Молекулярные механизмы разрешения воспаления в астроглии мозгаНИР

Molecular mechanism of resolution of inflammation on astroglial cells

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 16 мая 2016 г.-15 декабря 2016 г. Молекулярные механизмы разрешения воспаления в астроглии мозга
Результаты этапа: Все планируемые результаты выполнены, приведены в файле Приложение в форме отчета, результаты подготовлены для отправки в печать, однако ещё не отправлены, так как часть результатов не обработано из-за длительности поставки заказанных реактивов (в первую очередь по задаче 7). Тем не менее по задаче 6, по которой не планировалось публикации в 2016 году, удалось выполнить работу в форме статьи, которую без замечаний приняли в журнал PLOS ONE, т.е. по этому пункту перевыполнили обязательства. По задаче 1 получены следующие результаты. Проведен анализ экспрессии генов на уровне мРНК через 1 и 4 часа после стимуляции клеток ЛПС (100 нг/мл). Результаты показали, что уровни мРНК ТТР в культурах астроцитов после 1 часа стимуляции эндотоксином превышали контрольные приблизительно в 15 раз, в то время как через 4 ч уровни экспрессии ТТР были повышены примерно в 7 раз по отношению к контролю (не стимулированным клеткам) Изменения экспрессии HUR выявлено не было. Мы не выявили изменений экспрессии белков ТТР и HUR в течение 4 часов. Было получено, что использование LPS в концентрации 1000 нг/мл индуцировало усиление экспрессии белка HUR, однако не влияло на уровень белка ТТР. Получено, что добавление 5 мкМ Cli-095 снимает эффект индукции циклооксигеназы 2 под воздействием LPS. Результаты анализа подтвердили снижение экспрессии TTP в LPS стимулированных культурах при предварительной обработке клеток антагонистом TLR-4. Согласно полученным данным, анизомицин усиливал экспрессию мРНК TTP примерно в 45 раз и экспрессию HUR в 3 раза. Этот эффект существенно снижался при добавлении к клеткам SB203580 – до 8 раз для ТТР и в 1,8 раз для HUR в культурах с сочетанной обработкой. Эти результаты указывают на возможное участие фосфорилированного белка в регуляции фоновой экспрессии ТТР. Проведена оценка влияние актиномицина Д на скорость деградации мРНК исследуемых генов ТТР и HUR. Получено, что уровень мРНК ТТР изменялся более, чем в пять раз (менее 20% от исходного) уже через 30 минут после добавления к клеткам актиномицина Д (период полужизни составлял около 10 минут). Обработка клеток LPS увеличивала уровень транскрипта до 40% через 30 минут после добавления актиномицина Д (время полужизни примерно 25 минут. Таким образом, полученные результаты указывают на высокую скорость деградации мРНК ТТР в астроцитах и усиление стабильности транскрипта в условиях воспалительного ответа в р38-зависимой форме. HUR имеет гораздо более стабильные транскрипты. Таким образом, полученные результаты указывают на то, что в ходе воспалительного ответа HUR регулируется на уровне внутриклеточной локализации, как в других клетках, однако, по-видимому, не изменяет уровень экспрессии в ходе физиологического воспалительного ответа. По задаче 2 получены следующие результаты. Получено, что изменение экспрессии СОХ-2 на уровне белка возможно детектировать после 2 часов стимуляции. Далее уровень фермента возрастал с максимумом между 12 и 24 часами и превышал значения базального уровня вплоть до точки равной 72 часам после обработки эндотоксином. Получено, что концентрации LPS 10 нг/мл, 100 нг/мл и 1000 нг/мл вызывали примерно 25-30ти кратное увеличение мРНК СОХ-2, концентрации LPS 1 нг/мл стимулировали примерно 15ти кратное усиление экспрессии мРНК, в то время как концентрация LPS 0,1 нг/мл не вызывала детектируемых изменений в экспрессии СОХ-2 на уровне мРНК после 4х часов стимуляции. На уровне белка, минимальной концентрацией LPS, для которой после 4 часов отмечали эффект индукции экспрессии СОХ-2, была концентрация 10 нг/мл (примерно 1,5 кратное усиление экспрессии СОХ-2). Концентрация LPS 100 нг/мл вызывала примерно 3х кратное усиление экспрессии СОХ-2 и по силе эффекта