Разработка принципов молекулярной систематики гуминовых веществНИР

Development of molecular systematics of humic substances

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Разработка принципов молекулярной систематики гуминовых веществ
Результаты этапа: 1. Формулировка теоретических основ концепции молекулярной систематики гуминовых веществ на основе обзора литературы по методам молекулярной систематики Неотъемлемой особенностью строения гуминовых веществ (ГВ) является стохастический характер, обусловленный особенностями их образования в результате естественного отбора устойчивых структур [Орлов, 1990]. Как следствие, к фундаментальным свойствам ГВ относятся нестехиометричность состава, нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов и полидисперсность. Тем самым для них понятие молекулы трансформируется в молекулярный ансамбль, каждый параметр которого описывается распределением. Поэтому к ГВ не применим традиционный способ численного описания строения органических соединений, характеризующий количество атомов в молекуле, число и типы связей между ними [Перминова, 2000]. Для описания молекулярного ансамбля ГВ был предложен подход, основанный на введении понятия «интегральный численный дескриптор», представляющий собой характеристику распределения какого-либо свойства ГВ. В частности были предложены следующие интегральные дескрипторы состава: содержание элементов (% масс) и их атомные соотношения, содержание С и Н в составе структурных групп в процентах от общего С и Н, соответственно, и их отношения, средние молекулярные массы (ММ) и их отношения. Была продемонстрирована успешность использования интегральных численных дескрипторов для решения задачи классификации ГВ по источнику происхождения и фракционному составу [Перминова, 2000]. Однако использованные дескрипторы соответствовали в большинстве случаев таким иерархическим уровням структурной организации органических объектов как элементный или фрагментный, но не молекулярный. Применение методов сверхвысокого разрешения, такого каким является масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (МС ИЦР ПФ) [McIntyre et al 1997], позволило перейти на молекулярный уровень исследования ГВ, позволяющий идентифицировать брутто-формулы входящих в их состав молекул. Следствием этого является возможность использования получаемой методом МС ИЦР ПФ информации для создания молекулярной систематики ГВ. Важным ограничением метода МС ИЦР ПФ является невозможность получения информации о структуре определяемых веществ. В связи для с этим для молекулярной систематики ГВ анализ МС ИЦР ПФ должен быть дополнен каким-либо еще аналитическим методом исследования структуры вещества. Наиболее мощным аналитическим методом для исследования структуры органических соединений является спектроскопия ЯМР. Поэтому комбинация информации, получаемой методами МС ИЦР ПФ и ЯМР, позволит наиболее полно описать молекулярный ансамбль ГВ [Hertkorn et al. 2013]. Для создания молекулярной классификации необходима последующая свертка и анализ получаемой молекулярной информации. В качестве основного подхода к анализу и описанию молекулярной информации мы предлагаем использовать разработанную нами концепцию интегральных дескрипторов. В качестве основных способов классификации предлагается использовать различные методы многомерной классификации. Можно сформулировать следующие теоретические основы концепции молекулярной систематики ГВ: 1) Концептуальный аппарат. Система понятий, изучаемых рамках концепции молекулярной систематики ГВ, включает в себя следующие понятия: – интегральный дескриптора состава ГВ; – молекулярный ансамбль ГВ; – подобие – измерение сходств и отличий независимо от источника (или причины) сходства; – кластеризация – сведение вместе сходных предметов, различая классы объектов, более сходных с любыми другими, чем те объекты, которые не входят в эти классы 2) К исходному закону концепции молекулярной систематики ГВ, т.е. положению теории, взятому без доказательства, относится принцип «источник подобия – общее происхождение». Именно этот принцип лежит в основе филогении. 3) Логика концепции молекулярной систематики ГВ. В качестве условий истинности утверждений будут использованы следующие: – репрезентативность выборки ГВ, используемой для построения молекулярной систематики ГВ. Расчет объема выборки необходимо проводить с учетом следующих величин: мощность исследования; уровень значимости; величина изучаемого эффекта; вариабельность изучаемой величины в группах; – комбинированное использование нескольких методов (как минимум, двух) для получения информации о молекулярном ансамбле ГВ; по крайне мере один метод должен позволять информацию о структуре молекул, входящих в молекулярный ансамбль ГВ; – использование адекватных алгоритмов для получения дескрипторов молекулярного ансамбля ГВ; предложенные алгоритмы должны позволять получать дескрипторы, позволяющие решать задачи классификационного анализа по априорным признакам («происхождение», «фракционный состав» и т.п.) – принципы оценивания сходства-различия ГВ должны быть основаны на выявлении повторяющихся (одинаковых для всех) и уникальных компонентов (маркеров) в составе молекулярного ансамбля ГВ и их сравнительной структурно-функциональной характеристике. 