«Новые электрохимические тест-системы многоразового использования на основе высокоэффективных биосенсоров для неинвазивной медицинской диагностики» НИР

Novel electrochemical multy use test systems based on advanced biosensors for non-invasive clinical diagnostics

Соисполнители НИР

ООО РУСЕНС Соисполнитель
кафедра аналитической химии Соисполнитель

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. «1. Повышение эффективности электрокатализатора восстановления пероксида водорода и разработка новых сенсорных материалов для конструирования электрохимических (био)сенсоров.
Результаты этапа: 1.1.Оптимизация методики и изготовление планарных сенсорных структур методом трафаретной печати в качестве основы для разработки планарных сенсоров. Соисполнителем ООО Русенс выполнена оптимизация трафаретной печати сенсорных структур и разработана методика изготовления трехэлектродных планарных сенсорных структур. Планарные сенсорные структуры изготавливались методом послойной трафаретной печати на полуавтоматическом печатном станке SCF-300 (Technical Industrial Co. Ltd., Гонконг). Проведено изучение электрохимических свойств электродов, изготовленных с применением различных углеродных паст. Подготовлено 500 штук планарных структур. 1.2.-1.3.-1.4.Исследование новых протоколов со-осаждения наноструктур гексацианоферратов переходных металлов для разработки электрокатализатора восстановления пероксида водорода с улучшенной операционной стабильностью и каталитической активностью. Разработка и изготовление планарных сенсоров на пероксид водорода на основе трехэлектродных сенсорных структур, изготовленных методом трафаретной печати. Изучение аналитических характеристик сенсоров на пероксид водорода, основанных на улучшенном наноструктурированном электрокатализаторе. Разработана новая упрощенная методика модификации электродов сенсорным материалом на основе гексацианоферратов железа и никеля [Karpova E.V., Karyakina E.E., Karyakin A.A. Iron–nickel hexacyanoferrate bilayer as an advanced electrocatalyst for H2O2 reduction . RSC Advances. 2016. V. 6. P. 103328–103331]. Высокостабильный сенсор для определения пероксида водорода получен на основе одного бислоя, состоящего из каталитического покрытия БЛ и стабилизирующего покрытия NiГЦФ, нанесенных послойно методом межфазного синтеза. Сенсор демонстрирует высокую операционную стабильность: в режиме непрерывного мониторинга 1 мМ H2O2 первоначальный отклик сохраняется в течение 80 минут. Чувствительность анализа составила (0,34±0,02 А·М-1·см-2); диапазон определяемых концентраций (1·10-7 – 1·10-3 М) [Карпова Е.В., Карякин А.А. Суперстабильный электрокатализатор восстановления пероксида водорода как основа высокоэффективного биосенсора. Acta Naturae. 2016. V. 2. P. 136]. Разработаны и изготовлены новые высокостабильные планарные сенсоры на пероксид водорода на основе гексацианоферратов железа и никеля. Совместно с соисполнителем ООО Русенс подготовлено 200 штук лабораторных образцов сенсоров. 1.5.Исследование структуры и морфологии наноструктурированных пленок гексацианоферратов переходных металлов на оборудовании ЦКП ФНМ МГУ имени М.В. Ломоносова и выявление структурно-функциональных зависимостей для понимания фундаментальных пределов их активности и операционной стабильности. Электрокатализатор был исследован методами электрохимической микроскопии [Komkova M.A., Maljusch A., Sliozberg K., Schuhmann W., Karyakin A. Scanning Electrochemical Microscopy: Visualization of Local Electrocatalytic Activity of Transition Metals Hexacyanoferrates. 