ИСТИНА

Экспрессия генов у эукариот контролируется сложной, многокомпонентной системой регуляции транскрипции РНК-полимеразой II (РНКП II). Гены, транскрибируемые РНКП II, имеют нуклеосомную организацию. Нуклеосомы состоят из белкового ядра, образованного молекулами основных белков-гистонов, вокруг которого накручена ДНК в 1,65 витка. Белковое ядро представлено октамером гистонов и содержит по две копии каждого из канонических гистонов: H3, H4, H2A и H2B. При сборке нуклеосомы гистоны взаимодействуют в определенном порядке, поэтому строение нуклеосомы имеет модульный характер. Упорядоченная разборка нуклеосом при транскрипции облегчает доступ РНКП II к ДНК, в то время как нуклеосомная сборка затрудняет доступ фермента к матрице, тем самым затрудняя транскрипцию. Модификации хроматина, хроматин-ремоделирующие комплексы, шапероны гистонов и вариантные формы гистонов регулируют динамику нуклеосом во время транскрипции. Скорость транскрипции генов, содержащих нуклеосомы in vivo близка к скорости процесса, наблюдаемого in vitro на свободной от гистонов ДНК, однако даже одна нуклеосома in vitro может представлять высокий барьер для РНКП II. Эти наблюдения поднимают вопросы о природе нуклеосомного барьера при транскрипции и о механизмах его преодоления in vivo. Сравнение транскрипции через одиночные позиционированные мононуклеосомы при инициации с одноцепочечного участка ДНК, инициации на промоторе и прямой сборке элонгационного комплекса (ЭК) РНКП II показывает, что распределения пауз фермента при прохождении нуклеосомы различаются во всех этих случаях. Только инициация на промоторе и после сборки элонгационного комплекса РНКП II позволяют сформировать правильный транскрипционный комплекс, тогда как с одноцепочечного участка ДНК приводит к появлению характерной 10 п.н. периодичности паузирования фермента. Дальнейший анализ транскрипции с использованием ЭК, содержащих различные формы РНКП II существенно улучшит понимание механизма транскрипции через нуклеосомы. При синтезе мРНК осуществляется регулируемое взаимодействие РНКП II, комплексов ремоделирования хроматина и факторов транскрипции и процессинга РНК. РНКП II имеет уникальный дополнительный С-концевой домен (CTD) на самой крупной субъединице, Rpb1, содержащий повторяющиеся аминокислотные последовательности Tyr1Ser2Pro3Thr4Ser5Pro6Ser7, обогащенные сайтами для ковалентных посттрансляционных модификаций (особенно фосфорилирования). Для этого домена были предложены различные роли, включая функционирование в качестве платформы для связывания других белков, участвующих в транскрипции мРНК, модификации гистонов, взаимодействии с нуклеиновыми кислотами и перемещении нуклеосом. На каждом этапе транскрипции преобладают различные сочетания фосфорилирования, и с каждым преимущественно связывается определенный набор факторов. Различные комбинации фосфорилированных остатков либо индуцируют, либо предотвращают связывание факторов, которые необходимы для работы РНКП II в биогенезе мРНК. Таким образом, CTD и связанные с ним изменения имеют решающее значение для обеспечения эффективной инициации и элонгации транскрипции в хроматине. Полученные данные свидетельствуют о взаимодействия CTD и хроматина при транскрипции. По аналогии с гистоновым кодом было предположено существование кода CTD, представляющего собой стабильные или временные посттрансляционные модификации в повторяющихся аминокислотных последовательностях, регулирующие действие различных эффекторов. Наблюдается взаимная корреляция между паттернами фосфорилирования CTD РНКП II и модификациями гистонов. Кроме того, CTD и хроматин тесно взаимодействуют в пространстве на всех этапах транскрипции. Поэтому изучение взаимодействия этих структур и того, является ли модификация хроматина первичной или, наоборот, запускается модификацией CTD, является важной задачей. Белок BRD4 с двумя бромодоменами связывается с ацетилированными «хвостами» гистонов H3 и H4. BRD4 привлекает CDK9-содержащий фактор PTEFb и тем самым вызывает фосфорилирование Ser2 в CTD. Нарушение