не отличалась от воздействия LPS в концентрации 1000 нг/мл. Таким образом, в рамках нашей модели, концентрации LPS 0,1 и 1 нг/мл мы определяем как подпороговые, концентрацию 10 нг/мл считаем невысокой, а 100 нг/мл и 1000 нг/мл рассматриваем как варианты сильной стимуляции. Получено, что стимуляция астроглиальных клеток LPS приводила к усилению выброса PGE2 примерно в 5 раз, а также индуцировала экспрессию мРНК и белка TNFα примерно в 350 и в 750 раз соответственно, а также мРНК и белка IL10 примерно в 130 и в 80 раз соответственно. Таким образом, ранние этапы клеточного ответа астроцитов на LPS возможно охарактеризовать как провоспалительный процесс, однако уже в это время начинается синтез противовоспалительных веществ. По задаче 3 получены следующие результаты. Получены кинетические зависимости экспрессии на уровне мРНК и на уровне белка циклооксигеназ семейства 1 и 2 (РВ-ПЦР и иммуноблоттинг) и выброса PGE2 при стимуляции клеток LPS. Исследование экспрессии COX показало, что уровень мРНК COX-2 начинает возрастать уже через 2 ч после LPS стимуляции, достигает максимума к 4 ч инкубации астроцитов с LPS, незначительно снижается к 16 ч и остается на этом уровне до 24 часов инкубации астроцитов с LPS, данные иммуноблотинга показали, что уровень белка COX-2 значительно возрастает к 4 ч LPS стимуляции и далее практически не растет. LPS приводит к незначительному падению уровня экспрессии COX-1 к 4 ч, далее этот уровень сохраняется. Измерения уровней белка COX-1 подтверждает, что экспрессия COX-1 незначительно изменяется в ответ на стимуляцию астроцитов LPS. Полученные результаты согласуются с общепринятыми представлениями о COX-1 как о конститутивно экспрессирующемся гене и о COX-2 как о ферменте, индуцируемом при воспалительном ответе. Пробы на PGD2 собраны, но не проанализированы (ожидаем закупленный кит на анализ). Проведена первичная оценка влияния ДНЕА на экспрессию СОХ2, выброс IL10 и TNFα. Построена обобщенная схемы регуляции синтеза первичных и вторичных простагландинов в астроцитах. Обзор литературных данных выявил, что основная проблема в расчетах возможностей модуляции превращений первичных астроцитов в циклопентеноновые – в отсутствии ясного понимания механизма такого превращения и возможной роли циклопентеноновых простагландинов в модуляции синтеза первичных простагландинов и их эффектов на астроглии. Остается открытым вопрос о возможности перехода астроцитами с синтеза простагландинов и циклопентеноновых простагландинов на синтез резолвинов и других оксилипидов – производных омега-3 полиненасыщенных жирных кислот. По задаче 4 получены следующие результаты. При исследовании регуляторного цикла фосфорилирования-дефосфорилирования получены данные фосфорилирования JNK и р38 при стимуляции LPS. Получено, что стимуляция клеток LPS приводила к усилению экспрессии фосфорилированных форм JNK и р38, при этом уровни фосфорилированных белков после 2х часов обработки LPS были выше, чем уровни, которые наблюдали через 4 часа после добавления эндотоксина. Примечательно, стимуляция клеток при этом приводила к снижению экспрессии тотального белка JNK, в то время как уровень тотального белка р38 не изменялся под воздействием LPS. Результаты анализа кинетики экспрессии фосфатазы МКР1 не продемонстрировали изменения фосфатазы после стимуляции LPS. Получены данные по влиянию LPS и триптолида на экспрессию белка MKP1 и фосфорилирование р38. По задаче 5 получены следующие результаты. В первой серии экспериментов культуры первичных астроцитов инкубировали в среде с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л). Мы получили, что в условиях гипергликемии все исследуемые нами ингибиторы MAPK снижают синтез TNFα. При этом, не смотря на разницу в уровне LPS-стимулированного синтеза TNFα, статистически значимого различия между действиями ингибитора не показано. Такую же картину можно наблюдать и для LPS-стимулированного уровня синтеза PGE2. Полученные результаты свидетельствуют, что культивирование астроцитов в среде с различной