2016. Russian Journal of Electrochemistry, V. 52, P. 1298-1304]. При помощи сканирующей капельной ячейки осуществлен электрохимический синтез геометрически идентичных образцов гексацианоферратов железа и никеля для измерений методом СЭХМ. Показано, что NiГЦФ обладает незначительной активностью как электрокатализатор восстановления пероксида водорода по сравнению с берлинской лазурью (БЛ). Предлагаемый подход, успешно примененный для модельных образцов, является перспективным для визуализации поверхностной активности с высоким пространственным разрешением для дизайна и разностороннего исследования электроактивных поверхностей, а также для разработки сенсоров и биосенсоров. Фундаментальные исследования электронтранспортных характеристик электро-катализатора методом импедансной спектроскопии выявили необычные свойства гексацианоферратов переходных металлов, в частности, сопротивления переноса заряда, не подчиняющееся закону Ома. Сопоставление спектров электрохимического импеданса с морфологией пленок гексацианоферратов позволило предложить способ оценки сплошности электроактивных неорганических без применения средств микроскопии [Komkova M.A., Karpova E.V., Sukhorukov G.A., Sadovnikov A.A., Karyakin A.A. Estimation of continuity of electroactive inorganic films based on apparent anti-Ohmic trend in their charge transfer resistance. 2016. Electrochimica Acta, V. 219, P. 588-591]. 1.6. (Био)сенсоры на основе берлинской лазури, не требующие источника питания, для носимых устройств. В 2016 году показана возможность создания (био)сенсоров на основе электродов, модифицированных БЛ для носимых устройств, не требующих источников питания. Оптимальный потенциал функционирования амперометрических сенсоров на основе БЛ – около 0 В (отн. Ag/AgCl/1 M KCl). Сенсоры на основе БЛ функционируют в гальваническом режиме (рабочий электрод и ХСЭ замкнуты через амперметр). Генерируемый ток линейно зависит от концентрации H2O2, а аналитические характеристики сенсоров совпадают с таковыми для идентичных сенсоров, функционирующих по трехэлектродной схеме [Комкова М.А., Карякин А.А. Высокоэффективные (био)сенсоры на основе берлинской лазури для носимых устройств, не требующие источников питания. Acta Naturae, 2016. V. 2, P. 130]. Данная будет продолжена в 2017 году. 1.7.-1.8.Определение глюкозы и латата в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) с помощью нового сенсора на пероксид водорода. Исследование корреляции между содержанием глюкозы в крови и конденсате выдыхаемого воздуха для создания основ неинвазивной клинической диагностики гипо/гипергликемии и выявление наличия алгоритмов соответствия концентрации этих метаболитов в крови и КВВ. Анализ неинвазивно собираемого КВВ, диктует необходимость сопряжения биосенсора с устройствами концентрирования. Была разработана электроаналитическая установка, позволяющая сдвинуть диапазон действия лактатного биосенсора в сторону меньших концентраций на два порядка. Установка успешно применена для анализа КВВ [Karyakina E.E., Lukhnovich A.V., Yashina E.I., Statkus M.A., Tsisin G.I., Karyakin A.A., Electroanalysis, Electrochemical Biosensor Powered by Pre-concentration: Improved Sensitivity and Selectivity towards Lactate. 2016. Electroanalysis. V. 28. P. 2389 -2393]. Проведено определение концентрации лактата в КВВ, собираемом неинвазивно. Лактат определяли у группы спортсменов в состоянии покоя и после тяжелой физической нагрузки, после которой концентрация лактата в крови повышается в несколько раз. Установлено, что после физической нагрузки концентрация лактата в КВВ также повышается, что свидетельствует о наличии корреляции КВВ с кровью в отношении гипоксии. [Карякин А.А., Карякина Е.Е. Неинвазивная диагностика гипоксии с использованием высокоэффективных биосенсоров на основе наноструктурированных электро- и биокатализаторов. Acta Naturae. 2016. V. 2. P. 129]. Для определения концентрации глюкозы в КВВ предложено использовать метод, основанный на амперометрическом измерении скорости гомогенной реакции окисления глюкозы под действием глюкозооксидазы в режиме постоянного перемешивания. В качестве рабочего электрода используется сенсор на пероксид водорода на основе планарного электрода, модифицированного БЛ. Аналитическим сигналом являлась начальная скорость реакции, пропорциональная тангенсу угла наклона кривой накопления продукта ферментативной реакции – пероксида водорода. В пробах конденсата, собранных с использованием хлорамфеникола у здоровых доноров, обнаружена глюкоза в концентрации около 10 мкМ – в 500 раз ниже, чем в крови. Для установления корреляции между изменениями концентрации глюкозы в крови и КВВ использовали глюкозотолерантный тест. Показана возможность использования КВВ для неинвазивной оценки концентрации глюкозы в крови [Вохмянина Д.