2. Формирование базы данных образцов ГВ из коллекции хорошо охарактеризованных ГВ для их последующего анализа методом МСИЦР ПФ В рамках изложенной выше концепции была сформирована выборка, состоящая из 30 образцов ГВ, включая угольные (6), торфяные (6), водные (6), почвенные (4), арктических рек и ручьев (5) и вечномерзлых пород (3). Далее она была дополнена ГВ инфильтрационных почвенных вод (10 образцов), ФК и ГК, выделенных из 2х кернов вечномерзлотной почвы (по 2 образца). 3. Разработка методик выделения ГВ из почв с применением твердофазных картриджей для получения высокоочищенных препаратов, удовлетворяющих требованиям, предъявляемым к объектам анализа методами масс спектрометрии сверхвысокого разрешения. Результаты анализа методом МС ИЦР ПФ зависят в значительной мере от процедуры пробоподготовки. Например, при электрораспылении плохо очищенных от хлорид-ионов гуминовых препаратов образуются аддукты (M+Cl)-, которые ухудшают качество масс-спектров [1]. Несмотря на низкое процентное содержание, жирные кислоты и липиды подавляют ионизацию остальных даже низкомолекулярных компонентов в силу высокой эффективности ионизации [2]. Поэтому необходима разработка процедуры эффективной и количественной очистки образцов. Для этих целей в рамках данного проекта был выбран метод твердофазной экстракции ГВ на картриджах PPL. Преимущество этого метода заключается в элюировании органического вещества с сорбента метанолом, что позволяет проводить анализ МСИЦР ПФ получаемого раствора. Более того, ранее нами было показано, что применение картриджей PPL приводит к выделению не менее 70% органического углерода. Данная методика была впервые применена для выделения гиматомелановых кислот угля (CHM-Pow, CHM-Irk, CHM-Gl), торфа (PHM-TTL, PHM-SK3), органического вещества инфильтрационных почвенных вод (6 образцов) и фульвокислот (4 образца), которые вошли в общую выборку. Разработанная методика была применена для выделение 10 образцов ГВ (ГК и ФК) из двух дерново-подзолистых, одной серой лесной почв и двух черноземов. 4. Анализ образцов гуминовых веществ из коллекции творческого коллектива методом МС ИЦР ПФ Для углубленной характеристики состава выделенных препаратов ГВ необходимо привлечение метода высокого разрешения, способного дать информацию об их молекулярном составе. МС ИЦР ПФ характеризуется сверхвысоким разрешением, которое позволяет идентифицировать конкретные формулы в сложной многокомпонентной системе[3–5]. В тоже время мягкий метод ионизации электрораспылением позволяет избежать фрагментации, в результате чего полученные спектры содержат только молекулярные ионы. За первый год выполнения проекта были исследованы 30 образцов ГВ веществ различной природы. Типичный масс-спектр ГВ представлен на Рис. 1. Рис. 1. Типичный масс-спектр МС ИЦР ПФ гуминовых веществ с выделенной областью с номинальным значением m/z=411. Основное количество пиков масс-спектров ИЦР ПФ гуминовых веществ лежит в области 200-700 m/z с максимумом интенсивности в районе 450 m/z. Высокое разрешение метода позволяет различить на одном номинальном значении m/z множество ионов с точностью определения масс до 5 знака после запятой. Спектры ГВ в основном состоят из однозарядных ионов, что согласуется с литературными данными [6]. Список образцов и результаты анализа масс-спектров ИЦР ПФ представлены в Табл. 2.2. Таблица 2.2. Список препаратов и относительный вклад различных CсHhOoNnSs подсчитанных формул в суммарную интенсивность масс-спектров ИЦР ПФ. Шифр Описание CHO, %I CHON, %I CHOS, %I CHONS, %I Гуминовые вещества углей CHA-Pow ГК бурого угля 69 27 3 1 CHA-Gl ГК лигнита 45 46 3 6 CHA-SH ГК бурого угля 52 43 3 2 CHM-Pow ГМК бурого угля 81 15 3 1 CHM-Irk ГМК бурого угля 77 18 4 1 CHM-Gl ГМК лигнита 63 34 1 2 Гуминовые вещества торфов PHA-T7 ГК верхового торфа 92 3 4 1 PHA-TTL ГК низинного торфа 84 6 4 6 PHM-Sk3 ГМК торфа 88 1 4 7 PHM-TTL ГМК низинного торфа 84 6 4 6 PFA-T7 ФК верхового торфа 96 2 1 1 PFA-TTL ФК низинного торфа 90 7 2 1 Гуминовые вещества почв SHA-Ctk ГК чернозема 61 25 8 6 SHA-Pw ГК дерново-подзолистой почвы 66 16 9 9 SFA-Ctk ФК чернозема 85 10 4 1 SFA-Pw ФК дерново-подзолистой почвы 91 6 2 1 Гуминовые вещества природных вод SRHA ГК р. Суванни 91 4 1 4 SRFA ФК р. Суванни 95 3 1 1 SRDOM РОВ р. Суванни 95 3 1 1 AHF-SSX РОВ озера Сион, сорбент XAD-8 82 6 11 1 AHF-SSP РОВ озера Сион, сорбент PPL 94 3 3 0 RHF-SSP РОВ р. Паниковка, сорбент PPL 84 3 13 0 Гуминовые вещества инфильтрационных почвенных вод Eln-7 Инфильтрационные воды еловых кустарничково-зеленомошных почв 90 4 5 1 Eln-8 89 6 4 1 Eln-9 74 10 14 2 Eln-10 86 5 6 3 Eln-11 74 9 15 2 Eln-13 65 10 23 2 HA-15 ГК вечномерзлой почвы, глубина -15 м 54 24 13 9 HA-3 ГК вечномерзлой почвы, глубина - 3 м 36 25 23 16 Данные, полученные методом МС ИЦР ПФ, свидетельствуют о существенном различии образцов. Образцы природных вод и торфа практически полностью состоят из CHO соединений. Почвенные образцы содержат значительное количество азотсодержащих компонентов. В то же время, в молекулярный состав инфильтрационных вод еловых почв существенный вклад вносят серосодержащие CHOS соединения. Наибольшее содержание CHON компонентов наблюдалось для угольных образцов. Выбиваются из полученного списка ГК, выделенные из кернов вечномерзлых почв. Распределение