концентрацией глюкозы не снижает противовоспалительную эффективность тестируемых ингибиторов. Во второй серии экспериментов клетки инкубировали с низкими концентрациями ЛПС в течение длительного времени (48 часов). Концентрации ЛПС были выбраны на основе данных, полученных при решении задачи 1. После адаптации клеток, их стимулировали ЛПС в концентрации 100 нг/мл. Измеряли экспрессию Сох-2, TNFα, IL10. Получено, что предварительная инкубация астроглиальных клеток с эндотоксином снижает уровень мРНК СОХ-2, индуцируемый повторной обработкой LPS. Примечательно, что это снижение не согласуется с ростом экспрессии на уровне белка. Наши данные указывают на то, что условия многократной провоспалительной стимуляции могут оказывать влияние на интенсивность трансляции, однако данное предположение требует дальнейшей проверки. Полученные результаты по экспрессия TNFα и IL10 указывают на подавление индукции TNFα в условиях двукратной стимуляции (10/100 по сравнению с 0/100). Этот эффект был выявлен как на уровне экспрессии мРНК, так и на уровне экспрессии белка. Наши результаты демонстрируют усиление экспрессии IL10 на уровне мРНК и белка в условиях модели 10/100 по сравнению с моделью 0/100 (530 ± 96 против 130 ± 20 пг/мл соответственно). То есть, длительная провоспалительная стимуляция усиливает интенсивность экспрессии IL10 в ответ на повторную стимуляцию. Для астроглиальных клеток изменение экспрессии IL10 в условиях повторных стимуляций LPS ранее показано не было. По задаче 6 получены следующие результаты. Проведен анализ литературных данных и составлен список генов, потенциально управляющих резолюцией. Проведен предварительный анализ изменений генов списка в транскриптомах, полученных при анализе данных пациентов с различными типами рака. Данные, представленные в открытых базах данных, были проанализированы методом WGCNA и собраны в специальную коллекцию. В рамках выполнения проекта нами была создана специальная программа, которая позволяет работать с одним геном или группой генов, или аннотированным по функции модуле (группа коэкспрессированных генов). Выдает коэкспрессированные гены и модули с различными функциями. По результатам опубликована статья в журнале PLOS ONE , т.е. обязательства перевыполнены (по этой теме не планировали в 2016 году результатов, однако задержка с поставкой реактивов позволила сконцентрировать усилия в этом направлении). По задаче 7 получены следующие результаты. Разработаны методики масс-спектрометрического определения липидных медиаторов резолюции в клеточном супернатанте, и показано изменение концентрации липидных медиаторов резолюции при действии ЛПС. Получены спектры масс-спектрометрического определения и графики зависимостей
2 1 января 2017 г.-15 декабря 2017 г. Молекулярные механизмы разрешения воспаления в астроглии мозга
Результаты этапа: Проект направлен на поиски молекулярных механизмов разрешения воспаления астроцитами (глиальные клетки мозга). Поиск ведется по нескольким направлениям: 1) регуляция на уровне деградации мРНК, 2) за счет изменения цикла фосфорилрования-дефосфорилирования, 3) за счет особого набора цитокинов, 4) за счет особого набора оксилипидов. В 2017 году завершены работы по изучению регуляции белков системы ARE-опосредованной регуляции стабильности мРНК в разрешении воспаления в астроцитах: 1) ТТР (тристетрапролин), который ускоряет скорость деградации и 2) HUR (замедляет скорость деградации). Проведено сравнение с макрофагами (линия RAW264.7) Подтверждено, что ТТР индуцируется в ответ на активацию TLR4 рецепторов, однако количества белка в астроцитах значительно ниже уровня, наблюдаемого в клетках миелоидного происхождения Raw 264.7, хотя на уровне мРНК индукция экспрессии на макрофагах и астроцитах примерно одинаковая. Материал оформлен в виде статьи и направлен в журнал Neurochem Int. Исследован другой белок этой системы – KSRP. Показано, что его экспрессия увеличивается на поздних стадиях развития клеточного ответа на воспалительный стимул. Сравниваем стимулы, активирующие