ИСТИНА

Анализ имеющихся к настоящему времени данных свидетельствует о том, что мезенхимные стромальные клетки (МСК) принимают участие в регуляции практически всех физиологических процессов, происходящих при репарации и регенерации ткани. При этом основная роль в реализации их регуляторных эффектов отводится биологически активным компонентам секретома МСК, включая пул некодирующих РНК (нкРНК), которые будучи перенесенными в составе внеклеточных везикул в другие клетки, способны перепрограммировать их в направлении стимуляции регенеративных процессов. Это делает МСК одним из наиболее перспективных инструментов регенеративной медицины. Однако многими исследователями показано, что на различные сигналы от поврежденных тканей МСК реагируют специфическими изменениями своего секретома, и при определенном уровне таких воздействий происходит ухудшение способности МСК поддерживать регенеративные процессы, что часто наблюдается в тканях при старении и развитии многих заболеваний. Остается открытым вопрос о механизмах таких изменений функциональной активности МСК и участия в этих процессах нкРНК, секретируемых МСК. Предлагаемый междисциплинарный проект сочетает в себе преимущества двух методологических научных подходов к решению этой проблемы - опирающегося на ишгипотезу (hypothesis-driven) о способности МСК отвечать на сигналы, ассоциированные с повреждением ткани, путем долговременного закрепления изменений паттерна регуляторных нкРНК, в том числе секретируемых клетками в составе внеклеточных везикул, и поискового, основанного на биоинформатическом анализе накопленных массивов данных изменений транскриптома МСК под воздействием повреждающих сигналов. Планируется установить механизмы “запоминания” МСК ответов на воздействия различных по природе сигналов, возникающих при повреждении тканей: острой гипоксии с последующей реоксигенацией, медиаторов острой фазы воспаления и хронического воспаления, а также профибротического внеклеточного матрикса. Будет проверена гипотеза об ускоренном старении МСК под влиянием этих сигналов и накоплении в популяции клеток со свойствами сенесцентных, опосредующих нарушения регуляторной функции МСК за счет изменения их секретома. Участие секретируемых такими МСК нкРНК, выбранных по результатам биоинформатического анализа и экспериментальным данным, в формировании патологически измененного микроокружения будет исследовано на релевантных клеточных моделях, а также на животной модели повреждения тканей у старых и молодых мышей. Важной задачей проекта является оценка возможности модуляции “памяти” МСК с помощью направленной регуляции экспрессии выявленных нкРНК, что позволит разработать новые подходы к эндогенной стимуляции регенерации тканей и органов.

There is strong evidence that mesenchymal stromal cells (MSCs) are involved in the regulation of almost all physiological processes occurring during tissue repair and regeneration. At the same time, the main role in the implementation of their regulatory effects is belonged to MSC secretome, including noncoding RNA (ncRNA), which after transfer into other cells can reprogram them, therefore stimulating the regenerative processes. This makes MSCs one of the most promising tools for regenerative medicine. However, many researchers have shown that MSCs respond specific secretome changes to different signals, and at a certain level of such effects, the ability of MSCs to support regenerative processes deteriorates, which is often observed in tissues during aging and the development of many diseases. The mechanisms of such changes of the functional activity of MSCs and the participation of ncRNA secreted by MSCs in these processes remains poorly understood. The proposed interdisciplinary project combines the advantages of two methodological scientific approaches to solving this problem - hypothesis-driven approach relied on the ability of MSCs to respond to signals associated with tissue damage by long-term consolidation of changes in the pattern of regulatory ncRNA, including those secreted by cells within extracellular vesicles, and searching approach based on bioinformatic analysis of the accumulated data sets of changes in the MSC transcriptome under the influence of damaging signals. It is planned to establish mechanisms for “memory” MSC responses to the effects of different signals arising from tissue damage: acute hypoxia with subsequent reoxygenation, mediators of the acute phase of inflammation and chronic inflammation, as well as profibrotic extracellular matrix. The hypothesis of accelerated aging of MSCs under the influence of these signals and accumulation of cells in the population with senescent properties mediating disorders of the MSC regulatory function due to changes in their secretion will be tested. The participation of ncRNA secreted by such MSCs, selected according to the results of bioinformatic analysis and experimental data, in the formation of a pathologically changed microenvironment will be investigated on relevant cell models, as well as on an animal model of tissue damage in old and young mice. An important task of the project is to assess the possibility of modulating the MSC “memory” using the directional regulation of the expression of identified ncRNA, which will provide the bases to develop new approaches to endogenous stimulation of the regeneration of tissues and organs.