различных молекулярных составов указывает на гораздо меньший вклад СНО молекул (54 и 36%) по сравнению с другими ГК, в частности дерновоподзолистых и черноземных почв SHA-Pw (66%) и SHA-Ctk (61%). Для двух типов почв наблюдалось высокое содержание CHON соединений, однако вечномерзлые почвы отличались большим вкладом СHOS молекул: 13 и 23% по сравнению с 9% для ГК среднеширотных почв. Это может объясняться консервацией органического вещества в условиях Арктики. Для количественной оценки различий между образцами ГК чернозема и почв вечной мерзлоты, были посчитаны индексы сходства компонентного состава (SI), показанные в Табл. 3. Полученные значения свидетельствуют о значительном сходстве ГК, выделенных из кернов глубиной 3 и 15 метров. Более того, оба этих образца отличается от ГК чернозема, что подтверждает низкую степень биоразложения. Полученные результаты были представлены на конференции Ломоносов-2016, МГУ, Москва. Табл. 3. Индексы сходства (SI) ГК, выделенных из чернозема и кернов вечной мерзлоты с глубины 3 и 15 м, по результатам МС ИЦР ПФ HA-3:HA-15 HA-3: SHA-Ctk HA-15:SHA-Ctk 0.74 0.40 0.35 Далее из полученных брутто-формул расчитывали атомные отношения O/C и H/C для построения диаграмм Ван Кревелена, которые используются для визуализации данных МСИЦР ПФ гуминовых веществ [7]. Основная интерпретация диаграмм Ван Кревелена заключается в разбиении всего поля молекул на области, которые соответствуют основным предшественникам ГВ, таким как лигнины, таннины, терпеноиды, углеводы и т.п. [8]. Диаграммы Ван Кревелена для образцов CHA-Pow, PHA-T7, SRHA и PFA-T7 представлены на Рис. 2.3. Так как для ГВ вклад СНО-молекул подавляющий, то на диаграммы нанесены только они. В качестве третьего измерения используется относительная интенсивность соединений. Рис. 3.3. Диаграммы Ван Кревелена для образцов A) CHA-Pow, Б) PHA-T7, В) PFA-T7, Г) SRHA с относительной интенсивностью в качестве третьего измерения Диаграммы показывают отличия ГВ различной природы. Основными компонентами ГК угля (CHA-Pow) являются соединения в области конденсированных таннинов, в случае ГК торфа (PHA-T7) – лигнин и углеводы (Рис. 33А,Б соответственно). ФК торфа и водные ГК близки по молекулярному составу – основными компонентами являются соединения в области гидролизуемых таннинов, что объясняет их большую гидрофильность. Однако сравнение диаграмм для этих образцов показывает больший вклад углеводов и конденсированной фракции в состав PFA-T7 по сравнению с SRHA. Тем не менее, все рассмотренные ГВ содержат консервативные компоненты в области O/C=0.5 и H/C = 1- переходную область между окисленными и конденсированными соединениями. Для выявления взаимосвязи между заселенностью областей различных прекурсоров ГВ, выделяемых на диаграмме Ван Кревелена для всех 30 образцов, был проведен корреляционный анализ. Результаты представлены в Табл. 2.2. Табл. 2.2. Рассчитанный коэффициент корреляции между различными классами компонентов, составляющих ГВ по данным МС ИЦР ПФ Жиры Пептиды Лигнины Конд. Таннины Гидр. Таннины Углеводы Жиры 1.00 0.25 -0.59 0.43 -0.50 -0.27 Пептиды 0.25 1.00 0.31 -0.47 -0.42 0.53 Лигнины -0.59 0.31 1.00 -0.79 0.16 0.42 Конд. Таннины 0.43 -0.47 -0.79 1.00 -0.48 -0.82 Гидр. Таннины -0.50 -0.42 0.16 -0.48 1.00 0.39 Углеводы -0.27 0.53 0.42 -0.82 0.39 1.00 Корреляционный анализ показал в целом слабую взаимосвязь отдельных компонентов между собой. Так, для гидролизуемых и конденсированных таннинов коэффициент корреляции R= 0.48. Тем не менее для пары конденсированные таннины-углеводы R= -0.82, что указывают на существенную корреляцию между двумя прекурсорами. Действительно, углеводы и таннины связаны процессом дегидратации или конденсации[7], что обуславливает наблюдаемую отрицательную корреляцию. Недостатком разбиения диаграмм Ван Кревелена на области, соответствующие основным прекурсорам ГВ, заключается в размытых границах [8]. Следовательно, при таком подходе отсутствует возможность создания численных дескрипторов для количественного сравнения большого набора ГВ. Для преодоления данной проблемы, в рамках реализации проекта было предложено проводить разбиение диаграммы на фиксированное количество диапазонов с шагом 0.25 по оси O/C и 0.4 по шкале H/C. В результате были получены 20 прямоугольных областей, характеризующиеся разной заселенностью. Полученным диапазонам можно приписать возможные модельные структуры, как это показано на Рис. 2.2. – для Пункта 3. 5. Анализ образцов гуминовых веществ из коллекции творческого коллектива методом спектроскопии ЯМР (Константинов А.