В., Никулина С.В., Карякина Е.Е., Карякин А.А. Биоэлектрохимический анализ конденсата выдыхаемого воздуха как инструмент неинвазивной диагностики. Acta Naturae. 2016. V. 2. P. 137]. Основная часть исследований по данной теме исследования будет включена в отчет за 2 этап проекта (в 2017 году), так как основная публикация еще находится на рассмотрении в журнале (послана в печать в сентябре 2016 г). 1.9.Новый сенсорный материал с повышенной селективностью к лактату на основе темплатного синтеза боронат-замещенного полианилина. Разработаны новые сенсорные материалы на основе боронат-замещенного полианилина, обладающие высокой селективностью к сахарам и оксикислотам [Никитина В.Н., Зарянов Н.В., Карякин А.А. Высокоселективные синтетические рецепторы на основе поли(анилинборных кислот) для детекции сахаров и оксикислот. Acta Naturae. 2016. V. 2. P. 132]. Работы по созданию неферментивных сенсоров для определения лактата в поте были запланированы на 2 этап проекта, но уже начаты в 2016 г. и будут продолжены в 2017 г. Проведен импринтинг гидроксикислот в боронат-замещенный полианилин. Импринтинг позволяет направленно изменять аналитические характеристики синтетического рецептора. Чувствительность и селективность сенсоров к оксикислотам увеличивается в 10 раз при проведении полимеризации в присутствии молекул-темплатов (оксикислот) по сравнению с полимерами без молекулярных отпечатков [Зарянов Н.В., Никитина В.Н., Карякин А.А. Неферментативный сенсор на основе боронат-замещенных полианилинов для детекции лактата в поте в целях неинвазивной диагностики. Acta Naturae. 2016. V. 2. P. 136-137]. Более подробный отчет по повышению селективности боронат-функционализированных полианилинов за счет молекулярного импринтинга будет включена в отчет за 2 этап проекта (в 2017 году), так как основная публикация еще находится на рассмотрении (послана в печать в октябре 2016 г). Изготовлены лабораторные образцы планарных сенсоров на полиолы (оксикислоты и сахара) на основе трехэлектродных сенсорных структур, модифицированных новым сенсорным материалом, полученным в результате темплатного синтеза боронат-замещенного полианилина в присутствии лактата, 20 шт. Сенсоры включены в системы проточно-инжекционного анализа. Кроме того, синтетический рецептор на основе проводящего боронат-замещенного полианилина оказался пригодным для детекции микроорганизмов [Андреев Е.А., Комкова М.А., Карякин А.А. Новый принцип безреагентной регистрации аффинных взаимодействий на основе повышения проводимости проводящего полимера. Acta Naturae. 2016. V. 2. P. 130]. Используется новый принцип детекции, основанный на увеличении проводимости полимера в присутствии микроорганизмов. Такой принцип позволяет различать специфический и фоновый сигнал, поскольку в последнем случае проводимость всегда уменьшается. Сенсорный материал был успешно применен для электрохимического детектирования плесневых грибов Penicillium chrysogenum. Нижняя граница определяемого содержания микроорганизмов составила 600 колониеобразующих единиц в 1 мл (КОЕ/мл) [Андреев Е.А., Комкова М.А., Крупенин В.А., Преснов Д.Е., Карякин А.А.. Электрохимическое детектирование Penicillium Chrysogenum на основе повышения проводимости полиаминофенилборной кислоты. Электрохимия. 2017. V. 53. № 1. P. 1-5].
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. 2. Разработка и изготовление планарных биосенсоров на лактат и глюкозу с улучшенными чувствительностью, селективностью, операционной стабильностью и интеграция биосенсоров в электроаналитические системы проточного типа.
