| Результаты этапа: На основании литературных данных подобран и отработан оптимальный протокол нанесения адгезионного покрытия на плёнку [Carpi, Piel, 2014; Nestor-Bergmann и др., 2019]. В качестве адгезионного покрытия выбран фибронектин человека с конечной концентрацией 1 мг/мл (кат. номер: H Fne-C, ООО «Имтек») [Davidson и др., 2002; Ramos, DeSimone, 1996]. Для этого вырезали фрагмент сверхтонкой эластичной плёнки Gel-Pak PF-40-X0 с необходимыми геометрическими размерами, снимали защитный слой и с помощью пинцета переносили плёнку в пластиковую чашку Петри с 70% этанолом, после чего инкубировали в течение 10 минут на качалке для удаления остатков липкого основания защитного слоя. Затем плёнку переносили в сухую крышку чашки Петри и сушили под ламинаром. После полного высыхания спирта плёнку облучали под УФ-лампой ламинара на расстоянии 3 см от лампы в течение 30 минут для гидрофилизации поверхностного слоя. Затем в центральную часть каждой плёнки наносили по 4 аликвоты в 10 мкл фибронектина человека с концентрацией 1 мг/мл и оставляли инкубироваться на ночь при +4°С. На следующий день удаляли избыток раствора фибронектина, устанавливали на плёнку бортики из PDMS с помощью силиконовой смазки (Dow Corning High Vacuum Grease), и заливали получившуюся камеру 1x MMR. Крышу бластоцеля эмбрионов X. laevis эксплантировали на стадии 10-10 ½ [Faber, Nieuwkoop, 1994], затем переносили в инкубационную камеру и аккуратно прижимали покровным стеклом на силиконовых ножках, после чего инкубировали в течение двух часов для стимуляции адгезии к матриксу. Эффективность прикрепления эксплантатов определяли по ослаблению адгезии при растяжении камеры на 20% с помощью специально разработанной для данного проекта установки для автоматизированной одноосевой деформации эластичных субстратов (в период действия гранта на установку был зарегистрирован патент #2723726, см. «4. Файлы»). Мы установили, что при выбранных концентрации фибронектина и протоколе его нанесения на субстрат в подавляющем большинстве случае эксплантаты сохраняют адгезию после растяжения, однако растяжение субстрата передаётся на эксплантаты с эффективностью 54,7%±26,5% что, в целом, согласуется с описанными в литературе данными (от 56% до 77,2±20,4% [Nestor-Bergmann и др., 2019; Wang и др., 2001]). Указанные результаты доложены в виде стендового доклада в рамках XVIII конференции-школы c международным участием «АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ».
Одной из ключевых задач проекта является сравнение движений клеток в механически деформированных эксплантатах с аналогичными движениями в нормальном развитии. Чтобы охарактеризовать клеточные движения и результирующие деформации в нормальном развитии X. laevis осуществили прижизненную съемку клеточных движений в эпиэктодермы дорсальной области интактных эмбрионов на стадиях 10,5 (средняя гаструла) и 14-15 (ранняя нейрула). Для визуализации клеточных границ осуществили инъекцию мРНК мембранного (GAP43-GFP) и ядерного (H2B-mCherry) маркёров в презумптивную дорсальную область эмбрионов на стадиях от 2х до 4х бластомеров. После инъекции эмбрионов культивировали до нужной стадии, после чего осуществили in vivo съёмку движений клеток с помощью ЛКСМ Olympus FluoView 10i, незначительно модифицировав описанный ранее протокол [Kieserman и др., 2010]. На полученных фотографиях с помощью ПО EpiTools 2.1.6. [Heller и др., 2016] распознавали границы клеток и производили морфометрию.
Цейтраферную съемку дорсальной области осуществляли в течение одного часа с интервалом в 1 минуту. Анализ движений клеток в дорсальной области средней гаструлы выявил тенденцию к ускорению клеточных движений отдельных групп клеток с ростом сонаправленности их смещений и, наоборот, замедлению движений при снижении сонаправленности. При этом в соседних группах могут в один и тот же момент времени наблюдаться противоположные по эффекту тенденции. Также, нам удалось зарегистрировать момент, когда тенденции в соседних регионах меняются на противоположные. Данное явление требует дальнейшего подтверждения на более крупной выборке, однако оно представляет потенциальный фундаментальный интерес, так как может объяснить принципиальную возможность существования стадиеспецифичного распределения сил в контексте активных морфогенетических движений [Beloussov, Dorfman, Cherdantzev, 1975]. Указанные результаты подготовлены к публикации в виде статьи «Морфометрическое исследование пространственно-временной динамики деформаций эмбриональной ткани при морфогенетических движениях» в журнале «Онтогенез».
