| 1 |
17 февраля 2016 г.-31 декабря 2016 г. |
Изучение структурных аспектов взаимодействия основных белков вируса гриппа в процессе ядерного экспорта |
| Результаты этапа: Были проведены эксперименты по исследованию взаимодействия белка М1 и его амфипатических спиралей с модельными мембранами, содержащими липидные домены – рафты, методом атомной силовой микроскопии (АСМ). Для создания рафтовых мембран использовалась липидная смесь, содержащая основные компоненты рафтов, а именно – сфингомиелин и холестерин, в различном мольном соотношении, что позволяет получить липидные домены разных характерных размеров. Смесь липидов в хлороформе высушивалась в роторном испарителе, ресуспензировалась в рабочем буферном растворе (в нашем случае – 100 мМ NaCl, 50 мМ MES, pH.) до концентрации 1 г/л, после чего подвергалась интенсивному встряхиванию и нескольким циклам заморозки-разморозки. Из полученной суспензии с помощью экструдера с поликарбонатной мембраной формировались однослойные липосомы диаметром около 100 нм. Для формирования липидного бислоя на подложке атомного силового микроскопа капля полученной суспензии липосом помещалась на свежесколотую слюду, где происходило осаждение липосом, их раскрытие и слияние в целостный липидный бислой. После этого образец помещался в ячейку атомного силового микроскопа, которая заполнялась рабочим буферным раствором. Так как возникновение доменов (рафтов) в липидной мембране является следствием локального фазового перехода, после формирования липидного бислоя на подложке система нагревалась выше температуры фазового перехода гель-жидкий кристалл для всех компонентов липидной смеси, а затем охлаждалась до комнатной температуры. В результате мы получили липидные бислои, в которых формировались липидные рафты различного размера. Было определено, что рафты толще основной мембраны примерно на 1 нм, и достаточно стабильны во времени. Эксперименты по адсорбции матриксного белка М1 на рафтовых мембранах показали, что он предпочитает адсорбироваться на жидко-неупорядоченную (нерафтовую) часть липидного бислоя. На самих рафтах молекул белка практически не обнаруживалось. При этом, в ходе своей адсорбции в таких системах, белок М1 проявлял свойства, типичные для альфа-спиральных амфипатических пептидов: при высокой концентрации (большом соотношении белок/липид) он действовал как детергент, частично разрушая нерафтовую часть липидного бислоя. Такое свойство белка может говорить о высоком сродстве отдельных его участков к определенным липидным компонентам мембраны. |
| 2 |
13 марта 2017 г.-31 декабря 2017 г. |
Изучение структурных аспектов взаимодействия основных белков вируса гриппа в процессе ядерного экспорта |
| Результаты этапа: В отчетном году продолжен комплексный структурный анализ белка ядерного экспорта (NEP, 14,4 кДа). Была получена серия плазмидных конструкций с геном NEP под контролем конститутивного промотора trp, позволяющих с высокой эффективностью экспрессировать белок NEP в клетках Escherichia coli. Осуществлена экспрессия ряда делеционных вариантов белка NEP. Получены АFМ-изображения делеционных вариантов белка и распределение размеров агрегатов в растворе методом DLS. Проведен компьютерный анализ с целью выяснения амилоидогенных участков в вариантах белка NEP, NEP-C, NEP-N. Исследовалось поведение молекул NEP в растворе: их агрегация, олигомеризация и диссоциация в зависимости от состава буфера. Выявлена высокая склонность белка к агрегации в широком диапазоне условий. Структура полноразмерного NEP-С была анализирована совокупностью методов малоуглового рантгеновского рассеяния (SAXS) и on line гель-эксклюзионной хроматографией. Обнаружено присутствие двух фракций белка, определены их характеристики. Предложена пространственная модель N-концевого домена белка, для которого отсутствуют данные РСА.
В отчетном году был проведен биоинформатический анализ в комплексе с пространственным компьютерным моделированием матриксных белков вирусов гриппа, болезни Ньюкасла и иммунодефицита на наличие амфипатических спиралей, включающих CRAC мотивы, а также вируса везикулярного стоматита, не имеющего мембраны рафтового типа. Результаты исследования подтверждают гипотезу рафтовой организации липидной мембраны ряда оболочечных вирусов, а также и концепцию вовлеченности СRAC мотивов в поддержание стабильных рафтов в биологических мембранах и формирование кривизны мембран. Были проведены пилотные эксперименты по изучению действия синтетических пептидов, структурно соответствующих первичным последовательностям амфипатических альфа-спиралей белка М1 вируса гриппа, на фагоцитозную активность культивируемых макрофагов мыши линии IC-21. Показано, что содержащие CRAC-последовательности пептиды из вирусного белка М1 активны в отношении рафто-зависимых процессов у макрофагоподобных клеток.
Методы малоуглового рентгеновского рассеяния, атомно-силовой микроскопии и измерения зета-потенциала были использованы для исследования физико-химического механизма формирования и дезинтеграции слоя матриксного М1 белка. Показано, что белок содержит глобулярный N-концевой домен и гибкий вытянутый С-концевой домен. Глобулярный N-концевой домен мономеров М1 белка сохраняется на стадиях рН от 4.0 до 6.8, в то время как С-концевой домен остается гибким, а его тенденция формировать мультимеры изменяется драматически. Показано, что процесс мультимеризации белка обратим, при этом связь между молекулами М1 белка начинает разрушаться около рН6. Предложена электростатическая модель самосборки М1 белка при различных рН, которая показала хорошее соответствие с измерениями зета-потенциала, позволяя тем самым оценить роль доменов М1 белка в М1-М1 и М1-липидных взаимодействиях. Полученные результаты дают более углубленный взгляд на механизм образования scaffold М1 белка и главную роль гибкого и разупорядоченного С-концевого домена в этом процессе. |
| 3 |
29 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. |
Изучение структурных аспектов взаимодействия основных белков вируса гриппа в процессе ядерного экспорта |
| Результаты этапа: |
