ИСТИНА

Проект направлен на решение проблемы устойчивого функционирования высокогорных экосистем на основе использования природных резервов и механизмов азотного питания растений

Nitrogen is the main element limiting the productivity of terrestrial ecosystems – first of all, plant productivity. However, plants have a number of adaptation mechanisms to exist in the conditions of limited nitrogen availability. These mechanisms are allowing them to function successfully and support necessary nitrogen balance. First of all, it is the symbiosis with microorganisms which provide access of plants to nitrogen sources inaccessible directly. The most important is the symbiosis with nitrogen-fixing bacteria, providing plant access to atmospheric nitrogen, and mycorrhizal symbiosis which in the conditions of low inorganic nitrogen availability provides access of plants to organic N. Besides, it is interesting to study the distribution in alpine ecosystems of the new special strategy of nitrogen nutrition which is recently found for one alpine species (Corydalis conorhiza) - formation of snow roots (Onipchenko et al ., 2009, 2014). Studying of efficiency of plant-microbial interactions and natural occurrence of other strategies of plant adaptation to low nitrogen availability in alpine ecosystems will allow finding rational approaches to ensuring their stable functioning and sufficient nitrogen nutrition. The project is focused on studying the role of biological nitrogen fixation, mycorrhizal symbiosis of arbuscular type and in nitrogen plant nutrition in mountain meadow ecosystems. The study will be carried out on the basis of the Teberda national reserve in which long-time study of structure and functioning of mountain meadow phytocenoses and interactions in the soil-microorganisms-plant system are already conducted by the scientific team. Additional study on the search of new plant species using a strategy of snow roots for nitrogen nutrition will be carried out also in other areas of Caucasus. The study will include as natural observation (the analysis of soil and plant samples of natural ecosystems), as carrying out of field experiments (additional input of nutrients and input of fungicide). Observations and experiments will cover the typical for the Caucasus alpine ecosystems (2400-2800 m a.s.l.). Non-symbiotic nitrogen fixation will be studied by an acetylene method, and symbiotic nitrogen fixation – by methods of natural N-15 abundance, N-15 isotope dilution, and determination of root nitrogenase activity. The role of nitrogen fixation in the nitrogen nutrition of legumes will be estimated not only on the basis of the isotope analysis of aboveground part of plants but also the assessment of a contribution of symbiotic nitrogen fixation to the enrichment of mountain meadow soils with nitrogen will be carried out. Such assessment demands the determination of legumes biomass in different mountain meadow ecosystems (the method of hay crops will be used) and, the main thing, determination of underground biomass. The last represents considerable methodical complexity as legumes in mountain meadows develop a deep root system. Therefore the method of careful excavation of roots of individual plants with the subsequent extrapolation of results on the ecosystem will be used. A standard method of washing of the 10-20 cm soil monoliths in which the major part of root systems of other plants is concentrated (Onipchenko, 1985; 1990) doesn't provide satisfactory results for legumes. Besides, the assessment of activity of symbiotic nitrogen fixation and a role of aboveground and underground biomass of legumes in nitrogen accumulation will be done on the basis of carrying out a laboratory experiment on growth of main types of legume species and completion of a field experiment in which plants are already grown up within five years. For studying of arbuscular mycorrhiza (as dominating in mountain meadow ecosystems) in thin roots two methods will be used: a microscopy method according to I.A. Selivanov (1981) with the calculation of degree (D), intensity (C) and frequency (F) of mycorrhizal infection, and biochemical method of ergosterol determination, as a component of membranes of living fungi cells, using highly effective liquid chromatography. Determination of nitrogen concentration and isotope composition in soils and plants will allow estimating the participation of arbuscular mycorrhiza in nitrogen plant nutrition. On the basis of the isotope analysis possibility of mixotrophic nutrition of the plants of Gentianacea family forming a special form of an arbuscular mycorrhiza will be estimated. For studying of the dependence of activities of nitrogen fixation and mycorrhization of plant roots from the availability of soil nitrogen, concentration and isotope composition of total nitrogen and labile organic and inorganic nitrogen compounds, as well as potential activities of N mineralization and nitrification will be determined in soils (different natural ecosystems and field experiments). As a result of the project implementation, the detailed characteristic of interrelations between the availability of nitrogen in the soil, levels of not symbiotic and symbiotic nitrogen fixation, degree of mycorrhizal infection of plant root systems and nitrogen isotopic composition of soils and plants will be received. Such complex data will allow to estimate a role of nitrogen fixation and mycorrhizal symbiosis in nitrogen plant nutrition in mountain meadow ecosystems and to predict their possible change due to change of nitrogen availability caused by anthropogenic nitrogen input into the biosphere.