И.) Типичные спектры ЯМР 13С проанализированных ГВ приведены на рис. 1. В Таблице 1 представлены результаты структурно-группового анализа ГВ, полученные интегрированием спектров ЯМР. ГК угля характеризуются высоким содержанием ароматического углерода (медиана 51,5 %) при относительно низком содержании алифатических структур. Для ГВ торфа, напротив, характерны значительные количества неразложившихся полисахаридных структур, чему отвечает относительно высокая (медиана 27,5 %) суммарная доля CH2O, CHO и OCO. По содержанию алифатических групп ФК почв сопоставимы с ГВ торфа, отличаясь меньшей долей ароматических структур (медианные значения 26 % и 33 % соответственно). Для ГВ высокоцветных вод поверхностных пресноводных водоёмов характерен структурно-групповой состав, близкий к ФК почв и торфов, что соответствует происхождению этих ГВ. В то же время ГВ стоков таяния вечной мерзлоты (на примере образца ISDY – см. Табл. 1), наименее подвергшихся биоразложению, характеризуются наиболее высокой долей углерода алкильных звеньев (28,5 %). Широко распространённый метод спектроскопии 13С ЯМР твердофазных образцов ГВ, наряду с очевидными преимуществами – бóльшими по сравнению с растворами концентрациями образцов и меньшим временем релаксации, – имеет существенные недостатки, основной из которых – значительное недоопределение атомов углерода ароматических структур ГВ, что делает получение количественных спектров ГВ в твёрдой фазе очень сложной задачей [Preston, 1996]. По указанной причине для получения количественной структурной информации применяется жидкофазный вариант спектроскопии ЯМР 13С [Hertkorn et al., 2002; Hertkorn & Kettrup, 2005]. Спектроскопия ЯМР на ядрах 13С в растворе позволяет описать распределение углерода в молекулах ГВ по структурным фрагментам, отличающимся по химическим сдвигам составляющих их ядер углерода. 6. Разработка подхода к генерации численных дескрипторов на основе данных МС ИЦР ПФ Для количественного представления информации о молекулярном составе ГВ и сопоставления различных ГВ по особенностям их молекулярного строения нами был разработан подход, состоящий в разделении области покрытия молекулярными пиками двумерной диаграммы ван Кревелена, полученной по результатам масс-спектрометрического анализа ГВ, на равные прямоугольные ячейки с последующим расчётом плотности распределения молекулярных компонентов в химическом пространстве диаграммы. Полученные количественные значения были предложены в качестве численных дескрипторов молекулярного строения, их набор является уникальным для каждого образца ГВ. Данный метод использован впервые и является оригинальной разработкой авторского коллектива. (Сопоставление полученных результатов с мировым уровнем) Применение масс-спектрометрии ИЦР с преобразованием Фурье (МС ИЦР ПФ) для анализа ГВ позволяет получить несколько тысяч индивидуальных молекулярных пиков для каждого образца [Hertkorn et al., 2007]. Для того чтобы преобразовать полученные точные значения молекулярных масс в молекулярные формулы, для каждого пика решается линейное диофантово уравнение для определённой молекулярной массы и определённого набора химических элементов – таких как C, H, N, O, S [Stenson et al., 2003; Koch et al., 2007]. Полученный набор брутто-формул обычно наглядно представляют в виде точек, нанесённых на двух- или (реже) трёх-мерную диаграмму ван Кревелена в координатах атомных отношений [Kim et al., 2003; Wu et al., 2004]. Чтобы упростить процедуру сравнения особенностей молекулярного строения различных ГВ, строят «синтетические» диаграммы ван Кревелена, используя известные структурные данные о молекулярных предшественниках ГВ – таких как лигнины, пептиды, углеводороды, липиды и др. [Kujawinski & Behn, 2006; Hockaday et al., 2009]. Таким образом составляется карта химического пространства ГВ, на которой определённым областям ставятся в соответствие определённые преобладающие молекулярные структуры. Этот подход используется для визуализации различий между анализируемыми образцами [Chen et al., 2011] и, с применением кластерного анализа, позволяет выделить как уникальные, так и общие молекулярные пики для различных ГВ [Tfaily et al., 2012]. При этом существующие подходы остаются качественными и не позволяют использовать количественные характеристики для сравнения различных ГВ по их молекулярному строению. Нами предложен простой метод свёртки информации и расчёта количественных дескрипторов молекулярного строения ГВ. 7. Демонстрация эффективности разработанных методических подходов на примере контрольной выборки хорошо охарактеризованных образцов с целью перехода на массовый анализ проб и интерпретацию результатов в контексте задач проекта Рассчитанные значения дескрипторов молекулярного состава для четырёх ГВ наглядно представлены в виде гистограмм на рис. 3. Для водных ГВ, несмотря на похожее распределение плотности на диаграмме ван Кревелена, наблюдаются определённые различия в значениях молекулярных дескрипторов между ГК (SRHA) и ФК (SRFA). Так, для образца SRHA были получены более высокие значения дескрипторов для области диаграммы ван Кревелена с Н/С < 1 (ячейки № 6, 7, 11), что свидетельствует о более высоком содержании ненасыщенных структур в водных ГК по сравнению с ФК. Образец SRFA, напротив, демонстрирует более высокие значения дескрипторов для области с Н/С > 1 (ячейки № 8, 9, 13, 14), что говорит о снижении доли ароматических структур в составе данного образца. Существенные различия видны при сравнении по молекулярному составу более алифатических ГК торфа (PHA) по сравнению с ФК (PFA). Обращает на себя внимание подобие молекулярного состава ФК торфа и ГК вод (за исключением гораздо более высокого вклада полисахаридных структур в PFA). Метод расчёта численных дескрипторов с учётом интенсивностей молекулярных пиков показал те же закономерности, что и более простой метод расчёта без учёта интенсивностей, поэтому в дальнейших исследованиях было предложено использовать последний (за исключением специальных задач).
