ИСТИНА

Острый лейкоз (ОЛ) – тяжелое злокачественное заболевание кроветворной системы человека. Несмотря на значительные успехи в терапии, прогноз для некоторых типов ОЛ по-прежнему остается неблагоприятным. К одному из таких типов относятся ОЛ с перестройками гена MLL (KMT2A). Перестройки гена MLL встречаются приблизительно в 10% случаев острых лейкозов со значительным преобладанием в группе детей младше 1 года (80-85%). Диагностика и терапия MLL-ассоциированных лейкозов дополнительно осложняется высокой гетерогенностью хромосомных аберраций – у разных пациентов обнаруживаются как различные гены-партнеры MLL, так и различные точки разрыва внутри самого MLL. К настоящему моменту определена структура MLL-химерных генов при транслокациях с примерно сотней различных генов-партнеров. Многими исследовательскими и клиническими группами было показано, что они имеют разное прогностическое значение для ОЛ. Возникает вопрос: почему генов-партнеров MLL так много? Мы можем предложить три гипотезы, объясняющие онкогенность транслокаций с участием гена MLL. Первая заключается в том, что для онкогенной трансформации клетки достаточно нарушения целостности самого гена MLL и появления в клетке белков MLL с разобщенными функциональными доменами. В таком случае ген-партнер не является ключевым/значимым. С другой стороны, ген-партнер может являться ключевым для онкогенной трансформации. Поэтому вторая возможная гипотеза предполагает, что все гены-партнеры, сливаясь с MLL, оказываются вовлечены в некий общий каскад событий, приводящий к трансформации клеток. Третья гипотеза состоит в том, что разные гены-партнеры направляют развитие острого лейкоза, задействуя различные механизмы. Для проверки этих гипотез нами будут созданы и охарактеризованы клеточные модели с перестройками гена MLL, которые будут отличаться между собой только по гену-партнеру. Мы планируем смоделировать транслокации, варьирующие от хорошо изученных и часто встречающихся до тех, про белковый продукт которых до сих пор ничего неизвестно: MLL-AF4 — часто встречается при острых лейкозах у детей (в том числе и в российской популяции), подробно исследована. Крайне неблагоприятный прогноз. AF4 (AFF1) — компонент комплекса, стимулирующего элонгацию транскрипции. MLL-MLLT11 — транслокация, принадлежащая к группе благоприятного прогноза с длительной ремиссией. MLLT11 — ядерный белок, участвует в апоптозе. Для этой транслокации на сегодняшний день не существует клеточных моделей. MLL-AF6 — транслокация, принадлежащая к группе неблагоприятного прогноза. AF6 (MLLT4/AFDN) — цитозольный белок, участвующий в образовании межклеточных контактов. Для данной транслокации известны точки разрыва MLL как в главном кластере точек разрыва (интроны 8-12), так и в интронах 21-23. Во втором случае перестройка ассоциирована исключительно с Т-клеточным ОЛЛ. MLL-USP10 — впервые описанная нами транслокация. USP10 - убиквитин-специфическая протеаза. Механизм действия белкового продукта транслокации не известен. MLL-BTBD13 — редкая транслокация с неизвестным механизмом онкогенеза. Сам BTBD13 известен как белок ядерной оболочки, важный в сперматогенезе. MLL-ARHGAP26 — ассоциирована с сигнальным путем SRC/RAC/RHO. MLL-генХ — модельная транслокация, не встречающаяся у пациентов, и затрагивающая ген, не экспрессирующийся в клетках крови и не участвующий в регуляции клеточного цикла и апоптозе. В качестве такого гена Х будет использован, например, ген глюкагона, рековерина (белок сетчатки глаза) или псевдоген. На сегодняшний день из семи выбранных нами транслокаций в литературе описаны модели только для двух (MLL-AF4 и MLL-AF6). Как правило, транслокации изучают на разных моделях: на культурах бластных клеток (полученных из пациентов), на культурах клеток человека или мыши, транзиентно или стабильно экспрессирующих химерные белки, путем получения трансгенных животных или ксенотрансплантацией опухолей человека. Однако использование разных моделей затрудняет прямое сравнение механизмов лейкозогенеза при разных перестройках. В своей работе мы предполагаем создать модели наиболее различающихся транслокаций гена MLL, но в максимально сравнимых условиях: на основе клеток одного типа или одной линии. Клетки, несущие транслокации, будут проанализированы на предмет изменения их пролиферативных свойств и морфологических характеристик. Будет проведено кариотипирование и анализ экспрессии поверхностных маркеров, определяющих линейную принадлежность клеток. Для выяснения молекулярных механизмов онкогенеза будет проанализировано изменение транскриптома, а также определен характер эпигенетических меток, таких как уровень метилирования H3K4 и H3K79 в районе