В результате реализации предлагаемого проекта будут получены новые, актуальные результаты, раскрывающие механизмы регуляции репарации и регенерации тканей человека. Так, будут получены данные, подтверждающие или опровергающие гипотезу о способности постанальных МСК “запоминать”, в том числе на длительное время, последствия воздействия на клетки ассоциированных с повреждением тканей сигналов путем стабильного изменения в клетках и секретируемых ими внеклеточных везикулах паттерна регуляторных нкРНК. Впервые будет проверено предположение об ускоренном старении в этих условиях МСК или отдельной субпопуляции в их составе, опосредующей за счет действия измененного секретома нарушения регуляторных свойств МСК. Проверка этих гипотез будет проведена с использованием как методов биоинформатического анализа, так и экспериментальными методами. Применение предложенных алгоритмов биоинформатического анализа позволит значительно расширить возможности анализа массивов данных как RNA-seq, так и scRNA-seq МСК. Одним из результатов выполнения работ первого года проекта станет популяционный анализ МСК под воздействием повреждающих сигналов различной природы, построенный на основании анализа транскриптома одиночных клеток. С помощью биоинформационных подходов будут выявлены клеточные субпопуляции с определенным профилем, характеризующим накопление сенесцентных клеток и определяющим их участие в регуляции процессов репарации и регенерации тканей. Впервые с помощью биоинформатических подходов будут выявлены регуляторные нкРНК, паттерн которых согласовано изменяется в определенных условиях или определенной субпопуляции МСК при воздействии повреждающих сигналов. Особое внимание будет уделено отдельным представителям и кластерам регуляторных нкРНК, достоверно представленных, по результатам наших и литературных данных, во внеклеточных везикулах, секретируемых МСК, и способных к переносу в другие клетки-мишени. На первом году проекта будут отработаны модели повреждающих воздействий на МСК, включая выраженные изменения уровня кислорода, влияние на клетки растворимых медиаторов острого и хронического воспаления, сигналы от профибротического внеклеточного матрикса. Будет проанализирован клеточный состав полученных под воздействием этих факторов мМСК, в том числе с точки зрения накопления в популяции мМСК сенесцентных клеток с признаками, выявленными по результатам биоинформатического анализа транскриптома единичных клеток. На следующих этапах проекта будет оценена функциональная активность секретома этих клеток на моделях in vitro и in vivo. На втором году выполнения проекта будут получены результаты, на основании которых будет уточнен дальнейший ход исследования. Так, в течение второго года выполнения проекта будут получены экспериментальные результаты анализа содержания выявленных по данным биоинформатического анализа нкРНК и их кластеров в мМСК, в том числе в отдельных субпопуляциях МСК с признаками сенесцентных клеток. Среди изученных нкМСК будут выявлены наиболее перспективные кандидаты, направленное изменение экспрессии которых предположительно может нивелировать негативные эффекты повреждающих воздействий на МСК и их регуляторные свойства. Будут получены результаты проверки, как секретом мМСК влияет in vitro на различные процессы, важные для регуляции регенерации тканей после повреждения. Для этого будут использованы ранее отработанных нами in vitro модели ангиогенеза, фиброза, индукции клеточного старения и поддержания тканеспецифичных стволовых клеток на примере сперматогенных стволовых клеток. На третьем году проекта будут получены результаты анализа регуляторной функции мМСК, для которых на предыдущих этапа было показано закрепление изменения экспрессии определенных нкРНК и их содержания в секретируемых внеклеточных везикулах, в ответ на повреждающее воздействие, на животной модели глубокой раны у мышей. Сравнительный анализ влияния секретома мМСК на процесс ранозаживления у молодых и старых животных позволит оценить его вклад в модуляцию нормального и сенесцентного микроокружения. Результаты заключительного этапа проекта позволят существенно расширить понимание механизмов участия нкРНК в эффектах