рецепторы системы врожденного иммунитета TLR4 (рецептор плазматической мембраны) и TLR3 (рецептор внутриклеточной мембраны). Провели исследование по стимуляции ARE-связывающих белков низкомолекулярными модуляторами: росиглитазоном, нестероидными противовоспалительными препаратами, стероидными препаратами с антивоспалительным эффектом (ДГЕА – дегидроэпиандростерон) и/или ингибиторами компонентов сигнальных путей: 1) МАРK (митоген активируемых киназ), 2) МЕК (киназ митоген активируемых киназ), PI3K (фосфоинозитид-3-киназы), Akt/PKB (протеинкиназы Б). Материалы обрабатываются, результаты представлены в отчете. Проведена серия исследований по анализу участия про- и антивоспалительных цитокинов в разрешении воспаления в астроцитах. Детально охарактеризовано влияние различных агентов на индукцию экспрессии IL-10 в астроглиальных клетках в различных режимах экспозиции. Показано зависимость выброса IL-10 от ингибитора NFкВ. Получены пробы по влиянию Akt/PKB на LPS-стимулированную индукцию IL-10. При исследовании ДГЭА его добавляли за 24 ч (долговременная) или за 30 мин (кратковременная экспозиция) до стимуляции клеток в концентрации 100 нМ, а затем инкубировали либо без дополнительной стимуляции, либо в течение 4 ч стимулировали LPS в концентрации 100 нг/мл. Определяли изменения в уровне мРНК и белка таких маркеров воспаления, как провоспалительный фактор некроза опухоли α (TNFα), противовоспалительный цитокин интерлейкин 10 (IL-10) и циклооксигеназа 2 (СОХ-2) – регулятора про- и антивоспалительных процессов. Экспрессию мРНК IL-10, COX-2 и TNFα определяли методом ПЦР в реальном времени, уровень белка COX-2 – методом иммуноблотинга, выброс TNFα и IL-10 – с помощью иммуноферментного анализа. Дополнительно использовали анти-воспалительный препарат трилостан (ингибитор 3β-гидроксистероид-дегидрогеназы). Материал опубликован в журнале «Биологические мембраны». Аналогичным образом проанализировано модулирующее действие росиглитазона, активатора ядерных рецепторов PPARγ, на выброс IL-10 и TNFα при стимуляции LPS. Охарактеризовано влияние GW9662, антагониста PPARγ, для оценки PPARγ-зависимого/независимого эффекта росиглитазона. Росиглитазон усиливает LPS-стимулированную экспрессию мРНК СОХ-2 и IL-10, но не TNFα. Показано, что стимулирующее влияние росиглитазона на IL-10 не снимается GW9662. Это указывает на PPARγ-независимый эффект росиглитазона. Материал опубликован в журнале Биохимия (Моск). В планах 2017 года предполагалось исследовать экспрессию и регуляцию антивоспалительного цитокина – IL-4, однако во всех исследуемых пробах и исследуемых активациях TLR4, TLR3 рецепторов нами не обнаружено высвобождение IL-4 астроцитами. В 2017 год также начаты работы по моделированию (с использованием подходов системной биологии) TLR-сигнального пути с целью из сравнения астроцитов (клеток неиммунного происхождения) и макрофагов (клетки иммунной системы, наиболее изученные на настоящее время), оценить возможности модуляции цитокинов в астроцитах. На первом этапе взяли модель для макрофагов из опубликованной работы, учитывающую взаимодействие TLR, IL-10, NF-kB, STAT и др. Мы реализовали модель двумя способами (MATLAB, SimBiology), однако в ходе исследования обнаружили, что параметры указанные авторами опубликованной модели не сходятся между собой. Проведенные исследования по анализу этой модели были обсуждены на секции «Биоинформатика» Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2017». Далее было принято решение выстраивать свою топологию модели, адаптируя части её из других работ. После анализа литературы и получения собственных экспериментальных данных по кинетике высвобождения цитокинов астроцитами было решено разделить моделирование на 2 этапа, на первом этапе провести моделирование выброса цитокина TNF (более короткие времена активации), на втором этапе - подсоединить IL-10 (долгие времена активации). Для моделирования TNFα за основу была взята модель на макрофагах (Caldwell 2014 PMID: 25274725). Код модели описанной в статье, был