взаимодействия между бромодоменами и ацетилированными гистонами низкомолекулярным ингибитором JQ1 приводит к снижению связывания BRD4, снижению фосфорилирования Ser2, а также снижению экспрессии генов. С другой стороны, гистон-модифицирующие ферменты (Set1 и Set2) привлекаются с помощью ковалентных модификаций, присутствующих в CTD, к транскрипционному комплексу. Ser5-Р связывает и привлекает к CTD H3K4-метилтрансферазу Set1 вместе с комплексом PAF. Set1 триметилирует H3K4 в близлежащих к промотору гистонах, что является отличительной чертой активных генов. Set1 диметилирует H3K4, а модификация H3K4me2 участвует в привлечении деацетилаз гистонов (HDACs) к хроматину. Малая форма гистондеацетилазы Rpd3, Rpd3S, привлекается с помощью Ser5-Р к активно транскрибируемым генам. Во время активной элонгации дважды фосфорилированный CTD (Ser2-P/Ser5-P) привлекает комплекс Set2 для ко-транскрипционного метилирования хроматина по положению H3K36. Он также привлекает различные шапероны гистонов (например, Spt6 и комплекс FACT) для облегчения восстановления нуклеосом после транскрипции. Эти факторы имеют решающее значение для транскрипции хроматина. Модификации Ser2-Р и Ser5-P участвуют в привлечении комплекса PAF-Bre1-RAD1 для убиквитинирования гистонов H2B. FACT также облегчает диссоциацию H2A/H2B димера из нуклеосом при транскрипции хроматина. Поскольку нуклеосомная структура хроматина является барьером для транскрибирующей РНКП II, ремоделирование хроматина и модификации гистонов и CTD, по-видимому, облегчают транскрипцию РНКП II через хроматин. Кроме того, CTD играет важную роль в интеграции нескольких сигнальных путей, глобально влияющих на регуляцию генов. Определение возможного совместного действия CTD и хроматина в ходе транскрипции, такого как взаимодействие метил-трансфераз гистонов с CTD и взаимодействие CTD-специфических киназ с гистонами, влияющее на процессы ремоделирования хроматина и позиционирования нуклеосом, требует понимания роли CTD в транскрипции хроматина. Эти исследования предоставят ценную информацию о механизмах транскрипции хроматина и биогенезе мРНК.

Control of gene expression in eukaryotes relies on complex regulatory machinery dedicated to proper transcription by RNA Polymerase II (RNAPII). RNAPII-transcribed genes are covered by nucleosomes. A nucleosome consists of a protein core of basic histone proteins, around which the DNA is wound 1.65 times. The core is an octamer that comprises two copies of each of the core histones: H3, H4, H2A and H2B. The four proteins interact in an ordered manner during nucleosome assembly, giving rise to the modular nature of the nucleosome. The ordered disassembly of nucleosomes permits RNAPII to access the DNA, whereas nucleosomal reassembly impedes access, thus preventing transcription and mRNA synthesis. Chromatin modifications, chromatin remodellers, histone chaperones and histone variants regulate nucleosomal dynamics during transcription. The rate of transcription of nucleosome-covered genes in vivo is close to the rate observed on histone free DNA in vitro, however, even a single nucleosome can present a strong barrier for RNAPII in vitro. These observations raise questions about the nature of a nucleosomal barrier to transcription and about the mechanism by which it is overcome in vivo. Comparison of the transcription through a uniquely positioned mononucleosome by end-initiation, promoter initiation and assembled authentic RNAPII elongation complex suggests that the nucleosome-specific pausing is not similar in all these cases. Only promoter-initiated and assembled RNAPII ECs form the proper transcription “bubble” whereas the end-initiated RNAPII showed a characteristic 10 bp periodicity of pausing. A further analysis of transcription using authentic ECs comprising various forms of RNAPII would put insight into the mechanism of transcription through nucleosome. The mRNA transcription is accomplished by a fine-tuned interplay of RNAPII, chromatin remodeling complexes, RNA transcription factors and