В результате выполнения проекта будет получена детальная характеристика взаимосвязей между доступностью азота в почве, уровнями несимбиотической и симбиотической азотфиксации, степенью микоризации корневых систем растений и изотопным составом азота в почвах и растениях. Такой комплекс данных позволит оценить роль азотфиксации и микоризного симбиоза в азотном питании растений горно-луговых экосистем и прогнозировать их возможное изменение при изменении доступности азота в связи с техногенной азотизацией биосферы. Будет дана оценка масштабов распространения в альпийских экосистемах нового недавно обнаруженного механизма азотного питания - формирования снежных корней. Можно обозначить несколько частных вопросов, ответы на которые будут даны в ходе выполнения проекта. Например, • Способен ли клевер (Trifolium polyphillum), не фиксирующий азот в условиях альпийского пояса (Макаров и др., 2011), восстанавливать азотфиксирующую способность при внесении фосфорных удобрений? • В какой степени азотфиксирующие субальпийские и альпийские бобовые (Oxytropis kubanensis, Hedysarum caucasicum) снижают фиксацию атмосферного азота и переходят на почвенный азот в условиях внесения азотных удобрений? • Насколько активно арбускулярная микориза участвует в азотном питании растений субальпийских и альпийских лугов, и меняется ли ее роль в азотном питании при повышении доступности азота?

Научный коллектив на протяжении многих лет проводит исследования в Тебердинском государственном биосферном заповеднике, изучая состав, структуру и функционирование альпийских экосистем. Большое внимание в исследованиях уделяется оценке доступности азота, изучению процессов трансформации соединений азота и особенностей азотного питания отдельных видов растений альпийских экосистем. В результате проведенных исследований получен ряд новых результатов. Характеристика профильного изменения изотопного состава общего и лабильного азота почвы позволила оценить роль пространственного разделения ограниченного азотного ресурса в питании отдельных видов растений, обеспечиваемого разной глубиной корневых систем (Makarov et al., 2008). Выявленные особенности сезонной динамики лабильных форм азота и активностей процессов минерализации и нитрификации позволили оценить значение зимнего периода и абиогенных факторов среды в обеспечении альпийских фитоценозов азотным питанием (Макаров и др., 2010). Обнаружена особая стратегия (снежные корни) азотного питания у Corydalis conorhiza в многоснежных местообитаниях альпийского пояса Северного Кавказа (Onipchenko et al., 2009, 2014).