секретома МСК, а также роль определенных субпопуляций клеток в регуляции заживления тканей после повреждения. Выявленные на моделях in vitro и in vivo эффекты позволят установить совершенно новые механизмы изменения секретома МСК под воздействием повреждающих факторов, которые могут играть важную роль в процессах репарации и регенерации тканей путем опосредованного перепрограммирования микроокружения клеток. Вклад отдельных нкРНК, секретируемых МСК, в изменения регуляторных свойств МСК будет установлен с помощью селективного ингибирования различных компонентов секретома клеток. Так, в результате первого года работы будет налажена методика прицельного подавления или активации экспрессии интересующих регуляторных нкРНК или их кластеров. Будут получены клеточные линии с измененной экспрессией нкРНК, которые предположительно играют важную роль в процессах регенерации, фиброза и клеточного старения. Изучение свойств полученных клеточных линий позволит установить вклад конкретных нкРНК в упомянутые процессы, а совершенствование подходов эпигенетической регуляции их экспрессии и средств направленной доставки, предположительно, позволит использовать установленные нкРНК в качестве возможных мишеней для фармакологической коррекции патологического течения регенеративных процессов. Налаженные в ходе выполнения проекта методические подходы могут быть использованы в дальнейшем для выяснения роли регуляторных фрагментов ДНК (гены нкРНК, промоторы, интроны, межгенные интервалы) в развитии широкого спектра патологий. На основании данных, полученных с помощью полуколичественной масс-спектрометрии компонентов секретома МСК, будут получены наборы белковых паттернов, характерные для разных физиологических состояний клетки, а также сделано научно-обоснованное предположение, которое ляжет в основу дальнейших исследований механизма долговременного закрепления в МСК результатов ответа на повреждающие сигналы. Установленные при выполнении проекта механизмы нарушения репарации и регенерации тканей с участием МСК, а также опосредующие их молекулярные медиаторы, могут быть использованы в качестве мишеней для разработки новых подходов к стимуляции восстановления тканей.

На базе Факультета фундаментальной медицины (ФФМ) и Медицинского научно-образовательного центра (МНОЦ) МГУ имени М.В. Ломоносова исследования в области биологии мезенхимных стромальных клеток (МСК) ведутся более 15 лет. В ходе проведенных ранее исследований было показано, что МСК из различных источников выступают в качестве ключевых модуляторов и непосредственных участников заживления тканей при повреждении. Нами было выявлено выраженное влияние возраста и коморбидных состояний (диабет, ишемические заболевания и др.) на паракринную функцию, пролиферацию и дифференцировку МСК [Efimenko et al., 2014; Dzhoyashvili et al., 2014], а также отработаны методы характеристики сенесцентных клеток в популяции МСК. Проводится исследование молекулярных механизмов регенерации при участии МСК и межклеточных взаимодействий, активно изучается нейротрофический потенциал МСК и их участие в репарации нервной ткани. Учитывая, что паракринные эффекты этих клеток считаются ключевыми для реализации их действия, нами был подробно исследован секретом МСК жировой ткани с помощью современных омиксовых технологий [Kalinina et al., 2015]. В ряде работ была показана роль внеклеточных везикул, продуцируемых МСК, в реализации эффектов этих клеток в отношении регенерации ткани. Нами были отработаны методы разделения различных компонентов секретома МСК, включая методы выделения внеклеточных везикул из среды культивирования, анализа их состава и функций [Lopatina et al., 2014; Efimenko et al., 2016; Basalova et al., 2018]. Руководитель проекта и ряд сотрудников коллектива имеют успешный опыт выполнения, в том числе в качестве руководителя или ответственного исполнителя, ряда грантов РФФИ, РНФ, НИР и НИОКР при поддержке различных ведомств. Коллектив ежегодно публикует статьи в международной и национальной научной периодике, ведется активное патентование результатов работы, а междисциплинарный характер подготовки специалистов позволяет решать задачи самого широкого спектра.