Acidisarcina заключается в том, что клетки находятся во внеклеточных отсеках, образуя мешочковые камеры. Аналогичные структуры были ранее описаны для радиационно стойких псевдомонад. Эти камеры могут служить структурной адаптацией с защитной функцией для выживания в агрессивной среде. Точные механизмы еще предстоит исследовать, но наличие целлюлозосинтазы (оперон bcs) в штамме SBC82T позволяет предположить ее участие в синтезе оболочки камеры, продуцируемой этими бактериями. Подобные bcs опероны обнаружены у видов ацидобактерий, выделенных из арктических тундровых почв. Геномный потенциал биосинтеза трегалозы также может способствовать защите ацидисарцин от холодового стресса, а также играть роль в защите талломов лишайников от разрушения при отрицательных температурах. Защита от холода может быть также включена белками домена, связывающими ДНК холодного шока, CspA, идентифицированными в геноме штамма SBC82T. Аналогичные механизмы защиты от холода были обнаружены в бактериях порядка 1 класса Acidobacteria, которые изолированы из арктических тундровых почв. Чрезвычайно широкий репертуар ферментов, участие в деградации различных полимеров, включая хитин, целлюлозу и ксилан, по-видимому, является одной из основных причин высокой экологической значимости этих бактерий, в том числе и для развития и деструкции лишайниковых симбиозов. Проведено таксономическое описание, охарактеризован новый род и семейство внутри порядка Rhizobiales. Уточнение филогенетического положения двух ранее выделенных штаммов (отчет второго года) RmlP001 и RmlP026 позволило отнести их к новому семейству cand. ‘Lichenibacteriaceae’ и новому роду внутри этого семейства cand. ‘Lichenibacterium’ с двумя новыми видами ‘L. ramalinii’ и ‘L. minor’. Выделенные культуры депонированы во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ) и Корейскую коллекцию типовых культур (KCTC). Описанные культуры способны к росту на сахарах, сахарных спиртах (маннит, арабит) этаноле и изопропаноле. Но не способны использовать в качестве источника углерода карбоновые и легкие жирные кислоты и их соли. Исключение составляет сукцинат, который может использоваться в качестве источника углерода некоторыми штаммами. Выделенные бактерии способны к гидролизу ламинарина, крахмала, ксилана и низкомолекулярных фракций капсульных полисахаридов. И не способны гидролизовать целлюлозу, хитин. Детальное исследование этих штаммов на наличие генов, кодирующих метанмонооксигшеназу, метилтрансферазу, метанолдегидрогеназу и других генов, ответственных за использование C1 субстратов, не позволило обнаружить этих генов или их аналогов в геномах обоих штаммов. Применение классических праймеров для идентификации нитрогеназы также не дало положительных результатов. Рост на безазотистых средах, предполагавший наличие нитрогеназы (nifH), возможно обусловлен функционированием новой, неизвестной системой генов, присутствующих в неаннотированной части полных геномов обоих штаммов. Некоторые гомологи генов белков, отвечающих за нитрификацию и денитрификацию, были найдены в неааннотированной части генома. Такая же ситуация в отношении генов, кодирующих ферменты синтеза изопреноидов (предшественников каротиноидов, и в частности, бета-каротина): в аннотированной части генома их нет, но их гомологи присутствуют в неаннотированной части генома. Полногеномный анализ штаммов позволил аннотировать только 26% всех генов. Штамм RmlP026 является активным продуцентом бета-каротина. Возможно, что бактерии этого рода, которые являются эндобионтами, способствуют защит талломов лишайников от окислительного стресса и ультрафиолетового облучения. Нет полной ясности и в отношении генов систем нодуляции, отдалённые гомологи которых были найдены в неаннотированной базами RAST и NCBI части геномов. В этом же отчётном году, на основании имеющихся данных о морфологии и структуре гена 16S рРНК удалось изолировать из других лишайников несколько новых штаммов, родственных штамму RmlP026 (99 и 100%), а также штаммы, представленные новыми видами этого рода, выделенными из лишайников Cladonia pleurota, C. arbuscula и C. stellaris. В данным момент публикация готова на 95% к отправке в редакцию журнала Systematic and Applied Microbiology. Проведён скрининг полученных из лишайников культур на способность подавлять рост патогенных микроорганизмов: Staphilococcus aureus, Aspergillus niger, Esherichia coli. Ряд культур (Paenibacillus