Результаты этапа: 2.1 Иммобилизация лактатоксидазы (ЛОД) и глюкозооксидазы (ГОД) в функционализированные полимеры методом электрополимеризации. Выполнена печать планарных сенсорных структур для электрохимических измерений и последующего изготовления сенсоров (соисполнитель ООО Русенс). Изготовлено 300 штук структур и 200 штук сенсоров на пероксид водорода по методикам, оптимизированным на 1 году выполнения проекта. Ферменты глюкозооксидаза (ГОД) и лактатоксидаза (ЛОД) иммобилизованы в пленки полипиррола в процессе электрополимеризации пирролов, функционализированных по азоту на поверхность планарных сенсоров, модифицированных БЛ (сенсоров на пероксид водорода). Биосенсоры на лактат или глюкозу включены в систему электроанализа и проведен проточно-инжекционный анализ (ПИА) модельных растворов с определением концентраций лактата и глюкозы. Оптимизированы условия иммобилизации ЛОД и ГОД (исследованы тип полимера, содержание мономера, количество фермента на электроде, время высушивания, среда для электрополимеризации). Изучена операционная стабильность биосенсоров и стабильность при хранении. Сравнены аналитические характеристики биосенсоров на лактат и глюкозу, разработанных путем иммобилизации ферментов методом электрохимической полимеризации, а также биосенсоров, созданных в данном проекте без привлечения электрохимических стадий (разделы 2.2). 2.2 Иммобилизация лактатоксидазы (ЛОД) и глюкозооксидазы (ГОД) в золь-гели и мембраны Нафион на поверхности стабилизированного электрокатализатора на пероксид водорода для повышения стабильности лактатных и глюкозных биосенсоров. Ферменты ЛОД и ГОД иммобилизованы в золь-гель пленки алкоксисиланов (ЛОД), а также в смешанные покрытия золь-гель – Нафион (ГОД). Изучены аналитические характеристики биосенсоров в стационарной ячейке при 0 В в режиме амперометрии. Оптимизированы условия иммобилизации ЛОД и ГОД. Протестированы концентрации пер-фторсульфонированного полимера (ПФС – аналог Nafion) и (γ-аминопропил) триэтоксисилана (силоксан) в смеси для иммобилизации. Изучена воспроизводимость биосенсоров. Исследована операционная стабильность отклика биосенсоров в стационарной ячейке при перемешивании. Сравнены аналитические характеристики биосенсоров (чувствительность определения глюкозы или лактата, диапазоны определяемых концентраций, стабильность, т.е. время сохранения 50% первоначального отклика при концентрациях глюкозы/лактата близких к верхней границе линейного диапазона определяемых концентраций). Основные результаты по 2.2 изложены в статье Karpova E. V., Karyakina E. E., Karyakin A. A. Accessing stability of oxidase-based biosensors via stabilizing the advanced H2O2 transducer // Journal of the Electrochemical Society. — 2017. — Vol. 164, no. 5. — P. B3056–B3058. 2.3 Интеграция разработанных биосенсоров (раздел 2.2) в электроаналитические системы проточного типа и исследование аналитических характеристик биосенсоров на лактат в модельных растворах в проточно-инжекционном режиме; Оптимизация конструкции и изготовление ячеек типа wall-jet соисполнителем ООО Русенс. Сборка системы электроанализа, включающей саму проточную ячейку, шприцевой насос, поддерживающий постоянный поток жидкости, инжектор и потенциостат, интегрированный с компьютером. Исследование аналитических характеристик биосенсоров в модельных растворах в режиме ПИА (чувствительность, диапазон определяемых концентраций, предел обнаружения). Определение количества измерений в час путем многократного инжектирования анализируемого вещества с постоянной концентрацией для глюкозного и лактатного биосенсоров в режиме ПИА. Исследование операционной стабильности отклика биосенсоров в ПИ системе. Подготовлен отчет по аналитическим характеристикам биосенсоров и приведен в дополнительных материалах. 2.4 Разработка тест-системы для совместного определения глюкозы и лактата в образцах крови в тонкослойной проточно-инжекционной ячейке; Совместно с ООО Русенс разработана четырехэлектродная печатная система (ЧПС) для конструирования мультибиосенсоров на глюкозу и лактат. ЧПС представляет собой два дисковых рабочих электрода, между которыми располагается общий вспомогательный электрод большой площади. Общий электрод сравнения окружает рабочие электроды с внешней стороны. Все указанные электроды имеют независимые контакты. Оптимизирована конструкция и процесс изготовления ТСЯ для проточно-инжекционного анализа с заменяемым мультибиосенсором. Соисполнителем ООО Русенс изготовлено 2 ячейки. Сборка электроаналитической системы (ЭАС) с тонкослойной ячейкой (ТСЯ) со встроенным мультибиосенсором для