Анализ движений клеток на стадии ранней нейрулы произвели в двух областях эмбриона: туловищной и головной. Цейтраферную съёмку осуществляли с интервалом в 1 минуту в течение 20 минут в обеих зонах. Мы определили этот интервал как достаточный для регистрации ключевых изменений в морфологии клеток, т.к. сравнение эксцентриситета клеток на 80 и 20 минутах наблюдения не выявило статистически достоверных различий. Проанализировав изменение формы интегрального ROI, включающего все распознанные клетки эмбриона, а также ориентацию движений клеток вдоль антеропостриорной оси, мы установили, что интегральное ROI головной области в ходе наблюдения не меняет длины в антеропостериорном направлении, но испытывает латеральное сжатие, а в ходе наблюдения трансляционно смещается в антериорном направлении из поля зрения микроскопа. При этом, латеральное сжатие вместе с постоянной длиной большой оси интегральной области интереса сопровождается уменьшением апикальной поверхности клеток примерно на 16-17%. Так как апикальное сокращение клеток поверхностных клеток X. laevis является изометрическим [Keller, 1981], полученные данные свидетельствуют в пользу того, что укорочение головной области в антеропостериорном направлении испытывает механическое противодействие. ROI в туловищной области, напротив, при аналогичном по амплитуде латеральном сжатии претерпевает выраженное удлинение в антеропостериорном направлении, не смещаясь при этом из поля зрения. В то же время мы обнаружили статистически значимое увеличение среднего эксцентриситета клеток во время наблюдения только в области туловища, в то время как апикальная площадь подавляющего большинства клеток в этом месте не изменилась. Последнее указывает на то, что зарегистрированное увеличение эксцентриситета в случае туловища связано с удлинением клеток. Это удлинение совпадает с преобладающей ориентацией больших осей клеток параллельно антеропостериорной оси. Таким образом, зарегистрированные деформации и клеточные движения позволяют сделать вывод о наличии механической силы в нервной пластинке, которая растягивает туловищную область. |
| Результаты этапа: В рамках проекта планировалось количественно описать параметры механического воздействия, инициирующего (механозависимые) коллективные клеточные движения, продемонстрировать их кооперативность, детально изучить пространственно-временные паттерны микродеформаций, возникающие при наблюдаемых коллективных клеточных движениях. Для этих целей была применена методика по искусственной деформации эксплантатов эмбриональной ткани.
Для осуществления экспериментов по искусственной деформации эксплантатов эмбриональной ткани применяли разработанную в нашей лаборатории установку для автоматизированной одноосевой деформации (патент RU2723726C1, изготовлено ООО «Троицкий инженерный центр», Россия), которая осуществляла растяжение эластичной инкубационной камеры, дно которой представляло собой ультратонкую (100-200 мкм) прозрачную мембрану с адгезионным покрытием из белков внеклеточного матрикса. Адгезионное покрытие обеспечивало прикрепление эксплантата к дну камеры и, соответственно, передачу растяжения от субстрата к эксплантату. На основании литературных данных подобран и отработан оптимальный протокол нанесения адгезионного покрытия на субстрат инкубационной камеры [Carpi, Piel, 2014; Nestor-Bergmann и др., 2019]. Отработанный протокол детально изложен в разделе «Методы и подходы, использованные при реализации проекта». Эффективность методики растяжения оценили на 6 тестовых группах эксплантатов. Эффективность прикрепления эксплантатов рассчитывали, как частное среднего удлинения в группе из 4-6 эксплантатов и удлинения самой инкубационной камеры. Амплитуда растяжения камеры для всех групп была одинакова и составляла 20% при времени растяжения 10 секунд. При выбранных концентрации фибронектина и протоколе его нанесения растяжение субстрата передаётся на эксплантаты с эффективностью 54,7%±26,5% что, в целом, согласуется с описанными в литературе данными (от 56% до 77,2±20,4% (Nestor-Bergmann et al., 2019; Wang et al., 2001)). Регистрация движений клеток производили на эксплантатах, для которых эффективность растяжения была не менее 50%.
В ходе выполнения проекта было запланировано исследовать параметры механического воздействия - скорость, амплитуду и время механической деформации - инициирующие механозависимые коллективные клеточные движения. Предложенный в заявке диапазон значений этих параметров был пересмотрен в пользу значений, обладающего физиологической значимостью. Для этого на основании литературных данных мы подобрали в качестве референсного значения скорости деформации такое, которое соответствовало бы наблюдаемому в нормальном развитии. Согласно данным, полученным ранее в нашей лаборатории, физиологически корректное значение скорости деформации составляет 72%/час (Evstifeeva et al., 2018). Скорость деформации связывает амплитуду в временем деформации, поэтому фиксированное значение скорости деформации позволяет более корректно варьировать остальные два параметра.