RNA processing factors. RNAPII uniquely possesses an extra C-terminal domain (CTD) on its largest subunit, Rpb1 comprising a repetitive Tyr1Ser2Pro3Thr4Ser5Pro6Ser7 with potential epigenetic (especially phosphorylations) modifications sites. Various roles have been proposed for this domain including functioning as a binding platform for other proteins involved in mRNA transcription, histone modifications, interactions with nucleic acids and displacement of nucleosomes. Different phosphorylation states predominate at each stage of transcription, and each preferentially binds a distinct set of factors. Different combinations of phosphorylated residues either recruit or repel factors that are essential for the activity of RNAPII in mRNA biogenesis. Thus, the CTD tail and its associated modifications are crucial to ensure effective initiation and elongation of RNAPII over a chromatin template. Various observations suggest the existence of a CTD-chromatin crosstalk during the transcription. Similar to the histone code, the existence of a CTD code has also been postulated, which describes mainly the formation of (either stable or transient) structures in histone tails or heptads of the CTD by posttranslational modifications to regulate the action of downstream effectors. In fact, specific examples show evidence for a linkage of the phosphorylation state of the RNAPII CTD (CTD-P) with the modification state of histone tails. The CTD and chromatin have an intimate spatial relationship during all stages of transcription. It will be, therefore, a challenging task to get a deeper insight into the relationship of these two structures and to uncover if chromatin-modifying processes can be instructed by the CTD and vice versa. The dual bromodomain-containing protein, BRD4, binds to acetylated tails of histones H3 and H4. BRD4 recruits P-TEFb (containing CDK9) and, thereby, induces CTD Ser2 phosphorylation. Disruption of the bromodomain-histone acetylation interaction by JQ1, a small-molecule bromodomain inhibitor, results in decreased BRD4 binding, reduced Ser2-P, and reduced gene expression. Inversely, histone-modifying enzymes (Set1 and Set2), are recruited by CTD-P marks to the transcription machinery. Ser5-P binds and recruits the H3K4 methyltransferase, Set1, to the CTD together with the PAF complex. Set1 trimethylates H3K4 of promoter-proximal histones and is a hallmark of activated genes. Downstream of promoters, Set1 dimethylates H3K4, and the H3K4me2 mark is involved in the recruitment of HDACs to chromatin. The small form of the histone deacetylase Rpd3, Rpd3S, is specifically recruited by the Ser5-P to actively transcribed genes. During active elongation, the doubly modified Ser2-P/ Ser5-P of CTD recruits Set2 complex to co-transcriptionally methylate chromatin at H3K36. It also recruits various histone chaperones (for example, Spt6 and the FACT complex) to facilitate the reassembly of nucleosomes. These factors are critical to the role that chromatin plays in transcription. Ser2-P and Ser5-P residues allow the recruitment of the PAF-Bre1-Rad1 complex to facilitate histone H2B ubiquitination. FACT facilitates the dissociation of a H2A/H2B dimer from the nucleosome. The nucleosomal structure of chromatin provides a natural barrier for RNAPII activity. Chromatin remodeling machines and modification of histone tails as well as CTD appears to fulfill critical tasks to allow RNAPII transcription through chromatin. The CTD serves to integrate multiple signaling pathways that globally affect gene regulation. The possible CTD-chromatin crosstalk during the transcription such as the interaction of histone methyl transferases with CTD and the interaction of CTD specific kinases to histone in affecting the chromatin remodeling and nucleosomal positioning demands an extensive characterization of the CTD role in the transcription and chromatin remodeling. These studies would provide valuable insight regarding the transcription through nucleosome and mRNA biogenesis.

