ИСТИНА

Проект направлен на решение фундаментальной проблемы, выделения некультивируемых микроорганизмов из природных местообитаний. Почва является основным природным резервуаром микробного биоразнообразия и наиболее перспективна для поиска новых некультивируемых микроорганизмов. Предполагаемой причиной некультивируемости может являться эффект взаимного подавления у бактерий разных видов. Поэтому, при выделении некультивируемых форм важна разработка методов сепарации бактериальных клеток. Для этой цели в проекте предполагается разработать метод лазерного микросамплинга (ЛМС) микрозон почвы содержащих микроорганизмы, а также других натуральных и искусственных дисперсных объектов. Предполагается разработка и создание экспериментальной установки для реализации метода ЛМС и проверка ее возможностей в рамках выделения некультивируемых микроорганизмов и нанобактерий с целью получения биологически активных веществ и новых антибиотиков.

The project aims at the fundamental problem, associated with the development of technologies for non-cultivated micro-organisms from natural habitats. Soil is abundant reservoir microbial biodiversity and most subscribe to search for new for non-cultivated micro-organisms. For these purposes the draft is expected to develop a new method - laser microsampling (LMS). The program of project involves:. - Development of a laser microsampling method, and the establishment of a pilot installation for the realization of the method LMS. Selection modes coffee cake and drugs for soils and other objects with different spectres and the viscosity проботодготовки optimization modes and effects. - The development of technology cultivation microzones allocated using LMS on liquid and agarized environments. - Selection soil samples with various physical properties( granules with the viscosity), soil-physical description and classification. - Identify characteristics and transfer mechanisms, the modification and degradation of soil microaggregates in the LMS. Electron-microscopic and luminescent analysis of the structure of tiny airborne particles with imaging in them micro-organisms. - Study on the possibility of separation components microconsortia have sprouted up on solid environments and soil microzones by LMS technique/ - To identify optimal methods for assessing structural and functional soil biodiversity based on LMS. Taxonomy identifying unusual strains, allocated LMS method micro-organisms in order to search for new non-cultivated in normal conditions strains.

Разработка методики лазерного микросамплинга может кардинальным образом продвинуться к решению проблемы с некультивируемостью подавляющего большинства бактерий. Использование метода лазерного микросамплинга представляется так же перспективным при изучении фильтрующихся форм бактерий (наноформ бактерий), составляющих в почве значительную часть - до 10 % в почвах умеренной зоны и до 80% в почвах Антарктиды (ссылки). Наноформы бактерий в почве находятся в жизнеспособном состоянии (по данным прямого люминесцентного метода - ссылка), однако с трудом культивируются на лабораторных средах. Выделение и изучение наноформ бактерий, наряду с некультивируемыми, представляет значительный интерес как практическом отношении – в плане обнаружения новых продуцентов биологически активных веществ. так и в теоретическом отношении, с точки зрения открытия новых видов, структурного и функционального разнообразия, изучения сохранения жизни в экстремальных условиях. Изучение изменения функционального биоразнообразия в процессе лазерного переноса позволит решить задачу поиска минимальной функциональной единицы почвенного сообщества- "кванта"биоразнообразия.

У коллектива соисполнителей имеется достаточно большой научный задел по всем аспектам обозначенной в Проекте проблемы. Так в работах [1-10] изучены различные аспекты процессов культивации микроорганизмов из почв в 96 луночных планшетах на синтетические среды с целью создания автоматической системы выявления функционального биоразнообразия. Показано применение культивационного метода мультисубстратного тестирования для изучения микробных сообществ почв. В работах [11-29] с помощью лазерных методов получен целый ряд наночастиц и нано-микро-структур структур различного типа, разработаны методы диагностики формирования таких структур , исследовано их взаимодействие с живыми объектами . В работах [30-39] разработаны новые методы получения структурированных пленок различного типа. Отработаны методы обнаружения наноформ в почвах при помощи фильтрации почвенной суспензии через мембранные фильтры с размером пор 0.2 мкм, определения общей численности и жизнеспособности наноформ бактерий при помощи флуоресцентного метода (окраска акридином оранжевым и LD 7012), таксономической принадлежности на уровне крупных филумов с помощью молекулярно-биологического метода FISH.[40-46] Отработаны методы описания гранулометрических и реологических свойств почв.[46]

Стандартная технология выделения микроорганизмов из сложных многофазных природных сред, таких как почва или ил, требует предварительного извлечения живых клеток из их многофазного окружения, с помощью суспендирования. Этот процесс может разрушать клетки и нарушать синергетические связи в системе, помогающие поддерживать жизнеспособность некультивируемых бактерий, процент которых в почве достигает порой 97%. При этом такие организмы потенциально являются перспективными продуцентами новых антибиотиков и других биологически активных веществ. Целью наших исследований в рамках гранта является разработка высокопродуктивную технологию лазерного микросамплинга (ЛМС) для выделения отдельных микробных культур и микроконсорциумов из почвы. Эта технология основана на лазерной печати микрочастиц почвы со специально приготовленных образцов (почво-гелевая смесь нанесенная на покрытую золотом стеклянную пластину) с помощью сфокусированных ультрафиолетовых лазерных импульсов. За этот год нами была создана экспериментальная установка, воплощающая данную технологию, позволяющая переносить почвенные микроагрегаты на поверхность твердой агаризованной среды (глюкозо-пептонно-дрожжевой агар) в чашках Петри и на жидкие моносубстратные среды в планшеты системы мультисубстратного тестирования «Eco-log». Были опробованы различные механизмы переноса микрочастиц почвы, экспериментальный протокол переноса почво-гелевых микрокапель был оптимизирован. Мы изучили влияние процесса ЛМС на морфологическое и функциональное микробное биоразнообразие в сравнении с традиционной технологией приготовления почвенных образцов. На основании исследования чернозема, метод ЛМС показал пригодность для переноса почвенных частиц с обеспечением достаточной выживаемости микробных клеток. Для культивации на твердой среде наблюдалось существенное увеличение выделяемых после ЛМС родов бактерий по сравнению со стандартной культивацией, особенно для грамм-негативных бактерий. Наблюдалось изменение функционального биоразнообразия, проявляющееся в сужении спектра потребления субстратов, вызванное ЛМС. Снижение числа потребляемых субстратов при ЛМС свидетельствует о селективном потенциале метода. Обнаружено, применение комбинированной технологии культивации, включающей последовательную культивацию на твердой среде микробной биомассы, выросшей на различных питательных субстратах в ячейках планшета Eco -Log после ЛМС существенно увеличивает таксономическое разнообразие выделяемых микроорганизмов. Произведена генетическая идентификация некоторых выделенных штамов. Применение метода позволило обнаружить морфологически неопределяемые штаммы, которые могут оказаться новыми неописанными видами.