Континуальное моделирование механически активных клеточных системНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Континуальное моделирование механически активных клеточных систем
Результаты этапа: Разработана континуальная модель, позволяющая описать широкий круг эффектов, наблюдаемых в экспериментах с искусственным вытяжением эксплантатов ткани эмбрионального эпителия, описывающая активные реакции плоского слоя клеток эмбрионального эпителия, включая переориентацию направления «естественного» вытяжения эксплантата, характеризующего направление вытяжения эксплантата при отсутствии внешней нагрузки. Для описания изменения тензора активных напряжений, создаваемых клетками, предложено уравнение, учитывающее механизм изменения тензора, определяющего анизотропию естественного вытяжения, под воздействием развивающегося в ткани поля механических напряжений. Модель использована при решении задачи, описывающей эксперименты по изучению клеточных реакций в эксплантате эмбрионального эпителия при его растяжении перпендикулярно оси естественного вытяжения. На основе модели выполнены расчеты, позволяющие оценить влияние степени растяжения образца эпителиальной ткани и продолжительности пребывания его в растянутом состоянии на степень переориентации направления естественного вытяжения. Конкретная форма модели и порядок входящих в нее параметров определены в соответствии с данными экспериментов по растяжению эксплантатов эмбриональных эпителиев.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Континуальное моделирование механически активных клеточных систем
Результаты этапа: В рамках проекта продолжена работа по разработке, анализу и приложению развиваемых моделей, позволяющих в рамках единого подхода описать и анализировать наблюдаемые в экспериментах закономерности, связанные с механозависимостью процессов формообразования в клеточных системах. В связи с этим в 2017 году выполнено: 1. Разработана и исследована трехмерная континуальная модель перестройки биологических тканей с учетом активных напряжений, развиваемых при межклеточных взаимодействиях, и двух разных типов деформаций среды (за счет деформаций клеток и в результате их взаимного перемещения) с учетом присутствия внеклеточной жидкой фазы. Модель может быть использована при изучении различных способных к перестройке клеточных систем, включая эмбриональные мезенхимы, ткани опухолей мезенхимного типа и культуры клеток. Рассмотрена возможность использования модели при описании процессов формообразования, связанных с потерей устойчивости однородного состояния. Полученный критерий устойчивости позволяет выявить набор параметров, характеризующих механизм потери устойчивости, связанный с процессом активного взаимодействия клеток за счет создаваемых ими активных напряжений и противодействующим процессом отталкивания клеток из-за сил, обусловленных пассивными и активными реакциями клеток в ответ на избыточное сжатие. – С.А. Логвенков, А.А. Штейн, Е.Н. Юдина 2. Решена задача об образовании замкнутой полости (бластоцеля) в первоначально однородном клеточном сфероиде, состоящем из клеток и внеклеточной жидкости. В результате решения задачи показано, что одним из необходимых условий образования полости является достижение определенного уровня давления во внеклеточной жидкости. Другим необходимым условием является градиент коэффициента клеточной подвижности в направлении поверхности сфероида, являющийся следствием различия свойств клеток, расположенных в разных областях зародыша. Результаты решения задачи качественно согласуются с данными наблюдений, относящимися к бластуляции, и позволяют анализировать участие различных возможных механизмов активных межклеточных взаимодействий, характерных для различных стадий процесса, в организации движения клеток, приводящих к появлению бластоцеля на стадии раннего развития эмбрионов.– С.А. Логвенков, И.Н. Моисеева, А.А. Штейн 3. Выполнены эксперименты по исследованию влияния механических факторов на активные клеточные реакции при растяжении целых зародышей шпорцевой лягушки. Продолжено выполнение серии экспериментов, в которых растяжение проводили в направлении, поперечном передне-задней оси зародыша (то есть перпендикулярно направлению естественного вытяжения зародыша). Исследованы траектории движения индивидуальных клеток как растянутых зародышей, так и зародышей, не подвергнутых растяжению. В результате проведенного исследования показано: возможность переориентации осевого комплекса ранних гаструл X. laevis вдоль направления искусственно приложенного поперечного растяжения; искусственно приложенное поперечное растяжение порождает широкий спектр структурных аномалий, выраженных с разной степенью хаотизации внешней морфологии и расположения основных зачатков; для морфогенетических движений в экспериментальных образцах характерна устойчивость нормальных гаструляционных паттернов, при, однако, наличии образцов с хаотичными паттернами движения клеток; наблюдается различие в значениях локальных деформаций между опытными образцами и нормально развивающимися зародышами. Полученные результаты не были сопоставлены с математической моделью в связи со смертью руководителя эксперимента профессора Л.В.Белоусова. – Л.В. Белоусов, Д.В. Бредов.
