ИСТИНА

Метаболическое репрограммирование большинства типа опухолей можно охарактеризовать двумя основными изменениями в энергообмене клеток: преобладанием гликолиза над окислительным фосфорилированием и повышением потребления глутамина в качестве энергетического субстрата. В связи с тем, что большинство опухолей характеризуются значительным гликолитическим сдвигом, во многих случаях ингибирование метаболизма опухолевых клеток путем подавления гликолиза считается перспективным подходом к терапии опухолей. Так, 2-дезоксиглюкозу (2-ДГ), ингибитор гексокиназы, рассматривают как потенциальный агент для комбинированной противоопухолевой терапии. Однако, в последнее время выявлены новые механизмы действия 2-ДГ и показано, что 2-ДГ помимо энергетики клетки затрагивает процессы N-гликозилирования белков, что также необходимо учитывать при выборе мишеней противоопухолевой терапии.Необходимо подчеркнуть, что для каждого вида опухоли характерны собственные комбинации регуляторных механизмов и различные степени усиления гликолиза или альтернативных энергетических путей. Исследования энергетики опухолевых клеток и ее роли в устойчивости опухолей к терапии позволят выработать новые средства и стратегии для борьбы со злокачественными новообразованиями.

Targeting glycolysis is regarded as a promising strategy for tumor cell elimination because of a crucial role of this process as an energy source (Warburg effect). 2-Deoxyglucose (2-DG), a non-metabolizable glucose analog, inhibits phosphorylation of glucose by hexokinase in a competitive manner and mimics glucose deprivation conditions, decreasing glucose-6-phosphate level and glycolytic capacity. However, it is also known that 2DG blocks N-linked glycosylation, leading to ER stress and an unfolded protein response (UPR) in many cell types, which may be followed by cell dysfunction and death. We found that co-treatment with 2-DG and etoposide or cisplatin can stimulate distinct responses in various cancer cell lines, acting through either ATP depletion or ER stress.

Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, позволят выработать стратегии, основанные на комбинированной терапии с использованием известных противоопухолевых цитотоксических агентов и непосредственного воздействия на различные функциональные составляющие опухолевых клеток, такие как метаболизм (отличающийся метаболический профиль в зависимости от этиологии опухоли), синтез и фолдинг клеточных белков, необходимых для нормального функционирования и процессы аутофагии. 1. Будет выявлен метаболический профиль опухолевых клеток различной этиологии и проанализирована корреляция гликолитического сдвига с устойчивостью клеток к терапии. 2. Будет установлено, как модуляция гликолиза и/или окислительного фосфорилирования влияет на гибель клеток под действием терапевтических средств. 3. Будет выявлена роль митохондрий в регуляции баланса между апоптозом и аутофагией в условиях модуляции энергетики митохондрий. 4. Будет выявлена устойчивость мембраны митохондрий к пермеабилизации в условиях подавления гликолиза и/или окислительного фосфорилирования. 5. Будет выявлена роль глутаминолиза в клетках различной этиологии и оценка вклада данного процесса, как в энергообеспечение клетки, так и в активность актиоксидантных систем.

При исследовании вклада того или иного метаболического пути в энергетику клетки и его влияния на резистентность к индуцируемой клеточной гибели , была выявлена гетерогенность метаболизма в различных опухолевых клеточных линиях и, соответственно, отличающийся ответ на воздействие цитотоксическими препаратами. Так, ингибирование гликолиза на стадии гексокиназы с использованием 2-деоксиглюкозы повышало клеточную гибель в линиях нейробластомы, но приводило к ослаблению апоптоза в клетках колоректального рака. При измерении уровня дыхания и гликолиза опухолевых клеток разной этиологии изначально была выявлена гетерогенность в преобладании одного из путей продукции АТФ, вследствие этого, наблюдали разный ответ на воздействие ингибиторов метаболизма в разных опухолевых клетках.

В опухолевых клетках различной этиологии преобладают различные метаболические пути для получения АТФ, т.е. обладают различным метаболическим профилем. Как еще продемонстрировал Отто Варбург, в значительной части опухолей имеет место эффект гликолитического сдвига, а именно усиления гликолиза даже в присутствии высокой концентрации кислорода. Данный эффект носит название эффекта Варбурга. Учитывая гликолитический фенотип опухолей, подавление гликолиза, основного источника АТФ для данных опухолевых клеток, может значительно повысить чувствительность клеток к цитотоксическим агентам. В данном проекте для подавления гликолиза применяли 2-дезоксиглюкозу (2-ДГ), конкурентный ингибитор гексокиназы. В первой реакции гликолиза 2-ДГ фосфорилируется гексокиназой, как и обычная глюкоза. Однако во второй стадии гликолиза фермент фосфоглюкоизомераза не использует 2-ДГ. Таким образом, в клетке накапливается фосфорилированная форма 2-ДГ, что ведет к ингибированию продуктом реакции фермента гексокиназы. Учитывая, что большинство опухолевых клеток характеризуется усилением гликолитического пути, ожидаемый эффект комбинации 2-ДГ с цитотоксическим агентом - усиление клеточной гибели. Действительно, в большинстве опухолевых клеточных линий человека обработка 2-ДГ совместно с противоопухолевым препаратом цисплатином приводила к усилению программируемой клеточной гибели – апоптозу. Как показано на рисунке 1А, в клетках нейробластомы TET21N, SK-N-BE(2) и в клетках колоректального рака RKO обработка 2-ДГ приводила к усилению расщепления белка ПАРП, вызванного цисплатином. ПАРП является субстратом фермента каспазы-3, представителя одного из ключевых белков исполнителей апоптоза, семейства каспаз. Однако мы наблюдали обратный эффект в клеточной линии колоректального рака HCT116 – 2-ДГ подавляла апоптоз, вызванный цисплатином, т.е. защищала опухолевые клетки от действия основного цитотоксического агента. Согласно результатам вестерн-блот анализа в клетках HCT116 комбинация 2-ДГ с цисплатином приводила к уменьшению расщепления каспазы-3 и ее субстрата белка ПАРП (рис. 1Б). Данные вестерн-блот анализа были подтверждены результатами экспериментов измерения активности каспазы-3. Оценка каспазной активности основана на расщеплении каспазой 3 пептидного субстрата, связанного с флуоресцентной меткой (Ac-DEVD-AMC) с последующим измерением сигнала флуоресцении на приборе Varioskan Flash Multimode Reader, предварительно установив температуру 37°С. Регистрация флуоресценции проводилась при длине волны возбуждения 380 нм и испускания 460 нм. Помимоэтого оценка клеточной гибели была проведена с помощью оценки выхода цитохрома с в цитозоль, ключевого события реализации программы апоптоза. Как показано на рисунке 1 В и Г, обработка 2-ДГ в комбинации с цисплатином приводила к разнонаправленным эффектам в опухолевых клетках различной этиологии – к повышению активности каспазы-3 и усилению выхода цитохрома с в клетках SK-N-BE(2) и подавлению апоптоза в клетках колоректального рака в HCT116.