Результатом проекта будет определение ролей различных участников реализации кода С-концевого домена РНКП II (CTD) в транскрипции хроматина. Взаимодействие гистонов и CTD, модифицированного в различной степени, будет описано в терминах скорости элонгации, структур ключевых интермедиатов и судьбы нуклеосом. В ходе проекта мы планируем исследовать состав транскрипционных комплексов, связанных с CTD, и выявить белки и белковые комплексы, функции которых в транскрипции в настоящий момент неизвестны или не связаны с взаимодействием CTD и гистонов. В результате успешной реализации проекта будут получены ответы на многие фундаментальные вопросы, а именно: 1) Как CTD РНКП II влияет на ремоделирование хроматина в ходе транскрипции и участвует в объединении нескольких сигнальных путей? 2) Какие изменения происходят в нуклеосомной структуре при транскрипции через хроматин РНКП II при том или ином уровне фосфорилирования CTD? 3) Каково время жизни ключевых структурных интермедиатов, образующихся во время транскрипции РНКП II при том или ином уровне фосфорилирования CTD? 4) Как модификации гистонов и присутствие гистоновых шаперонов и других идентифицированных белковых факторов влияют на транскрипцию через хроматин РНКП II при том или ином уровне фосфорилирования CTD? Основной целью проекта является более глубокое понимание механизмов ремоделирования хроматина при транскрипции. Точная регуляция транскрипции имеет решающее значение для клеточного развития, в то время как ошибочная регуляция часто связана с развитием рака и других заболеваний. Таким образом, дальнейший анализ способов регуляции и механизма транскрипции хроматина важен для лучшего понимания как фундаментальных, так и прикладных аспектов процесса. Понимание такой регуляции генов поможет определить и контролировать аномальное клеточное поведение при раке и других заболеваниях, и в конечном итоге способствовать разработке более целенаправленных стратегий их лечения.

Ранее сотрудниками российской лаборатории была разработана высокоочищенная система транскрипции in vitro с использованием позиционированных мононуклеосомных матриц и предложен ряд молекулярно-биологических методов для изучения механизмов транскрипции хроматина. С использованием предложенных подходов были получены уникальные данные, позволившие сформулировать концепцию «нуклеосомного цикла», и его роли в сохранении и изменении эпигенетического статуса клетки. Каким образом непосредственно РНКП II воздействует на нуклеосомы, чтобы осуществлялась эффективная транскрипция, в настоящий момент всё ещё остается не до конца изученным. Известно, что CTD принимает различные конформации в зависимости от состояния фосфорилирования, приводящего к связыванию и диссоциации факторов, необходимых для биогенеза мРНК. Хотя транскрипция in vitro возможна без CTD, однако биохимические исследования показали, что фосфорилированный CTD усиливает сплайсинг экзогенного субстрата, воздействуя на раннюю стадию сборки сплайсомы. Эти данные указывают на значимую роль фосфорилированного CTD даже в транскрипции in vitro, и вместе со структурным анализом CTD и его динамической подвижности, позволяют предположить, что CTD в его удлиненной конформации (из-за фосфорилирования) будет более стабильным и благоприятным для активной транскрипции. Мы проверили роль фосфорилированного (РНКП II O) и нефосфорилированного (РНКП II A) CTD в транскрипции in vitro. Была собрана мононуклеосома, и транскрипция была инициирована обеими формами РНКП II. Мы обнаружили значительное различие в транскрипции и эффективности удаления нуклеосом в случае РНКП II O по сравнению с РНКП II A. Кроме того, были проанализированы несколько белков, имеющих CTD-взаимодействующие домены, для определения специфичности их взаимодействия с CTD и функции в транскрипции.