совместного определения глюкозы и лактата в режиме проточно-инжекционного анализа (ПИА). ЭАС включает саму проточную ячейку, шприцевой насос, поддерживающий постоянный поток жидкости, инжектор и потенциостат, интегрированный с компьютером. Подготовлен отчет о конструировании ТСЯ и сборке ЭАС и приведен в дополнительных материалах. Подготовлена заявка на патент “Электроаналитическая система для одновременного определения глюкозы и лактата в крови “ Приведена в дополнительных материалах. Тонкослойные ячейки (ТСЯ) изготавливались из прозрачного органического стекла, и крепились на основу из непрозрачного пластика. Для изготовления ТСЯ было предложено разделение конструкции на две части. Разделение на части целесообразно было провести таким образом, чтобы сенсор находился между двумя частями (см. фото в Приложении). Оптимизация конструкции и изготовление ТСЯ для проточно-инжекционного анализа с заменяемым мультибиосенсором выполнено ООО Русенс в рамках договора с Химическим факультетом 2.5 Изучение мощностных характеристик сенсоров и биосенсоров на основе Берлинской лазури для их функционирования в режиме гальванической ячейки без внешнего источника питания. Изучение мощностных характеристик (био)сенсоров на основе Берлинской лазури для создания энергонезависимых устройств. Исследование функционирования в режиме генерации мощности (а) электрохимического сенсора для определения пероксида водорода на основе Берлинской лазури, б) электрохимического сенсора для определения органического аналита (например, глюкозы или лактата) на основе Берлинской лазури и фермента-оксидазы. Схемы функционирования в режиме генерации мощности приведены в дополнительных материалах. Влияние Cl- на мощность сенсора. Поскольку одним из элементов генерации мощности является электрод сравнения, в данном случае хлорсеребряный электрод, необходимо исследовать влияние концентрации хлорид-ионов в анализируемом растворе на аналитические характеристики (био)сенсоров на на основе Берлинской лазури в режиме генерации мощности. Изучение аналитических характеристик биосенсоров (чувствительность, селективность, соотношение сигнал/шум) для определения пероксида водорода, глюкозы и лактата в режиме генерации мощности (без внешнего питания). Сравнение с характеристиками биосенсоров, функционирующих по классической трехэлектродной схеме. Подготовлена заявка на патент “Способ определения концентрации пероксида водорода в растворе с помощью сенсоров на основе Берлинской лазури в режиме генерации мощности “. Приведена в дополнительных материалах. Отчет по разделу 2.5 приведен в статье Komkova M.A., Karyakina E.E., Karyakin A.A. Noiseless Performance of Prussian Blue Based (Bio)sensors through Power Generation. Analytical Chemistry, 2017, 89, № 12, 6290-6294. 2.6 Валидизация биосенсоров в лабораторном анализе крови для определения концентраций глюкозы и лактата, и выявление наличия алгоритмов соответствия содержаний этих метаболитов в крови, КВВ и поте. Проверка правильности результатов анализа крови на глюкозу и лактат с помощью разработанных биосенсоров и коммерческих анализаторов крови. Измерение глюкозы и лактата в тест-системе электроанализа (ПИА) с биосенсорами в модельных растворах. Изучение изменения концентрации глюкозы в крови, КВВ и поте при глюкозной нагрузке (глюкозотолерантный тест). Изучение изменения концентрации лактата в крови, КВВ и поте при физических нагрузках. Установление корреляций изменений концентраций метаболитов в крови и экскреторных жидкостях. 2.7 Создание неферментативной тест-системы для определения концентрации лактата в поте с использованием сенсоров, модифицированных новым сенсорным материалом на основе боронат-замещенного полианилина, импринтированного гидроксикислотами. Электрохимический синтез проводящего полимера 3-аминофенилборной кислоты (3-АФБК) с молекулярными отпечатками лактата на поверхности планарных электродов. Оптимизация модификации электродов проводящим полимером путем варьирования параметров электрополимеризации (число циклов от 5 до 30) и состава ростовой смеси (соотношение концентраций лактат/мономер в диапазоне 5-8, концентрация мономера от 0.05 до 0.75М, концентрация фонового электролита – серной кислоты – в пределах от 0.1 до 0.3М ) Изучение свойств синтезируемого материала методом циклической вольтамперометрии (ЦВА). Импедиметрический анализ модельных растворов лактата с помощью электроаналитической тест-системы, включающей неферментативный сенсор на лактат. Исследование аналитических характеристик импедиметрического сенсора на основе поли-3-АФБК с молекулярными отпечатками