3 4 марта 2018 г.-31 декабря 2018 г. Континуальное моделирование механически активных клеточных систем
Результаты этапа: 1. В рамках проекта была продолжена работа по разработке, анализу и приложению развиваемых моделей, позволяющих в рамках единого подхода описывать и анализировать наблюдаемые в экспериментах закономерности, связанные с механозависимостью процессов формообразования в клеточных системах. В связи с этим выполнено исследование и модификация модели сплошной среды, образованной клетками и внеклеточной жидкостью, с учетом анизотропии развития активных напряжений, определяемой локальной неоднородностью распределения плотности клеток в различных направлениях. Постулирование определяющего соотношения для активных напряжений основывается на следующих биологических представлениях. Во-первых, клетки мезенхимального типа характеризуются способность к одиночным движениям. При отсутствии внешних воздействий только некоторые остаются неподвижны, тогда как большинство беспорядочно перемещается в свободном пространстве, выдвигая случайным образом мембранные выросты или протрузии в разные стороны. При этом покрываемые клетками расстояния достаточно малы, и их движение носит беспорядочный характер. На макроскопическом уровне среднее значение потока импульса хаотического движения частиц через единицу поверхности среды характеризуется соответствующим давлением, проявляющимся в отталкивании частиц. Во-вторых, поведение клеток может кардинально меняться под воздействием внешних факторов, таких как градиент концентрации субстрат-связывающих адгезионных молекул. Клетки мигрируют, используя протрузии, которые представляют собой выросты переднего края плазматической мембраны, обращенного в сторону движения. Во взрослых организмах протрузии различной формы и размеров скрепляют клетку с окружающим матриксом за счет адгезивных контактов, однако на ранних стадиях эмбрионального развития ткани содержат лишь незначительное количество внеклеточного матрикса, и клетки рассматривают соседние клетки как субстрат для прикрепления протрузий и последующей миграции. При математическом описании этого механизма развития активных напряжений между клетками предполагается, что постоянно возникающие на поверхности клетки протрузии могут прикрепляться к участкам адгезионных контактов, расположенным на поверхности соседних клеток, а участки адгезионных контактов распределены равномерно по поверхности клеток. Тем самым, анизотропия тензора активных напряжений определяется неоднородностью распределения плотности клеток по некоторой сферической поверхности с радиусом, соответствующим характерному размеру протрузий (порядка или равным радиусу клетки) и центром в рассматриваемой точке. В результате, определяющее соотношение для активных напряжений состоит из двух слагаемых. Первое из них, ответственное за нелинейное активное сопротивление клеточной среды, обусловленное хаотическим поведением клеток, которое обеспечивает невозможность ее слишком большого сжатия, описывается шаровым тензором, определяющим давление. Считается, что оно является функцией объемной плотности клеток, характеризующей степень их сближения, причем эта функция должна неограниченно и нелинейно возрастать с увеличением объемной плотности клеток. Второе слагаемое имеет смысл напряжений, создаваемых направленными активными сокращениями в протрузиях, имеющих прочное прикрепление к поверхности соседних клеток. При определенных предположениях последнее слагаемое может быть сведено к функции объемной плотности клеток (локальное взаимодействие) или функционалу их пространственного распределения объемной плотности (нелокальное взаимодействие). Формулировка закона, определяющего скорость деформации среды за счет клеточных переупаковок предполагает, что процесс взаимного перемещения клеток друг относительно друга может управляться двумя физически различными механизмами. Во-первых, под воздействием внешних по отношению к клеткам механических сил, приложенных в местах контакта между ними, может происходить разрыв одних и образование других клеточных контактов с перемещением клеток одна относительно другой (первое слагаемое). Этот процесс контролируется прочностью межклеточных контактов, то есть межклеточной адгезией. В некоторой смысле он аналогичен вязкому течению материала: возникает растяжение ткани в результате смещения одних клеток относительно других, вызванное внешней силой. Однако, этот механизм нельзя считать пассивным, поскольку он сопровождается разрушением одних и образованием других межклеточных контактов. Во-вторых, клетки могут менять соседей в результате развития активных напряжений. Этот процесс можно рассматривать как проявление клеточной подвижности, связанной со способностью клеток распластываться и осуществлять перемещения на субстрате, в данном случае по поверхности соседних клеток (второе слагаемое). Определены параметры, отвечающие за два биологически различных механизма, которые могут независимо управлять клеточными движениями. Проведено исследование влияния различных пространственных распределений параметров, характеризующих клеточную адгезию, клеточную подвижность и интенсивности развития активных напряжений на перераспределение объемной плотности клеток в сферически симметричном, первоначально однородном клеточном сфероиде. Исследовано развитие системы после потери устойчивости. Выявлены закономерности распределения клеток и параметров межклеточного взаимодействия, приводящие к формированию как центральной заполненной жидкостью полости, так и более сложных клеточных структур, наблюдаемых в процессе эмбрионального развития. 