предоставлен, одним из авторов, господином Хоффманном. При оптимизации параметров модели для экспериментальных данных на астроцитах использовали Data2Dynamics. Результаты представлены в отчете. Проведена дальнейшая характеристика регуляции экспрессии и активности СОХ-2 и роли этих процессов в индукции разрешения воспаления и регуляции оксилипидных медиаторов в ходе резолюции воспаления в астроцитах. Резолвинов в астроцитах нами не обнаружено, результаты по другим маркерам представлены в соответствующих задачах. Проведены запланированные эксперименты с оценкой влияния низкомолекулярных ингибиторов (SB203580, ингибитор p38 MAPK; перифозин, ингибитор пути Akt/PKB) на экспрессию аргиназы 1 в астроцитах. Проведена оценка вклада циклопентеноновых простагландинов и других потенциальных модуляторов процессов резолюции (резолвины, DHEA, модуляторы окислительных процессов в клетках) в регуляцию функций астроцитов при различных стимуляциях. Оценен вклад оксилипинов (циклопентеноновых простагландинов) в регуляцию функций астроцитов (астроглиоз). Проведено сравнение эффектов циклопентеноновых простагландинов PGA2 (образуется из первичного простагландина PGE2) и 15d-PGJ2 (образуется из первичного простагландина PGD2) в модели астроглиоза (стимулированная сывороткой (ростовыми факторами) пролифирация астроцитов, предварительно синхронизированных 48 ч депривацией по сыворотке). Показано. что оба циклопентеноновых простагландина оказывают схожее воздействие. Изучено комбинированное применение циклопентеноновых простагландинов с антагонистом PPARγ (GW9662), специфическим ингибитором СОХ-1 (SC-560), специфическим ингибитором СОХ-2 (NS-398), ингибитором MRP1 (multidrug resistance protein-1) и CysLT1 рецепторов (MK-571). Материал подготовлен к публикации и направлен в международный журнал. Поскольку работа предполагает многофакторный поиск литературных данных для теоретического анализа, то нами разрабатывается наукометрическая программа, позволяющая по заданному ключевому слову выбирать лидеров в данной области исследования, а также показывать пересечение ключевых слов (задач) исследования. В настоящее время программа позволяет выбирать лидеров в данной области исследования, показывает ключевые слова по каждому из лидеров, а также соотношение статей и обзоров (что указывает на исследовательскую активность авторов). В ходе экспериментов предыдущего года мы показали, что на астроцитах фосфатаза, ответственная за снижение фосфорилирования р38 не регулируется на этапе транскрипции. Это интересный и значимый результат, который предполагалось проанализировать подробнее. В рамках дальнейшего анализа были поставлены две задачи: 1) проверить влияние окадаиковой кислоты - ингибитора PP1/РР2А на уровень фосфорилирования р38; 2) подтвердить отрицательный результат вовлечения транскрипции в процесс регуляции уровней фосфорилирования р38. В рамках решения первой задачи влияния окадаиковой кислоты на фосфорилирование р38 выявить не удалось, поскольку окадаиковая кислота в концентрациях выше 100 нМ вызывала выраженную гибель астроцитов уже к 4 часам инкубации клеток с этим веществом. При такой высокой токсичности, окадаиковая кислота не подходит для анализа участия РР1 и РР2А в регуляции фосфорилировании МАРК р38. В то же время в рамках решения второй задачи были получены интересные данные, которые оформлены в отчете. Проведены исследования на клеточных моделях с имитацией хронического воспаления, создаваемого многократным добавлением ЛПС (эндотоксиновая толерантность) или инкубацией в условиях повышенной концентрации глюкозы в среде. Результаты оформляются в виде статьи и готовятся к публикации. Поставлена методика масс-спектрометрического определения липидных медиаторов резолюции в клеточном супернатанте, получены первые результаты по регуляции высвобождения циклопентеноновых простагландинов и резолвинов. В настоящее время в клеточном супертанате определяем 20 оксилипидов и жирных кислот. Результаты входят в направленные в печать статьи и оформлены в виде отчета.