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Разработка принципов молекулярной систематики гуминовых веществ
Результаты этапа: 1) Завершен этап формирования выборки почвенных ГВ. Выделены 18 образцов гуминовых веществ из многолетнемерзлых пород, представленные фракциями растворённого органического вещества (РОВ), фульвокислот (ФК) и гуминовых кислот (ГК). Керны многолетнемерзлых пород были отобраны Др. А. Холодовым (Университет Аляски, Фэрбанкс, США) в регионе поселка Черский (68.744825° с.ш., 161.383834° в.д.). Выделенные образцы ГВ многолетнемерзлых пород с шифрами и глубиной отбора кернов представлены в Таблице 1. Выборка почвенных гуминовых веществ была расширена за счёт введения двух препаратов – ГК и ФК типичного чернозёма, с 1964 г. находящегося под уникальным опытом – бессменным чёрным парованием (HA-Ctf08 и FA-Ctf08). Препараты выделены из имеющихся в распоряжении творческого коллектива образцов, отобранных на длительном опыте Почвенного института им. В.В. Докучаева на территории Курского НИИ АПП в варианте “Бессменный чистый пар”, 51.62125° с.ш., 36.26222° в.д. Для оценки применимости метода масс-спектрометрии высокого разрешения для сравнения на молекулярном уровне гуминовых веществ почв зонального ряда были выделены 5 образцов РОВ из дерново-подзолистой, серой лесной, чернозёма и каштановой почв. В целях расширения выборки ГВ для проведения классификационного анализа из имеющихся в распоряжении творческого коллектива почвенных агрегатов чернозёма и дерново-подзолистой почвы были выделены дополнительно 10 препаратов ГК. Их описание приведено в Таблице 2. Тем самым задача по формированию представительной выборки ГВ решена полностью. 2) Массовый анализ выборки гуминовых веществ методом МСИЦР ПФ включал в себя несколько задач: а) анализ РОВ и ГК, выделенных с использованием водных вытяжек и щелочи, соответственно, из почв различной зональности, для выявления генетических признаков, присущих молекулярному составу органического вещества почв различной зональности; б) анализ РОВ, ФК и ГК, выделенных из керна многолетнемерзлых пород, для выявления «молекулярной эволюции» почвенного органического вещества; в) анализ фракций гуминовых веществ, полученных методом градиентной сорбции по принципу различной кислотности компонентов на твердофазных картриджах для изучения молекулярной гетерогенности ГВ; г) применение комбинированного метода дейтерометилирования и МСИЦР ПФ для определения карбоксильной кислотности ГВ; д) решение методических задач, связанных с необходимостью привлечения данных, полученных на других масс спектрометрах, для последующего классификационного анализа. а) Для сравнения молекулярного состава РОВ, выделенного из почв различной зональности, был выполнен анализ четырёх образцов, выделенных из почв зонального ряда: дерново-подзолистые, серые лесные, чернозем типичный и каштановые. Средние значения молекулярных характеристик, полученных из масс-спектров ИЦР ПФ для выделенных РОВ, приведены в Таблице 3. Самый большой вклад (около 70%) в состав исследованных РОВ вносят молекулы элементного состава CHO, что типично для всех ГВ. При этом он достигает максимальных значений для дерново-подзолистых почв (74%), которые характеризуются высоким содержанием углеводных фрагментов, а минимальных значений – 64% – для чернозема, в который вносят наиболее существенный вклад CHON составы. Это согласуется с многочисленными литературными данными об обогащенности ГВ чернозема азотом в составе азотсодержащих геероциклических структур. Довольно высокий вклад CHON-идентификаций, близкий к наблюдаемым нами ранее для ГК почв, наблюдается и для всех исследованных РОВ. Среднечисленная молекулярная масса закономерно уменьшается от чернозёма к каштановым почвам. Противоположный тренд наблюдается для среднечисленных атомных отношений Н/С, который можно рассматривать как параметр ненасыщенности и, следовательно, как характеристику степени гумификации. От чернозёма к каштановым почвам этот показатель растёт. Таким образом, рост ненасыщенности приводит к росту молекулярной массы, что указывает на процессы поликонденсации при формировании почвенных РОВ. Диаграммы ван Кревелена, полученные для наиболее различных по молекулярному составу почвенных РОВ, представлены на Рис. 1. Распределение формул позволяет качественно оценить тип соединений, входящих в их состав. Во всех образцах отсутствуют пептиды и практически нет углеводных компонентов. Все CHON компоненты можно отнести к гетероциклическим соединениям, получаемым при деградации белков и пептидов. Основными компонентами РОВ являются лигнины и гидролизуемые таннины (Рис. 1). Основным отличием менее гумифицированных РОВ, например, каштановых почв (Рис. 1Б) является присутствие насыщенных соединений – липидов, что свидетельствует о меньшей трансформации органического вещества в составе данной почвы. Таким образом, было показано, что МС ИЦР ПФ позволяет выявить генетические признаки гуминовых веществ почв различного генезиса: позволяет оценить степень гумификации и предложить реакции, которым подвергались исходные биополимеры. б) Типичные диаграммы ван