sp.; Paraburkholderia bryophila; Brevibacillus nitrificans; Sphingomonas sp.) обладали подавляющей активностью (диаметр зон подавления варьировал от 8 до 20 мм), однако большинство выделенных и протестированных культур, в том числе представители порядка Rhizobiales, а также все штаммы Acidobacteria такой активностью не обладали. Проверка ингибирующей рост активности бактериальных штаммов была проведена в отношении нескольких доминирующих видов дрожжей (Candida bryophila; Dothiora sp., Sporobolomyces roseus). Ни один из 44 исследованных нами штаммов бактерий не проявлял фунгистатической активности в отношении аскомицетовых дрожжей. Проведено исследование таксономического состава фотобионтов, микобионтов лишайников рода Cladonia. Получены чистые культуры микобионтов этих лишайников, а также чистые культуры сопутствующих водорослей рода Pseudococcomyxa. Анализ тотальных гомогенатов лишайников показал наличие в них четырёх основных морфотипов клеток водорослей, три из которых были идентифицированы на основании морфологических и культуральных характеристик. Попытки изолировать эти водоросли в чистые культуры привели к выделению в аксенически чистую культуру только водорослей рода Pseudococcomyxa, тогда как Chlorella, Stichococcus и Asterochloris очистить от бактериальных спутников не удалось. Главная закономерность, которая прослеживалась во всех видах лишайников обеих географических зон – доминирование водорослей рода Asterochloris в верхушечной, активно растущей зоне подециев. Особенно хорошо это заметно в лишайниках из степной зоны, в частности C. arbuscula, в которых численность клеток водорослей этого рода достигала уровня 6•107 кл/г, в то время как в северотаёжных лишайниках численность была не выше 3•107 кл/г. Это можно объяснить более высокими потребностями микобионта в органических веществах на фоне значительно более высоких температур вегетационного периода, а также значительным уровнем инсоляции в степной зоне. При анализе количественных данных в лишайниках северотаёжной зоны выявлена закономерность: доминирование водорослей Asterochloris в верхушечной части лишайников С. arbuscula, C. rangiferina и C. stellaris сменяется равномерным распределением клеток двух видов фотобионтов, а в стареющих частях и на стадии разложения таллома начинают доминировать водоросли рода Pseudococcomyxa. Также нами была предпринята попытка совместить ранее полученные чистые культуры микобионта и фотобионта лишайников C. arbuscula и C. stellaris для ресинтеза талломов. В лабораторных условиях водоросли рода Asterochloris более активно развивались при температуре +15 °С, в то время как другие зелёные водоросли лучше росли при более высоких температурах. Попытки ресинтеза лишайников были проведены с использованием микобионта C. stellaris. Оказалось, что при выбранных условиях культивирования клетки водорослей росли намного лучше, чем мицелий микобионта, образуя пятна по размеру растекающейся капли при еженедельном увлажнении и толщиной до 1 мм. Микроскопия всех вариантов эксперимента с тремя видами водорослей через 6,5 месяцев показала доминирование Stichococcus sp., образующий цепочки из трёх клеток длиной до 12,5 мкм при толщине 2,5 мкм, но иногда встречались клетки Asterochloris sp. и Chorella sp. Следовательно, именно Stichococcus sp. является in vitro более конкурентоспособным среди остальных видов водорослей. Возможно, ему помогает занять лидирующее положение обильная слизистая оболочка, во много раз превышающая его размеры, что способствует вытеснению других видов. Получить свободные от бактериальной контаминации ресинтезы талломов лишайников рода Cladonia на данном этапе не удалось, однако такие попытки будут продолжены. Метагеномный анализ лишайников рода Cladonia. В ходе выполнения проекта были проанализированы 5 уникальных образцов лишайников: Cladonia stellaris, C. arbuscula, Кольский полуостров, городской округ Оленегорск (апикальная и базальная части таллома), C. arbuscula, Оренбургская область (апикальная часть). Целью этого исследования было сравнение эндобионтных бактерий двух видов лишайников, локализованных в одном месте сбора (Кольский полуостров) и одного вида лишайника, собранного в двух контрастных по климатическим условиям локусах: арктической тундры и степной зоны. При сравнении двух видов лишайников, C. stellaris и C. arbuscula, растущих в одном локусе (Кольский полуостров) оказалось, что доминирующей группой в апикальной