3 1 января 2018 г.-14 декабря 2018 г. Молекулярные механизмы разрешения воспаления в астроглии мозга
Результаты этапа: К концу 2018 г. по проекту опубликовано 8 статей, из них 5 за 2018 год (их них 3 статьи в Q1 по SJR). Важным результатом, который может объяснить наблюдаемые отличия в действии известных на других клеточных системах факторов резолюции, наблюдаемое нами в проведенных исследованиях, является обнаруженное нами явление зависимости TLR-сигналинга и чувствительности к модуляции низкомолекулярными веществами от пола животного, из которого получены клетки. Результаты некоторых предварительных экспериментов в 2017 году натолкнули нас на эту гипотезу, которую мы проверили и подтвердили. По конкретным задачам достигнуты следующие результаты. Задача 1 (Участие системы ARE-опосредованной регуляции стабильности мРНК в разрешении воспаления в астроцитах). Проведены эксперименты по анализу экспрессии KSRP при стимуляции астроцитов. Получено что в исследуемой клеточной модели регуляции KSRP не происходит. Данные по изменению экспрессии KSRP на коротких временах (4-8 часов) и при более длительных (24-48ч) инкубациях представлены на Рис.1.1. (приложение). Оценено изменение локализации HUR в ядре (соотношение ядро/цитоплазма) при стимуляции астроцитов LPS (данные были получены путем обработки снимков конфокальной микроскопии полученных ранее), а так же было оценено изменение локализации TTP (цитоплазма/ядро) при стимуляции клеток LPS. Результаты исследования по ТТР и HUR опубликованы в статье (Astakhova et.al. 2018, Regulation of the ARE-binding proteins, TTP (tristetraprolin) and HuR (human antigen R), in inflammatory response in astrocytes. Neurochemistry International, https://doi.org/10.1016/j.neuint.2018.04.014).. Задача 2 (Анализ участия антивоспалительных цитокинов в разрешении воспаления в астроцитах). Результаты сравнения модуляции цитокинов IL-10 и TNFa при стимуляции TLR3 и TLR4 сигнальных путей, а также результаты сравнения влияния росиглитазона на высвобождение факторов резолюции и других цитокинов у нейронов и астроцитов опубликованы в статье (Chistyakov et.al. 2018, International Journal of Molecular Sciences, https://doi.org/10.3390/ijms19010113). Результаты анализа механизмов регуляции TGFβ на различных клетках, опубликованные другими исследователями, показали сложность анализа данной системы экспериментально на астроцитах, объединенных от животных разного пола. Исследования на культурах, получаемых из самцов и самок, не входило в начальные задачи исследования, поэтому результаты в этом направлении не анализировали. Получена модель адекватно описывающую динамику выброса белка и мРНК TNFa на астроцитах. В модели присутствуют модули отвечающие за непосредственно путь образования белка TNFa, и регуляторные модули, на него влияющие, которые адаптируют симулированный сигнальный ответ модели под конкретный тип клеток, а именно под астроциты. Получены уточненные кинетические параметры для каждой биохимической реакции модели, проведено симулирование динамических характеристик (Приложение, раздел 2, рис. 2.1-2.4). По результатам сделан доклад на конференции Ломоносов, защищена курсовая работа членом коллектива А. Положинцевым на факультете Биоинженерии и биоинформатики МГУ. Таким образом, все планируемые результаты с использованием подходов системной биологии получены. Результаты экспериментального сравнения модуляции цитокинов IL-10 и TNFa при стимуляции TLR3 и TLR4 сигнальных путей, а также влияние на экспрессию препаратов с предположительно проразрешающей антивоспалительной активностью и индукцией разрешения воспаления (выброс оксилипидов) опубликованы в виде статьи (Chistyakov et.al. 2018, International Journal of Molecular Sciences, https://doi.org/10.3390/ijms19010113). Задача 3 (Анализ участия СОХ-2 в индукции