лактата (чувствительность, предел обнаружения, диапазон определяемых концентраций, стабильность при хранении, время отклика). Анализ образцов пота импедиметрическим сенсором. Проверка правильности результатов анализа пота на лактат с помощью неферментативного импедиметрического сенсора. Сравнение результатов с амперометрическим биосенсором на основе фермента лактатоксидазы (раздел 2.2). В 2017 году подготовлено 2 заявки на патент. По заявке “Способ изготовления сенсоров для определения концентрации сахаров и гидроксикислот” получено положительное решение о выдаче патента по заявке №2016147032, 10 августа. Отчет о результатах по 2.7 приведен в статьях, опубликованных в 2017 году: Zaryanov N.V., Nikitina V.N., Karpova E.V., Karyakina E.E., Karyakin A.A. Nonenzymatic Sensor for Lactate Detection in Human Sweat. (2017) Analytical Chemistry, 89, 11198-11202; Nikitina V. N., Zaryanov I.V., Kochetkov I. R., Karyakina E. E., Yatsimirsky A. K., Karyakin A. A. Molecular imprinting of boronate functionalized polyaniline for enzyme-free selective detection of saccharides and hydroxy acids. (2017) Sensors and Actuators, B: Chemical, 246, 428-433. 2.8. Подготовка научных публикаций. В 2017 году опубликовано 8 статей в высокорейтинговых журналах. Также на экспертизу направлены 4 заявки на патенты РФ. Получено положительное решение по заявке №2016147032, поданной по результатам проекта в 2016 г. 2.9. Участие в Российских и Международных конференциях, конкурсах работ молодых ученых; Молодые ученые, члены научного коллектива, а также студенты, выполняющие курсовые работы на Химическом факультете МГУ имени М.В. Ломоносова приняли участие в ежегодной конференции Ломоносов-2017, также в конференции молодых ученых, организуемой химическим факультетом Санкт-Петербургского госуниверситета (апрель 2017 г.). Руководитель гранта и молодые ученые-исполнители проекта приняли участие в международных и российских конференциях. Сделано 22 устных доклада, результаты публиковались в СМИ, в том числе на телевидении (НТВ, Россия 1). 2.10.Защита кандидатских диссертаций. К защите подготовлена и представлена работа члена научного коллектива Андреева Егора Андреевича, выполненная по тематике проекта. Защита диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности биотехнология состоялась в июне 2017 г. (автореферат в Приложении). В исследованиях 2 года проекта также участвовали студенты 2-5 курсов Химического факультета МГУ, выполняющие курсовые и научные работы
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. 3. Тест-системы для неинвазивной диагностики гипоксии и гипо-гипергликемии по детекции лактата и глюкозы в КВВ и поте.
Результаты этапа: Научной группой руководителя проекта на протяжении последних 25-и лет разработаны новые научные направления по ключевым аспектам создания биосенсоров. [Karyakin A.A. Advances of Prussian blue and its analogues in (bio) sensors. Current opinion in electrochemistry 2017, том 5, № 1, с. 92-98 DOI: 10.1016/j.coelec.2017.07.006)]. Проект продолжает исследования по внедрению биосенсоров в системы неинвазивной диагностики. Все заявленные работы выполнены полностью. 1.Создание лабораторного образца анализатора пота на содержание лактата, основанного на неферментативном сенсоре, для контроля гипоксии; Импедиметрический неферментативный сенсор на основе поли(аминофенилборной кислоты) с молекулярными отпечатками лактата был адаптирован для работы в режиме хроноамперометрии или хронопотенциометрии в проточно-инжекционном режиме. Замена импедиметрического детектирования повышает экспрессность и снижает стоимость анализа. Амперометрический сенсор испытан для определения концентрации лактата в поте в сравнении с высокоселективным биосенсором на основе лактат оксидазы. Коэффициент корреляции Пирсона составил 0.95. При физических нагрузках повышается уровень лактата в 2-6 раз, что подтверждено независимым методом сравнения. Получено положительное решение о выдаче патента РФ по заявке, поданной 25.04.2017 “Способ изготовления сенсорного материала и сенсора на его основе “ N2017114420/28. 