Кревелена, построенные по данным МСИЦР ПФ для ГК и ФК, выделенных из многолетнемерзлых пород, в сравнении с ГК и ФК дерново-подзолистых почв умеренных широт представлены на Рис. 2. Отличительной особенностью ГК почв из района вечной мерзлоты от ГК почв умеренных широт является значительный вклад насыщенных CHON молекул, которые можно отнести к пептидам. Данные соединения практически отсутствуют в РОВ и ГК умеренных широт. ФК почв, напротив, представлены, в основном, окисленными конденсированными соединениями. Основным отличием ФК многолетнемерзлых пород от почв умеренных широт является гораздо меньший вклад лигнинов. Полученные данные хорошо согласуются с различием в условиях формирования органического вещества вечной мерзлоты [Wickland and Neff, 2008]. в) Исследование фракций ГВ, полученных методом градиентной сорбции по принципу различной кислотности компонентов на картриджах PPL, проводили на примере двух образцов ГВ различной природы: угольных гиматомелановых кислот (HMA) и ГК р. Суванни (SRHA). Был выявлен один и тот же постепенный сдвиг в преобладающих молекулярных компонентах фракций обоих исходных ГВ, которые зависели от рН экстракции (Рис. 3). В обеих фракциях pH7 преобладали интактные лигнин-подобные молекулы («нуль-карбоксилы»), во фракциях рН5 и pH3 преобладали карбоксилированные лигнинные молекулы, во фракциях pH2 выявлены кетокислоты. Наблюдаемый сдвиг соответствовал направлению окислительной гумификации лигнинов. Для оценки значения индекса гумификации мы получили спектры флуоресценции и обнаружили красное смещение флуоресценции наиболее окисленных фракций. Для установления взаимосвязи между структурой и степенью гумификации была проведена сегментация диаграмм ван Кревелена (см. п. 5) для оценки корреляций между субпопуляциями структурно разных видов внутри ГВ и их флуоресцентными свойствами. Статистический анализ показал, что высокоароматические и кислотные соединения с pKa <2,5 (Рис. 3) в наибольшей степени связаны с индексом гумификации, вызывая красное смещение в спектрах флуоресценции. Исходя из расположения на диаграмме ван Кревелена, эти молекулы можно отнести к поликарбоновым кислотам или кетокислотам. По полученным данным была подготовлена статья для журнала «Environmental Science & Technology». г) В рамках проекта был применён комбинированный метод дейтерометилирования и МСИЦР ПФ для анализа ГВ на примере гиматомелановых кислот торфа (PHM), угля (CHM) и ФК р. Суванни (SRFA). Данный метод позволил определить количество карбоксильных групп в индивидуальных компонентах гуминовых веществ. Для дейтерометилированных образцов ГВ были получены данные МСИЦР ПФ. Благодаря сверхвысокому разрешению было возможно извлечь серии дейтерометилирования для 500 наиболее интенсивных пиков, которые соответствовали количеству карбоксильных групп. Далее из полученных данных рассчитывали карбоксильную кислотность ГВ. Для оценки адекватности применения данного подхода, данные по содержанию карбоксильных групп в ГВ были также получены методом спектроскопии 1Н ЯМР в апротонном растворителе – ДМСО-d6. Спектры 1Н ЯМР представлены на Рисунке 4. Благодаря тщательной осушке образцов ГВ и использованию безводного растворителя, мы наблюдали значительную спектральную плотность в области 11.5–16 м.д., соответствующей карбоксильным протонам, для всех препаратов. Максимальное значение интеграла карбоксильных протонов составляло 13% и наблюдалось для SRFA, для CHM и PHM значения были существенно ниже – 9% и 4%, соответственно (Рисунок 4Г). Из полученных значений интегралов и данных элементного анализа рассчитывали карбоксильную кислотность образца и сравнивали с данными, полученными методом МСИЦР ПФ дейтерометилированных ГВ. Результаты расчётов из данных обоих методов показали хорошее соответствие (Таблица 4) и, следовательно, применимость метода дейтерометилирования и МСИЦР ПФ для определения карбоксильной кислотности ГВ. По полученным данным была опубликована статья в журнале «Analytical and Bioanalytical Chemistry». д) Для возможности увеличения выборки данных о молекулярном составе гуминовых веществ почв, полученных методом МСИЦР ПФ, был выполнен блок работ по сопоставлению данных, полученных для одного и того же стандартного образца – ФК реки Суванни (SRFA – стандартный образец Международного гуминового общества – IHSS) на разных масс-спектрометрах. Расширение выборки представляется весьма желательным для повышения статистической достоверности классификационного анализа по данным МСИЦР ПФ. Для исследования были использованы восемь масс-листов, предоставленных шестью лабораториями. Из предоставленных масс-листов рассчитывали молекулярные формулы с использованием ПО «Transhumus», а затем строили сводную диаграмму ван Кревелена (Рис. 5). При этом молекулярные пики обозначали цветами в зависимости от того, в каком количестве проб данные молекулярные пики были обнаружены. Написано программное обеспечение, позволяющее осуществлять описанные выше визуализации. Подготовлены интерактивные визуализации в формате html, пригодные для просмотра в современных браузерах. Более наглядно полученные результаты представлены на Рис. 6, где видно, что пул общих идентификаций представлен, в основном, CHO-формулами, тогда как пул уникальных идентификаций содержит, преимущественно, формулы с гетероатомами – N и S. Это указывает на гораздо менее устойчивые решения Диофантова уравнения при введении гетероатомов. По-видимому, нужна существенная доработка существующих алгоритмов приписывания формул пикам с заданной молекулярной массой перед тем, как данные других лабораторий могут быть включены в общую выборку. В противном случае, очень вероятен риск получения ошибочных классификаций. Таким образом, задача массового анализа выборки гуминовых веществ методом МСИЦР ПФ была полностью решена. 