генов, экспрессия которых будет меняться после индукции транслокации. Полученные данные позволят выбрать наиболее верную из предложенных гипотез. Так, в случае драйверного действия транслокации №7 (MLL-генX) можно будет говорить о том, что ген-партнер в действительности не важен, и онкогенность обеспечивается нарушением структуры гена MLL как таковой. В том случае, если для разных транслокаций будут обнаружены общие механизмы (например, усиление одних и тех же сигнальных каскадов или одинаковые изменения хроматиновых меток), верной окажется вторая гипотеза. Если же разные транслокации будут приводить к изменению экспрессии разных наборов генов или к различным профилям хроматиновых меток, предпочтение будет отдано третьей гипотезе. Выбор между этими гипотезами важен, поскольку позволит выявить ключевые мишени для терапии различных MLL-ассоциированных лейкозов и предложить новые критерии стратификации пациентов по группам риска, что является основой для персонализированной медицины будущего. Кроме того, полученные в ходе реализации настоящего проекта модельные клеточные линии могут использоваться в качестве удобной тест-системы при разработке новых противолейкозных препаратов.

Acute leukemia (AL) is a severe malignant disease of the human hematopoietic system. Despite significant advances in therapy, the prognosis for some types of AL remains unfavorable. One of these types is AL with rearrangements of the MLL gene (KMT2A). MLL gene alterations occur in approximately 10% of cases of acute leukemia, with a significant predominance in the group of children under 1 year of age (80-85%). Diagnostics and therapy of MLL-associated leukemia is further complicated by the high heterogeneity of chromosomal aberrations — different patients have different MLL partner genes and different breakpoints within the MLL itself. To date, the structure of MLL chimeric genes has been determined in translocations with about a hundred different partner genes. Many research and clinical groups have shown that they have different prognostic significance for AL. The question arises: why are there so many MLL partner genes? We can offer three hypotheses explaining the oncogenicity of translocations involving the MLL gene. The first is that for oncogenic cell transformation, disruption of the integrity of the MLL gene itself and the appearance of MLL protein with fragmented functional domains are sufficient. In this case, the partner gene is not key / significant. On the other hand, the partner gene may be important for oncogenic transformation. Therefore, the second possible hypothesis suggests that all partner genes, fusing with the MLL, are involved in some general cascade of events leading to cell transformation. The third hypothesis is that different partner genes direct the development of acute leukemia, using various mechanisms. To test these hypotheses, we intend to obtain and characterize cell models with the MLL gene rearrangements , which will differ from each other only by the gene-partner. We plan to simulate translocations, ranging from well-studied and frequently encountered to those whose protein product is still unknown: MLL-AF4 - often found in children with acute leukemia (including in the Russian population), has been studied in detail. Extremely unfavorable prognosis. AF4 (AFF1) is a component of the complex that stimulates transcription elongation. MLL-MLLT11 is a translocation belonging to the group of favorable prognosis with a prolonged remission. MLLT11 is a nuclear protein that is involved in apoptosis. For this translocation, there are currently no cellular models. MLL-AF6 - translocation belonging to the group of unfavorable prognosis. AF6 (MLLT4 / AFDN) is a cytosolic protein involved in the formation of cell-cell junctions. For this translocation, MLL breakpoints are known both in the major breakpoint cluster region (introns 8-12) and downstream from it (introns 21-23). In the second case, the translocation is associated exclusively with T-ALL. MLL-USP10 - translocation first described by us. USP10 is a ubiquitin-specific protease. The mechanism of action of the protein translocation product is not known. MLL-BTBD13 is a rare translocation with an unknown oncogenesis mechanism. BTBD13 itself is known as a nuclear envelope protein, important in spermatogenesis. MLL-ARHGAP26 - associated with the SRC / RAC / RHO signaling pathway. MLL-geneX is a model translocation not found in patients and affecting a gene that is not expressed in blood cells and is not involved in cell cycle regulation and apoptosis. As gene X, for example, the gene for glucagon, recoverin (retinal