2. Создание прототипа неинвазивного монитора гипоксии с использованием проточного потосборника с интегрированным биосенсором на основе инженерии лактатоксидазы; Изготовлен прототип потосборника, пригодный для интеграции планарных биосенсоров, функционирующих в проточном режиме, и электронного блока для записи и передачи сигнала. Также разработана проточная тонкослойная ячейка и планарный биосенсор на лактат. Потосборник может быть изготовлен как вручную из цельного оргстекла, так и, при помощи 3D-печати из пластика. В проекте ранее был продемонстрирован альтернативный принцип детекции аналитов в режиме генерации мощности, позволяющий отказаться от использования потенциостата и тем самым упростить процедуру регистрации сигнала. Новый принцип регистрации основан на использовании планарных структур в режиме двухэлектродной схемы, при этом аналитические характеристики биосенсоров не уступают таковым при использовании потенциостата, а соотношение сигнал/шум возрастает до 10 раз. Монитор представляет собой миниатюризированную проточную систему: через капилляр, одно из отверстий которого прилегает к коже пациента, а другое служит в качестве «отвода» жидкости, проходит пот, а вдоль капилляра располагается лактатный биосенсор. Прототип неинвазивного монитора осуществляет мониторирование содержания лактата в неразбавленном поте в диапазоне от 0.1 мМ до 80 мМ лактата в течение 2 часов непрерывных измерений без потери исходной активности. Работа монитора в поте апробирована в режиме реального времени в состоянии покоя и при физической нагрузке (контроль гипоксии). Результаты тестирования монитора сопоставлены с аналогичными данными, полученными альтернативным методом проточно-инжекционного анализа лактата биосенсором на основе БЛ. Наблюдается высокая корреляция результатов: коэффициент Пирсона составил 0.993 (P=0.95, n = 8). Прототип неинвазивного монитора гипоксии прошел клинические испытания с участием спортсменов (Институт физкультуры и спорта и Центр подготовки сборных команд Москомспорта). Подготовлено техническое задание на монитор гипоксии для последующих НИОКР (см. Приложение). 3. Выявление корреляции между концентрациями глюкозы в поте и крови для неинвазивного мониторинга диабета и создание прототипа монитора гипо-гипергликемии. Корреляция между изменениями концентраций глюкозы в поте и крови не имеет достоверного подтверждения в литературе. Установление этой корреляции позволит разработать прототип неинвазивного монитора гипо-гипергликемии на основе анализа пота на содержание глюкозы. Монитор даст возможность следить за содержанием глюкозы в крови больных сахарным диабетом, особенно во время сна, когда резкие колебания этого параметра становятся опасными для их жизни. Корреляция между концентрациями глюкозы в поте и крови исследована двумя альтернативными методами: в разбавленном поте - методом ПИА с включенными биосенсорами, разработанными на 1-2 этапах проекта и в неразбавленном поте – в проточной системе с тонкослойной ячейкой с глюкозным биосенсором. По данным, полученным для 19 добровольцев в режиме ПИА, концентрация глюкозы в поте в десятки раз ниже, чем в крови (от 30 до 200 мкМ глюкозы, медиана – 7·10-5 М глюкозы). Использование глюкозотолерантного теста позволило повысить концентрацию глюкозы в крови и поте добровольцев через 60 минут после его начала и выявить положительную корреляцию между изменениями концентрации глюкозы в крови и поте (r = 0.74). Конструкция неинвазивного монитора гипоксии использована для создания прототипа монитора гипо-гипергликемии с включением биосенсора на глюкозу. Монитор для непрерывного определения глюкозы в неразбавленном поте, имеет следующие аналитические характеристики: S = 24±2 мA·M-1·cм-2 (n = 3, P = 0,95), ДОК 5 мкМ – 1 мМ глюкозы, cмин = 4,5 мкМ. Для проверки правильности работы биосенсора в неразбавленном поте, выполнено сравнение результатов анализа глюкозы, полученных с помощью неинвазивного монитора и альтернативного метода (ПИА). rПирсон>0.99 (n=12, P=0.95). Подготовлена статья: Elena V. Karpova, Elizaveta V. Shcherbacheva, Andrei A. Galushin, Darya V. Vokhmyanina, Elena E. Karyakina, Arkady A. Karyakin*. Non-invasive monitoring of diabetes using advanced flow-through glucose biosensor. 4. Создание прототипа портативного устройства для отбора КВВ с интегрированным электрохимическим (био)сенсором. Разработана электроаналитическая система и изготовлен прототип портативного устройства для экспрессного определения концентрации глюкозы в КВВ. Для конденсации выдыхаемого человеком аэрозоля предлагается использовать элементы Пельтье, что позволит температурно-контролируемо и воспроизводимо осуществлять отбор КВВ. Для электроанализа предлагается интегрировать в ячейку для отбора КВВ высокоэффективные, т.