зоне лишайников были представители семейства Acetobacteraceae (46 и 40% от общего числа OTU, доля которых была выше 0,5%). Эта находка интересна тем, что в подавляющем большинстве публикаций, в которых на молекулярном уровне исследуются другие роды и виды лишайников, доминирующей группой оказываются Rhizobiales. На втором по вкладу в общее бактериальное разнообразия эндофитов находятся представители семейства Beijerinkiaceae (16 и 24% соответственно). Распределение остальных групп бактерий видоспецифично. Так, в C. stellaris третьей по вкладу (10%) группой оказывается новая филогенетическая ветвь бактерий, которая ранее никогда (согласно известным литературным данным) не ассоциировалась с лишайниками, а неидентифицированные OTU порядка Rhizobiales – 2%, в то время как в C. arbuscula доля WPS-2 всего 0,5%, а неидентифицированные Rhizobiales – около 5%. В обоих видах довольно велика доля представителей рода Granulicella (3 и 2,4% соответственно). Эти бактерии выделены из лишайников в ходе выполнения проекта и являются представителями вида cand. ‘G. sibirica’ и ще не валидированных видов. Интересен и тот факт, что в эндофитном бактериальном сообществе апекса обоих видов присутствуют планктомицеты рода Singulisphera (4 и 7% соответственно). При сравнении апикальной и базальной частей C. stellaris были обнаружены существенные отличия: в разлагающейся части появляются специфические гидролитики – представители порядка Actinomycetales (8%), увеличивается доля бактерий родов Singulisphera и Granulicella (8 и 10%), доля Acetobacteracea снижается до 26%, а вклад минорных компонентов увеличивается до 21%, среди которых присутствуют представители других порядков Actinobacteria и бактерии группы Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroidetes. В базальной части С. arbuscula доля Acetobacteraceae сохраняется на уровне апекса, однако существенно возрастает участие ацидобактерий (24%) и, в частности, рода Granulicella – 9%. Появляются в значимом количестве представители 3 группы Acidobacteria (1%). Доля Beijerinkiaceae резко падает до 4%. Появляются Gammaproteobacteria и Betaproteobacteria (1 и 2% соответственно), а также невыявленные более ни в каких образцах в значимом количестве представители Armatimonadetes (ранее была описана как кандидат OP10) – 4%. При сравнении апикальных эндофитных бактериобионтов двух образцов C. arbuscula оказалось, что ядром сообщества остаются ацетобактерии, однако в степном образце появляются Gammaproteobacteria и Betaproteobacteria (7 и 2 % соответственно), а доля остальных альфапротеобактерий увеличивается до 20%, включая Caulobacteraceae (9%), не обнаруженные в северных образцах. Появляются Sphingobacteriaceae (около 1%). Таким образом, метагеномный анализ образцов лишайников видов C. stellaris и C. arbuscula позволил выделить специфические, облигатные паттерны (ацетобактерии, ацидобактерии, планктомицеты), динамика которых зависит от возраста таллома. Для апикальной, активно растущей зоны талломов лишайников рода Cladonia облигатными эндофитными бактериобионтами являются представители семейства Acetobacteraceae, сохраняющими свое положение и при деструкции таллома. Флуоресцентная in situ гибридизация. Анализ соотношения различных филогенетических групп бактерий проводили для трёх доминирующих видов лишайников рода Cladonia: C. stellaris, C. arbuscula и C. rangiferina. Проанализированы образцы, отобранные на территории полуострова Киндо (Мурманская область), городского округа Оленегорск (Кольский полуостров) и Оренбургской области. Отдельно анализировали смывы (эпифитная часть) и гомогенаты промытых талломов (эндофитная часть) апикальной, средней и базальной частей подециев. Основные закономерности, выявленные ранее, были подтверждены: доминирующей группой во всех лишайниках на разных стадиях развития были Alphaproteobacteria. В отличие от данных метагенома, при флуоресцентном анализе доля других протеобактерий была относительно высокой. Относительно постоянными компонентами, выявленными методом FISH, были представители Acidobacteria и Planctomycetes. Доля группы CFB и Actinobacteria была выше во всех смывах и базальных (разлагающихся) частях подециев. На данном этапе работа завершена на 90%. Публикация по объединённым данным метагеномного анализа, анализа методом FISH, данным посевов и разнообразию бактерий планируется в 2019 году.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".