protein) or pseudogene will be used. Today, of the seven translocations we have selected, only two models have been described in the literature (MLL-AF4 and MLL-AF6). Generally, translocations are studied on different models: on blast cell cultures (obtained from patients), on human or mouse cell cultures, which transiently or stably express fusion proteins, by obtaining transgenic animals or by xenotransplantation of human tumors. However, the use of different models makes it difficult to directly compare the mechanisms of leukemogenesis in case of different translocations. In our project, we propose to create models of the very distinct translocations of the MLL gene, but under the very comparable conditions: on the basis of cells of the same type or one line. Cells bearing translocations will be analyzed for changes in their proliferative properties and morphological characteristics. Karyotyping and analysis of the expression of surface markers that determine the linear commitment of cells will be carried out. To determine the molecular mechanisms of oncogenesis, a change in the transcriptome will be analyzed, as well as the nature of epigenetic labels, such as the methylation level of H3K4 and H3K79 in the region of genes, the expression of which will change after induction of translocation will be determined. The obtained data will allow to choose the most correct of the proposed hypotheses. So, in the case of the driver action of translocation No. 7 (MLL-geneX), it will be possible to say that a partner gene is not in fact important, and oncogenicity is provided by a disruption of the structure of the MLL gene itself. If common mechanisms will be shown for different translocations (for example, activation of the same signaling cascades or identical changes in the chromatin labels), the second hypothesis would be correct. If different translocations will lead to a change in the expression of different sets of genes or to different profiles of chromatin tags, preference will be given to the third hypothesis. The choice between these hypotheses is important because it will identify key targets for the treatment of various MLL-associated acute leukemias and suggest new criteria for risk group stratification of patients, which is strongly important for personalized medicine. In addition, model cell lines obtained might be used as a convenient test system for the development of new anti-leukemic drugs.

В результате выполнения проекта нами будут получены и охарактеризованы клеточные модели, несущие в геноме транслокацию гена MLL с такими партнерами как AF4, AF6, MLLT11, USP10, BTBD13, ARHGAP26, а также транслокация с геном, не замеченным ранее в перестройках с MLL. Будет исследовано влияние полученных транслокаций на пролиферативные свойства клеток, а также выявлены молекулярные механизмы, обуславливающие онкогенные свойства различных транслокаций: универсальные, или, наоборот, уникальные для каждой перестройки. В частности, будет проанализирована экспрессия поверхностных маркеров полученных клеток, определяющих принадлежность к той или иной линии дифференцировки, изучено изменение транскриптома и эпигенетических меток, вносимых интактным MLL и его перестроенными вариантами. Будет оценена экспрессия генов HoxA-кластера и ряда онкомаркеров, таких как циклины, MYC и RAS. Полученные данные будут иметь фундаментальное значение, поскольку расширят понимание молекулярных механизмов возникновения и развития MLL-ассоциированных лейкозов. В частности, будет получен ответ на вопрос, являются ли данные транслокации онкогенными сами по себе, либо их обнаружение у пациентов является следствием геномной нестабильности клеток опухоли. Кроме того будет подтверждено либо опровергнуто предположение об универсальности “возврата” клеток опухоли к более ранней стадии дифференцировки как механизма онкогенной трансформации, а также о том, что переключения между лимфоидным и миелоидным фенотипом опухолевых клеток является следствием этого возврата. Настоящий проект имеет также и прикладное значение, так как полученные результаты могут послужить основанием для введения дополнительных критериев стратификации пациентов по группам риска. Это позволит перейти к персонализированному подходу при лечении острых лейкозов с различными транслокациями гена MLL. Вполне возможно, что терапевтические протоколы, эффективные для ряда перестроек MLL при ОЛ разных групп риска, окажутся малоэффективными для других перестроек. Наконец, полученные в ходе реализации настоящего проекта модельные клеточные линии могут использоваться в качестве удобной тест-системы при разработке новых противолейкозных препаратов.