е. чувствительные, селективные и стабильные биосенсоры на основе Берлинской лазури (БЛ), разработанные на 1 и 2 этапах проекта. Проведена апробация электроаналитической системы, совмещающей системы отбора образца и регистрации электрохимического сигнала, на примере определения глюкозы. Биосенсоры для определения глюкозы демонстрируют сходные аналитические характеристики при анализе в фосфатном буфере (с=1.4 мкМ) и неразбавленном КВВ (с=1,0 мкМ). Данные электрохимического определения концентрации глюкозы в КВВ коррелируют с данными метода ВЭЖХ МС: с использованием максимума тока в качестве аналитического сигнала – с линейным коэффициентом корреляции Пирсона 0.95 (P=0.95, f=4). Cледовательно разарботанный прототип может быть эффективно использован для определения концентраций ключевых метаболитов в выдохе человека при решении задач неинвазивной диагностики. 5. Исследование коммерческого потенциала разработанных биосенсоров и тест-систем. (Био)сенсоры на основе БЛ превосходят имеющиеся на рынке аналоги по аналитическим характеристикам, а также несомненно являются на несколько порядков более дешевыми в сравнении с использующимися в современных устройствах биосенсорами на основе платины. Несмотря на привлекательность использования БЛ в качестве трансдьюсера, новой разработке будет сложно найти здесь свою нишу, поскольку рынок глюкометров переполнен. Имеющиеся в продаже персональные устройства обладают примерно одинаковыми характеристиками (анализ капли крови объемом 1-2 мкл занимает чуть менее 10 секунд, точность анализа в среднем составляет 20%) и имеют стоимость около 1000 рублей. Что касается лабораторных анализаторов глюкозы и лактата, то отечественные практически не представлены на рынке, а в имеющихся используются зарубежные картриджи, цена которых варьирует от 5 до 10 тысяч рублей. Таким образом, в данном случае имеется возможность для внедрения биосенсоров на основе БЛ для замены импортных картриджей. Аналогов разработанным в проекте тест-системам для неинвазивной диагностики на данный момент не существует. 6. Синтез нанозимов «искусственная пероксидаза»: наночастиц (НЧ) берлинской лазури (БЛ) с ферментной активностью. Для имитации фермента пероксидазы синтезированы наночастицы БЛ, обладающие характеристиками, присущими природным ферментам: (I) высокой специфичностью, в том числе отсутствием оксидазной активности, (II) возможностью работы в физиологических рН, (III) сверх-высокой каталитической активностью. Каталитическая константа синтезированных наночастиц пропорциональна их объему, вплоть до двухсот раз превосходя таковую для природной пероксидазы: для частиц с d=80 нм kкат = 1.2·104·с-1. Наночастицы сохраняют до 80% первоначальной каталитической активности при хранении в растворе около года, а сухой препарат может храниться при комнатной температуре неограниченно долго. [Komkova Maria A., Karyakina Elena E., Karyakin Arkady A. Catalytically synthesized Prussian Blue nanoparticles defeating natural enzyme peroxidase. Journal of the American Chemical Society, 140 (2018) 11302]. 7. Подготовка научных публикаций и патентов. Опубликовано 8 статей. Статья по разделу 3.8. опубликована в журнале JACS с импакт- фактором 14.3. Получено положительное решение о выдаче патента РФ по заявке, от 25.04.2017 “ Способ изготовления сенсорного материала и сенсора на его основе “ N2017114420/28 и заявки от 03.11.2017г. “ Способ определения концентрации пероксида водорода в растворе“. Поданы 2 новые заявки. 8. Участие в Российских и Международных конференциях, конкурсах работ молодых ученых. Защита кандидатских диссертаций Молодые ученые и студенты, приняли участие в конференции Ломоносов-2018, в 28 Менделеевской конференции (Новосибирск, май 2018г.), аспиранты Комкова М.А. и Карпова Е.В. стали победителями конкурса Умник-2017. Сделано по 6 докладов на международной конференции по электроанализу (Родос, Греция) в июне 2018 г. и IV конференции “Биотехнология: наука и практика” (Мисхор, Крым). Руководитель гранта Карякин А.А. (приглашенный доклад) и молодые ученые Комкова М.А. и Андреев Е.А. приняли участие в Совещании Международного электрохимического общества (Болонья, Италия). Никитина В.Н. участвовала в 38 Международной конференции по современным электрохимическим методам в Чехии (май, 2018 г.). Андреев Е.А. - победитель конкурса грантов РНФ для молодых ученых (2018 г.), Комкова М.А. – победитель конкурса грантов РФФИ для молодых ученых (2018 г). Студентка Вера Шавокшина (4 курс) получила повышенную академическую стипендию за успехи в учебе и научной работе. В 2018 году были представлены и прошли защиту диссертации: Комкова М.А. “Наноразмерные пленки и наночастицы катализаторов на основе гексацианоферратов переходных металлов для высокоэффективных (био)сенсоров”. Никитина В.Н. “Электрохимические cенсоры на сахара и гидроксикислоты на основе поли(аминофенилборных кислот) “.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".