2. В основе согласованного движение больших групп клеток различных типов, дающего начало биологическому формообразованию, лежит понятие клеточной адгезии. Клеточная адгезия является фундаментальным биологическим явлением, проявляющемся в связывание одной клетки с другой посредством поверхностных белков, обеспечивающих прочность скрепления мембран двух соседних клеток. Это понятие клеточной адгезии можно рассматривать как клеточную адгезию в узком смысле. В более широком смысле процесс клеточной адгезии включает в себя и активные межклеточные взаимодействия с участием сократительной активности различных элементов клеточного скелета. Такие взаимодействия могут быть реализованы посредством образования на поверхности клеток выростов различных размеров и формы (псевдоподий), закрепляющихся на поверхности соседних клеток. Сформулирована базовая система уравнений для сплошной среды, образованной внеклеточной жидкостью и двумя типами клеток, различающихся своими адгезионными свойствами и характером развития активных напряжений. В рамках развиваемого нами подходя, для описания активных межклеточных взаимодействий вводятся дополнительные фазы, в которых и развиваются активные напряжения. Объемами дополнительных фаз пренебрегаем. Дополнительные фазы привязаны к активным выростам клеток, содержащим сократительные элементы клеточного скелета. Тензоры напряжения в дополнительных фазах характеризуют активные взаимодействия, развивающиеся между клетками только первой, только второй клеточными фазами соответственно и активные взаимодействия, развивающихся между клетками разных клеточных фаз. Сформулированная модель учитывает различие закономерностей, которыми управляются развитие активных взаимодействий в разных дополнительных фазах. Деформирование среды, связанное с переупаковкой клеток, рассматривается как течение, управляемое динамическими параметрами среды. Определяющее соотношение для скорости деформации клеточных фаз за счет переупаковки клеток учитывает различие адгезионных свойств клеток как внутри самой фазы, так и с клетками соседней клеточной фазы. Полученная модель может быть использована при описании закономерностей взаимодействия клеток между собой и с окружающими их внеклеточными компонентами биологической среды, наблюдаемыми в самых различных биологических процессах, таких как формообразование в эмбриональных тканях, заживление повреждений мягких тканей, развитие опухолей, сегрегация клеток различных типов в культуре и многое другое. 3. Важным этапом разработки математической модели является сопоставление предсказываемых ей режимов с поведением реальных систем. Чтобы обеспечить достоверность такого сопоставления, требуется обеспечить как можно более высокое разрешение методики регистрации клеточных движений, а для изучения роли механического статуса ткани - инструментарий для стандартизации экспериментального воздействия, который позволял бы оказывать на эксплантаты ткани контролируемое и воспроизводимое механическое воздействие. Ранее, основным методом регистрации микродеформаций и клеточных движений в ранее проведённых экспериментах служила цейтраферная съёмка на стереомикроскопе Olympus SZX9. Данный метод обладал двумя существенными недостатками: недостаточной детализацией и, как следствие, невозможностью автоматизированного распознавания клеточных границ на изображении. Для контрастной визуализации клеточных границ было применено окрашивание клеточной мембраны красителем GAP43-GFP и ядер красителем H2B-mCherry. Однако интенсивность флуоресценции оказалось недостаточной для регистрации изображений на стереомикроскопе Olympus SZX9. В связи с этим, а также для повышения качества получаемых изображений была проведена time-lapse съёмка на конфокальном микроскопе Olympus FV-10i. Использование конфокального микроскопа повысило разрешение метода и позволило анализировать клеточные движения не вручную, а с использованием алгоритмов автоматического распознавания (EpiTools 2.1.6.). Окрашенные ядра выступают опорными точками в алгоритме ручной коррекции артефактов распознания, вызванных неравномерностью сигнала. Указанная методика позволила получить прижизненные регионспецифичные цейтраферные съёмки клеточных движений в эпителии зародышей X.laevis на стадии поздней гаструлы (стадия 11 по Nieuwkoop and Faber). Данная стадия была выбрана в связи с тем, что именно в период гаструляции происходят наиболее активные клеточные движения, достоверно показанные механозависимыми. Для регистрации in vivo клеточных движений с помощью конфокального микроскопа разработан проект автоматизированной установки, позволяющей осуществлять контролируемое двухосевое растяжение подложки с прикреплёнными к ней эксплантатами эмбрионального эпителия. В частности, приобретены и настроены моторизованные компоненты установки - шаговые актуаторы, блоки управления, схемы питания, подобран материал подложки, отлажен протокол его полимеризации, нанесения на подложку адгезивного покрытия и методика стимуляции адгезии эксплантатов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".