Выполнение проекта осуществлено при изучении четырех типичных для Северо-Западного Кавказа экосистем альпийского пояса в Тебердинском государственном биосферном заповеднике. Исследованные биогеоценозы представлены альпийской лишайниковой пустошью, пестроовсяницевым лугом, гераниево-копеечниковым лугом и альпийским ковром, которые образуют в мезорельефе геоморфологический ряд при переходе от гребня и верхней части склона к западинам на склоне и к подножию склона. Сбор и анализ образцов почв и растений проводили в естественных биогеоценозах и в экспериментах по изучению влияния доступности элементов минерального питания на альпийские экосистемы. Перед проектом было поставлено несколько конкретных вопросов, на которые получены ответы. 1). Способен ли клевер (Trifolium polyphillum), не фиксирующий азот при произрастании в условиях альпийского пояса, проявлять азотфиксирующую способность при внесении фосфорных удобрений? В результате изучения реакции Trifolium polyphillum (биомасса, концентрация и изотопный состав азота в корнях и листьях) на повышение доступности фосфора в почве показано, что низкая доступность фосфора в горно-луговых почвах не является причиной отсутствия симбиотической азотфиксации у этого вида клевера – эндемика Кавказа. При повышении в 7-10 раз концентрации подвижного фосфора в почве в результате внесения фосфорных удобрений в течение почти 20 лет не проявляются признаки улучшения азотного статуса растения. Его биомасса не увеличилась, на корнях растений не появились клубеньки, не изменились концентрация и изотопный состав азота в листьях и корнях растения. Все эти показатели свидетельствуют, что в условиях снятия дефицита фосфора Trifolium polyphillum не получает доступа к дополнительному источнику азота, который предоставляется другим видам бобовых растений посредством симбиотической азотфиксации. Дополнительно обнаружено, что и почвенная кислотность, которая также может лимитировать образование симбиоза бобовых растений и клубеньковых бактерий рода Rhizobium, не является критическим фактором в отношении отсутствия азотфиксации у Trifolium polyphillum. Нейтрализация избыточной кислотности при известковании, приведшая к повышению pH на 0,4 ед. не привела к изменению ни одного из рассмотренных параметров. Более того, при проведении эксперимента по выращиванию из семян пяти видов бобовых растений альпийского пояса в лабораторных условиях был устранен еще один экологический фактор, который потенциально может лимитировать образование симбиоза – низкая температура почвы в альпийском поясе. Trifolium polyphillum, в отличие от других четырех видов, и в этом эксперименте не образовывал клубеньки, и при трехмесячном возрасте этих многолетних растений у них уже формировался изотопный состав азота, позволяющий рассчитать вклад азотфиксации в азотное питание Anthyllis vulneraria, Astragalus levieri, Hedusarum caucasicum, Oxytropis kubanensis при использовании Trifolium polyphillum в качестве контрольного вида. Все эти результаты позволили нам прийти к выводу: весьма вероятно, что отсутствие симбиотической азотфиксации у Trifolium polyphillum является генетически обусловленным, а не связано с экологическими условиями его произрастания. 2). В какой степени азотфиксирующие виды бобовых растений (Oxytropis kubanensis, Hedysarum caucasicum) снижают фиксацию атмосферного азота и переходят на почвенный азот в условиях внесения азотных удобрений? Изучение реакции видов бобовых растений на повышение доступности азота в почве показало, что она принципиально отличается от реакции злаков, осок и разнотравья. Если не фиксирующий азот Trifolium polyphyllum при обогащении почвы элементом проявляет реакцию, близкую к видам разнотравья, т.е. активно поглощает дополнительный азот, увеличивая его концентрацию (преимущественно в листьях) и изменяя изотопный состав (δ15N увеличивается в соответствии с более тяжелым изотопным составом привносимого азота), то концентрация азота у Oxitropis kubanensis (альпийская лишайниковая пустошь) и Hedysarum caucasicum (гераниево-копеечниковый луг) не изменилась, как и изотопный состав элемента. Оба вида продемонстрировали одинаковое отсутствие реакции на повышение доступности азота, несмотря на то, что они произрастают на почвах, характеризующихся разным исходным богатством. Рассчитанная по изотопному составу доля биологического азота в общем пуле азота Oxytropis kubanensis составила около 70% в вариантах без внесения фосфора и азота. На фоне того, что в почву добавлен относительно тяжелый азот карбамида, и изотопный состав не фиксирующего азот Trifolium polyphyllum утяжелился можно утверждать, что вклад симбиотической фиксации азота в общий пул элемента у Oxytropis kubanensis уменьшился. Расчеты показывают, что этот показатель составил 32%. Таким образом, повышение доступности азота резко снижает симбиотическую азотфиксацию у бобовых растений альпийских экосистем. 