разрешения воспаления и регуляции оксилипидных медиаторов в ходе резолюции воспаления в астроцитах) Результаты по влиянию TLR3 и TLR4 агонистов на индукцию СОХ-2 и синтез продуктов - оксилипинов опубликованы (Chistyakov et.al. 2018, International Journal of Molecular Sciences, https://doi.org/10.3390/ijms19092793). Результаты по влиянию на астроциты краткосрочных и длительных экспозиций с агонистами TLR4 (LPS) и TLR3 (Poly:IC) доложены на конференции (FEBS Congress 2018) и опубликованы в журнале (Chistyakov et.al. 2018, FEBS open bio, doi:10.1002/2211-5463.12453). Показано, что экспрессия аргиназы не меняется при стимуляции толл-подобных рецепторов на протяжении времени исследования (рис. 3.1 Приложение). Данные соотнесены с изменением экспрессии СОХ-2. Экспериментальные данные по экспрессии аннексина А1 при стимуляции толл-подобных рецепторов представлены на (рис. 3.2. Приложение). Получены клеточные пробы по влиянию ингибиторов SB203580 (10 мкМ, ингибитор p38 MAPK), SP600125 (10 мкМ, ингибитор JNK MAPK), Bay 11-7082 (5 мкМ, ингибитор NF-кВ), перифозин (5 мкМ, ингибитор пути Akt/PKB) при стимуляции LPS, которые подготовлены для дальнейшего анализа на экспрессию на уровне белка на СОХ-2 и аргиназу. Требуется предварительная отработка метода анализа аннексина А1 для повышения чувствительности детекции. Возможно также необходим учет пола животного, из которого получены клетки, поэтому однозначного вывода о роли аргиназы-1 и аннексина А1 сделать из полученных результатов пока нельзя. Построена схема, отражающая общие принципы разделения информации на про-воспалительную и антивоспалительную при активации толл-подобных рецепторов включающая сигнальные пути резолюции, результаты представлены в обзоре (Chistyakov et.al. 2018, Experimental and Molecular Pathology, https://doi.org/10.1016/j.yexmp.2018.08.002). Задача 4 (Исследование роли цикла фосфорилирование - дефосфорилирование с участием р38 митогенактивированной протеинкиназы и фосфатаз в регуляции процессов резолюции в астроцитах) На 2018 г. планировали детальное изучение фосфатазы MKP7, однако результаты экспериментов по оценке влияния МКР7 на уровень фосфорилирования МАР киназ р38 и JNK в астроцитах в условиях провоспалительной обработки показал, что эта фосфатаза не участвует в регуляции на астроцитах. Результаты представлены на Рис. 4.1. (Приложение). Данные по изменению фосфорилирования р38 и JNk при воздействии LPS в различных условиях получены (см. Рис. 5.2 приложения). Задача 5 (Исследование процессов разрешения воспаления на клеточных адаптационных моделях). Результаты по сравнению влияния TLR3 и TLR4 агониста на экспрессию цитокинов и СОХ-2 при культивировании клеток в среде с высокой и нормальной концентрацией глюкозы доложены на конференции (FEBS Congress 2018) и опубликованы в журнале в виде тезисов (Azbukina et.al. 2018, FEBS Open bio, doi:10.1002/2211-5463.12453). Также получены следующие результаты. Охарактеризована модель 48 ч адаптации к высокой концентрации глюкозы при стимуляции TLR4 и TLR3 рецепторов по морфологии, экспрессии цитокина TNFa, синтеза PGE2 (рис. 5.1. Приложение), изменение уровня экспрессии и активности р38 и JNK при стиммуляции LPS в различных моделях адаптации к глюкозе (рис. 5.2., Приложение). Схемы используемых обработок приведены на рис. 5.3. (Приложение). Изменение экспрессии COX-2, iNOS, TNFa, TLR3, TLR4, IL-10 при культивировании клеток в различных концентрациях глюкозы. измерено (Рис. 5.4. Приложение). Выброс воспалительных медиаторов (TNFa, IL-10, PGE2) и экспрессия белка СОХ-2 при различных метаболических состояниях охарактеризованы (Рис.5.5. Приложение). Получены предварительные результаты по влиянию кондиционированной среды на воспалительные ответы астроцитов и нейронов (при стимуляции TLR4 и TLR3 сигнальных путей на указанных клетках). Задача 