Начальной величиной времени растяжения мы выбрали 10 минут, так предыдущие исследования установили, что при деформации в течении большего времени эксплантат начинает релаксировать экспериментальное растяжение (Beloussov et al., 2000; Troshina et al., 2011). Это может свидетельствовать о начале перегруппировок клеток. Исходя из выбранного нами референсного значения скорости растяжения, времени растяжения в 10 минут соответствует деформация эксплантата в 12%. При 50-60% эффективности методики растяжения, для получения подобной амплитуды деформации эксплантата инкубационную камеру необходимо деформировать на 20%. Мы проверили калибровочный эксперимент с выбранными параметрами, после чего изменяли время растяжения (5/15/20 минут) при фиксированной амплитуде деформации инкубационной камеры в 20%, а затем варьировали амплитуду деформации инкубационной камеры (10%/30%/40%) при фиксированном времени деформации в 10 минут.
Время деформации в 10 минут и 20% амплитуда деформации камеры оказались минимально необходимыми для инициации движений клеток в эксплантате. В данном случае, под движениями мы понимаем как перегруппировки клеток (единичное смещение клетки внутри пласта, приводящее к изменению положения клетки относительно соседних), так и направленную миграцию (продолжительное перемещение в выделенном направлении).
Перегруппировки клеток превалировали в центральной части всех исследованных эксплантатов. Основным механизмом перегруппировки являлось формирование клеточных розеток. При этом частота перегруппировок была достаточно низкой: за час наблюдения нам удалось зарегистрировать формирование и начало распада 2-3 розеток, в то время как в нормальном развитии количество возникающих розеток за тоже время наблюдения достигает 9. Направленные движения клеток наблюдали в эксплантате, если тот имел правильную форму, а ось растяжения совпадала с длинной осью эксплантата. В таком эксплантате 4-5 рядов клеток в периферической зоне эксплантата осуществляли миграцию в радиальном направлении, т.е. вдоль оси, соединяющей центр эксплантата с периферией. При этом, наиболее активные движение миграции происходили в на латеральных границах эксплантата, что привело к её смещению на 60 мкм (~3 клеточных диаметра). Клетки на медиальной границе эксплантата также демонстировали подвижность, однако, мигрирующий край практически не смещался относительно изначального положения. Таким образом, преимущественно миграция происходила в направлении растяжения.
Таким образом, нами выявлены пороговые значения скорости, амплитуды и времени механической деформации, необходимые для инициации механозависимых движений клеток.
Одной из ключевых задач проекта является сравнение движений клеток в механически деформированных эксплантатах с аналогичными движениями в нормальном развитии. Чтобы охарактеризовать клеточные движения и результирующие деформации в нормальном развитии X. laevis осуществили прижизненную съемку клеточных движений в эпиэктодермы дорсальной области интактных эмбрионов на стадиях 10,5 (средняя гаструла). На основании данных съёмки произвели детальное количественное описание движений клеток в эпиэктодерме СБО гаструлы X. laevis. Мы обнаружили, что низкая скорость смещения клеток наблюдается одновременно с низкой сонаправленностью движений и, наоборот, при высокой скорости движений клеток наблюдали высокую сонаправленность их смещений. При этом, распределение скоростей и направлений смещения клеток внутри исследуемой области оказалось пространственно неоднородным. Эта неоднородность приводит к региональным различиям средней скорости и сонаправленности движений клеток вдоль медиолатеральной оси. Чтобы установить, сопровождаются ли обнаруженные региональные различия внутритканевыми деформациями, мы проанализировали динамику формы клеток в выделенных регионах. Нам не удалось выявить статистически значимых различий между формой клеток в начале и в конце наблюдения как в целом по эмбриону, так и внутри отдельных регионов. Однако анализ формы клеток позволил выявить множество клеточных структур, называемых розетками. Подобные структуры являются промежуточным этапом специфических, пространственно ориентированных переупаковок клеток. В среднем, за час цейтраферной съёмки средней СБО гаструлы мы регистрировали в среднем 9 розеток. Более половины их них (в среднем, около 7) были локализованы в медиальной зоне СБО. Анализ распада розеток позволил установить, что в ходе этого процесса домен клеток, образующих розетку, начинает удлиняться в направлении антериопостериорной оси. Мы предполагаем, что подобные перестройки компенсируют растяжение материала СБО в ходе процесса инволюции. Именно поэтому розетки превалируют в медиальном регионе СБО, который первым вовлекается в процесс инволюции.
Таким образом, в данной работе впервые описана пространственная неоднородность движений клеток, которая может служить потенциальным источником глобальных деформаций в СБО бесхвостых амфибий. Дальнейшее исследование этого процесса позволит изучить механизм поддержания стадиеспецифических паттернов механических сил в эмбриогенезе. |