3). Насколько активно арбускулярная микориза участвует в азотном питании растений в высокогорных экосистемах, и меняется ли ее участие в азотном питании при повышении доступности азота? Оценка этого функционального значения микоризы проведена на основе анализа изотопного состава азота и фракционирования изотопов между микоризным мицелием (корнями) и листьями растений. Показано, что корни большинства видов растений обогащены изотопом 15N в сравнении с листьями. В целом, фракционирование 15N между корнями и листьями более выражено у видов, растущих на бедных почвах (альпийская лишайниковая пустошь, пестроовсяницевый луг). В этих сообществах присутствуют виды, у которых разница δ15N между корнями и листьями превышает 2-3‰, тогда как у видов, растущих на более богатых почвах, максимальная разница в изотопном составе корней и листьев составляет 1,71‰ (гераниево-копеечниковый луг) и 1,48‰ (альпийский ковер). Эта закономерность хорошо подтверждается также изменением δ15N у одного вида, произрастающего в разных сообществах (условиях доступности азота). Так, у Nardus stricta на пестроовсяницевом лугу разница δ15N между корнями и листьями составляет 3,99‰, тогда как на гераниево-копеечниковом лугу ‒ 1,71‰, а на альпийском ковре – 0,93‰. Близкий изотопный состав азота в корнях и листьях характерен для растений, имеющих механизмы адаптации к низкой доступности почвенного азота (бобовые растения лишайниковой пустоши и гераниево-копеечникового луга и Corydalis conorhiza со «снежными корнями» на альпийском ковпе). Все безмикоризные виды также не фракционируют изотопы азота между корнями и листьями во всех изученных сообществах, т.е. вне зависимости от доступности азота в почве. Выявлена отрицательная корреляция между δ15N листьев и степенью микоризации корневых систем растений (микроскопия, жирные кислоты фосфолипидов), а также положительная корреляция между фракционированием 15N между корнями и листьями и степенью микоризации. Повышение доступности азота при внесении его в почву сопровождается интенсивным поглощением элемента большинством исследованных видов растений альпийских экосистем, и утяжелением его изотопного состава в листьях. Реакция растений луговых сообществ, почвы которых более обеспечены доступным азотом, на внесение азота менее выражена, как по его аккумуляции, так и по изменению изотопного состава, в сравнении с растениями альпийской пустоши и ковра. Утяжеление изотопного состава азота в листьях растений может быть связано с изменением условий функционирования микоризы (снижение участия в азотном питании растений). Поскольку участие микоризы в транспорте азота к растениям-хозяевам может снижаться в условиях высокой доступности элемента (Veresoglou et al., 2012; Schweige, 2016), то снижается и ее значение в формировании легкого изотопного состава в листьях. Однако изучение влияния повышения доступности азота на микоризацию корневых систем показало преимущественно ее уменьшение, и лишь у отдельных видов (например, у Trifolium polyphyllum и Festuca ovina) она повысилась. При этом изменение микоризации не коррелирует с изменением изотопного состава азота листьев. Например, у Trifolium polyphyllum и Festuca ovina, повысивших микоризацию, δ15N значимо не изменилась, как и у понизившей микоризацию Carex umbrosa, тогда как у других видов, понизивших микоризацию (Anemone speciosa, Campanula tridentata), δ15N значимо увеличилась. Очевидно, что здесь вмешивается фактор изменившегося изотопного состава почвенного источника азота, так как азот карбамида исходно имеет более тяжелый изотопный состав (δ15N ~ 0‰) в сравнении с основным источником питания в нативной почве - аммонийным азотом (δ15N ~ -5‰). При разложении карбамида на поверхности почвы и улетучивания изотопно-легкого азота с аммиаком, поступающий в почву аммоний становится еще более тяжелым (приобретает положительные значения δ15N), что и определяет преимущественную тенденцию утяжеления изотопного состава азота растений. На основе установленных закономерностей мы делаем вывод, что арбускулярная микориза участвует в азотном питании растений, это в большей степени характерно для экосистем с низкой доступностью элемента, а величина δ15N в листьях и корнях альпийских растений является хорошим индикатором фракционирования 15N арбускулярными грибами, как это было ранее установлено для эктомикоризы и эрикоидной микоризы. При повышении доступности азота участие арбускулярной микоризы в питании растений, скорее, уменьшается.