6 (Биоинформатический анализ механизмов, вовлеченных в разрешение воспаления) При проведении анализа транскриптома методами биоинформатики было для аннексина А1 соотнесена экспрессия аннексина А1 с прогнозом по выживаемости на глиомах (известно, что усиление воспалительного процесса связан с ухудшением прогноза выживаемости). Обнаружено, что экспрессия аннексина А1 усиливается в классах глиом с наихудшим прогнозом (таблица 6.1. Приложения). Также методом WGCNA проведен анализ коэкспрессирующихся генов и построена схема участвующих партнеров (рис. 6.2. Приложение). Таким образом, наши исследования ставят под сомнение гипотезу, что аннексин А1 может являться маркером воспалительных процессов на астроцитах. Это требует дальнейших отдельных исследований. Не удалось обнаружить подходящих для биоинформатического анализа массивов данных от больных на разных этапах выздоровления от различных болезней. Результатом биоинформатического анализа сочетанного использования генов с терминами резолюции и другими генами и анализа литературных данных, проведенных в 2018 г, стало формирование обобщенной схемы генов, которые могут выступать маркерами разрешения воспаления или ключевыми участками разрешения воспаления. Результат опубликован в виде обзора Задача 7 (Анализ высвобождения оксилипидов, характеризующих разрешение воспаления в астроцитах в условиях клеточных культур, обработанных про- и антивоспалительными стимулами). Проведена валидация методики определения оксилипинов. Определялись параметры: 1) линейность; 2) точность и погрешность; 3) пределы определения. 1. Для определения линейности исследуемого метода была построена калибровочная кривая методом линейной регрессии (методом наименьших квадратов) по 6 точкам (0; 0,2; 0,4; 1; 1,4; 2 нг/пробу). Для каждого соединения были определены следующие параметры: величина наклонной прямой, пересечение с осью OY, стандартные и относительные ошибки этих параметров, коэффициент корреляции, стандартная ошибка регрессии для intra и interday воспроизводимости. Результаты представлены в таблице 7.1 приложения. Для всех соединений, кроме PGF2a-d4, 12-HETE-d8, DHA-d5 были получены результаты, удовлетворяющие стандартам FDA (r2>0,75). 2. Точность и погрешность: Для каждого соединения была определена относительная ошибка измерения. Точность измерения была определена методом анализа проб с заведомо известными количествами и стандартов для разных диапазонов калибровочной кривой. Расчетное значение сравнивалось с реальным. Результаты представлены в таблице 7.2 приложения. Стоит отметить, что intraday параметры для все соединений оказались удовлетворяющими стандартам FDA (RSD <15%), interday параметры тоже оказались удовлетворительными, кроме кроме PGF2a-d4, 12-HETE-d8, DHA-d5. 3. Пределы определения: Пределы количественного и качественного определения были подсчитаны согласно рекомендация FDA. Предел качественного (детектирования) определения был определен как 3*стандартную ошибку регрессии/наклон прямой. Результаты представлены в таблице 7.3. Также получены результаты и составлены предварительные таблицы сравнительных количественных характеристик действия низкомолекулярных веществ на переключение между путями метаболизма полиненасыщенных жирных кислот. Проверены вещества: трилостан, росиглитазон, CAY10678, ML355, Zileuton, 2-TEDC, JZL195, Arachidonyl Trifluoromethyl Keton, CAY10590, Pyrrophenone. С помощью библиотеки аналогов дейтерированных по двойным связям изотопологов арахидоновой кислоты получены характеристики активности на уровне ферментов СОХ-2, 15-LOX, 5-LOX с разными изотопологами и показана перспективность направленного переключения между ветвями метаболизма с помощью изотопологов. Результаты оформлены в виде статьи, в журнале Molecules.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".