3) Массовый анализ выборки почвенных гуминовых веществ методом спектроскопии ЯМР включал следующие задачи: а) анализ методом 13С ЯМР ГВ почв зонального ряда; б) анализ методами 1Н и 13С ЯМР ГК почвенных агрегатов. а) Спектры ЯМР 13С проанализированных ГВ чернозёма, относящихся к выборке ГВ почв зонального ряда, приведены на Рисунке 7. Результаты структурно-группового анализа ГВ, полученные интегрированием спектров ЯМР 13С, представлены в Таблице 5 и наглядно изображены на гистограмме на Рисунке 8. Для гуминовых кислот (ГК) почв характерно наибольшее содержание не замещённого гетероатомами ароматического углерода (Car), медианное значение составляет 35 %. Для фульвокислот (ФК) почв данный параметр значимо ниже – 19,5 % в медиане. По содержанию фенольного углерода (CarO) ГК почв также значимо превосходят ФК: медианы на уровне 9,5 % и 7 % для ГК и ФК, соответственно, при минимальном разбросе данных (Рисунок 8). Параметр Car также показал наибольшие различия между ГК почв зонального ряда: от 45,6 % для образца ГК чернозёма под севооборотом до 26,3 % для дерново-подзолистой почвы. ФК почв характеризовались большей долей структурных групп СНО, соответствующих полисахаридам: медиана 19 % по сравнению с 8,5 % для ГК. Этот же параметр продемонстрировал наибольшие различия между ФК почв зонального ряда: от 23,5 % для образца ФК чернозёма под севооборотом до 11,2 % для дерново-подзолистой почвы. б) В Таблице 6 представлены данные структурно-группового состава ГК почвенных агрегатов чернозёма и дерново-подзолистой почвы по данным 13С ЯМР, в Таблице 7 – по данным 1Н ЯМР (ПМР). На Рисунке 9 приведены типичные спектры 1Н ЯМР ГК почвенных агрегатов чернозёма и дерново-подзолистой почвы. Интенсивный сигнал протонов воды при 4,5–5,5 м.д. не искажает значения спектральных интегралов для водорода алкильных цепей в альфа- (a-CHn) и более дальней (CHn) позиции по отношению к углероду ароматических и карбоксильных групп. Значения данных интегралов, характеризующих алкильные структуры ГВ, наглядно представлены на Рисунке 10. Как видно из представленных данных, для ГК агрегатов дерново-подзолистых почв характерны большие значения CHn (30–37 %), по сравнению с ГК агрегатов чернозёма (25–27 %). Таким образом, задачу массового анализа почвенных ГВ методом спектроскопии ЯМР можно считать выполненной. 4) Количественные данные, полученные методом ЯМР, показывают возможность их использования в качестве численных дескрипторов ГВ различного фракционного состава и типа почвы. В качестве дополнительного структурного дескриптора, получаемого из данных 1Н ЯМР, было предложено отношение CHn/a-CHn, характеризующее длину не претерпевших биодеструкцию алкильных цепей в структуре ГВ. По полученным данным была подготовлена статья для журнала «Environmental Science: Processes & Impacts». Результаты исследования ГВ методом количественной спектроскопии ЯМР показывают возможность использования полученных данным методом численных дескрипторов для разделения и классификации почвенных ГВ как по фракционному составу, так и по типу почвы. 5) Разработанный на предыдущем этапе исследования метод численного описания данных масс-спектрометрии сверхвысокого разрешения ГВ был применён к широкой выборке данных МСИЦР ПФ. С этой целью имеющиеся в распоряжении творческого коллектива масс-листы 37 препаратов ГВ природных вод, почв, торфов, угля и органического вещества мумиё были преобразованы в диаграммы ван Кревелена в координатах О/С vs Н/С. Каждая из построенных диаграмм была разделена на 20 прямоугольных ячеек, как это изображено на Рисунках 3 и 11. Для каждой диаграммы был получен уникальный набор из 20 численных дескрипторов. Задача по обработке пула данных МСИЦР ПФ методом разбиения пространства диаграмм ван Кревелена на ячейки и расчета плотности заселения указанных областей для ГВ из различных источников была полностью решена. 6) В рамках поиска новых высокотехнологичных способов свёртки информации по молекулярному и групповому составу ГВ, был предпринят статистический анализ данных МСИЦР ПФ методом главных компонент. Анализ осуществляли на примере выборки данных для ГВ многолетнемерзлых пород (Таблица 1). Метод главных компонент был применён по всем молекулярным формулам, идентифицированным в молекулярном составе образцов. Полученный график для трёх главных компонент представлен на Рисунке 12. Для сравнения в выборку были добавлены ГК чернозёма (SHA-CtK) и дерново-подзолистой почвы (SHA-Pw). Анализ трёх первых главных компонент показывает, что все образцы разбиваются на три группы согласно фракционному составу и источнику происхождения (Таблица 1): первую группу образуют FA1 (РОВ), вторую – FA2 (ФК), третью – HA и SHA (ГК). HA и SHA образуют одну группу благодаря тому, что для них характерен высокий вклад липидов. ФК отличаются от ГК полным отсутствием молекул с O/C<0.4. Метод главных компонент также позволяет отличить органическое вещество поровой воды (РОВ) от ФК, несмотря на визуально близкие масс-спектры и диаграммы ван Кревелена. Полученные данные были представлены в виде доклада на международной конференции (4-ая международная конференция СНГ МГО «От молекулярного анализа гуминовых веществ – к природоподобным технологиям», Москва, Россия). 7) По результатам исследований были опубликованы три статьи в журналах Web of Science и ещё две статьи направлены в редакции журналов Web of Science. Были представлены тезисы на трёх международных конференциях.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Разработка принципов молекулярной систематики гуминовых веществ
Результаты этапа: Гуминовые вещества выполняют целый ряд важных биосферных функций, являются ключевым фактором плодородия почв и представляют собой важнейший класс природных биологически активных соединений. Уникальной особенностью гуминовых веществ является экстремальная структурная гетерогенность, которая определяет их устойчивость к биоразложению и уникальные оптические свойства. Изменение молекулярного разнообразия ГВ, выражающееся в увеличении или снижении доли тех или иных индивидуальных компонентов в составе молекулярного ансамбля, может служить индикаторами благоприятных или негативных экосистемных процессов. Наличие в составе ГВ тех или иных классов соединений может свидетельствовать об их биологической активности, что важно для практического применения ГВ. В то же время принципы молекулярной систематики гуминовых веществ, которые могут быть положены как в основу классификационного анализа, так и использованы для построения прогностических моделей «структура-свойство» на момент выполнения проекта были разработаны слабо. В связи с изложенным цель данного проекта - разработка научных основ молекулярной систематики гуминовых веществ и прогностического моделирования их свойств. В качестве основных методов, которые использованы для достижения указанной цели, являются два современных метода высокого разрешения - спектроскопия ЯМР и масс спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (МСИЦР ПФ). Использование МСИЦР ПФ определяет существенную новизну выполненных исследований. Это связано с ограниченным доступом к данному дорогостоящему методу, обладающему уникальной сверхвысокой разрешающей способностью, необходимой для различения индивидуальных компонентов в составе молекулярного ансамбля ГВ. Применение метода МСИЦР ПФ для анализа широкой выборки образцов ГВ, систематизированной по источникам происхождения – угли, торфа, почвы (и видам хозяйствования – в случае почв) было выполнено впервые. Тем самым впервые была получена уникальную база данных по составу молекулярных компонентов, образующих химическое пространство ГВ терригенного происхождения. Важными результатами проекта стало картирование химического пространства, занимаемого терригенными ГВ на диаграмме Ван Кревелена. В частности, впервые была показана инвариантность (не зависимость от происхождения) положения карбоксилсодержащих компонентов на диаграмме Ван-Кревелена для ГВ вод, торфа и угля. Показано, что данные карбоксилсодержащие компоненты соответствуют продуктам окислительной эволюции молекул лигнина, позволяя построить траекторию гумификации на диаграмме Ван Кревелена. Предложен так же новый структурный маркер гумификации, представляющий собой отношение количества протонов в составе длинноцепочечных алифатических фрагментов к короткоцепочечным. Разработаны и валидированы эффективные алгоритмы свертки информации для получения численных дескрипторов, которые могут быть использованы для решения задач классификационного анализа и построения моделей «строение-свойство». Убедительно продемонстрирована применимость предложенных дескрипторов для решения задач классификационного анализа по априорным признакам («происхождение», «фракционный состав», «тип хозяйственного использования (для почвенных ГВ)», и т.д.). Дальнейшим развитием данного направления может быть построение филогенетического дерева гуминовых веществ, показывающего взаимосвязи между объектами различного происхождения. Получены и валидированы прогностических моделей «строение – свойства» для прогноза оптических свойств ГВ и их биологической активности. Полученные результаты убедительно показывают, что свойства гуминовых веществ могут быть предсказаны на основе их структуры, при этом основным условием реализации такой возможности является использование дескрипторов, получаемых на основе данных методом высокого разрешения, адекватных сложности строения ГВ. Это открывает новые возможности для получения препаратов ГВ с заданными свойствами.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".