| Результаты этапа: 1) для исследования ультраструктуры хроматиновых доменов в процессе репликации и пост-репликативной реорганизации был разработан оригинальный подход, основанный на комбинации технологии ChromEMT (Ou et al, 2017) и Nanogold-мечения новосинтезированной ДНК (Deng et al, 2016). Изначально предполагалось протестировать возможность использование методов Click-мечения с последующей детекцией флуоресцентной метки при помощи антител против флуорофоров (Жиронкина и др, 2015) после глутаральдегидной фиксации живых клеток, необходимой для оптимальной сохранности нативной структуры хроматина. Выяснилось, что глутаральдегидная фиксация не интерферирует с проведением Click-реакции и как следствие, лиганды, присоединяемые к EdU в ходе реакции, не маскированы и доступны для детекции. Однако, тестовые эксперименты показали, что данный подход не может быть реализован в полной мере из-за диффузионных барьеров, возникающих в результате интенсивного кросслинкинга ядерных структур. В результате наблюдаются выраженные градиенты интенсивности мечения от периферии к центру ядра. Поэтому в дальнейшем мы переключились на использование биотинилированного азида с последующей детекцией стрептавидин-Nanogold. Данный метод оказался менее чувствительным к глутаральдегидной фиксации благодаря меньшим размерам зонда и одноступенчатому протоколу детекции. При этом сохранялась высокая интенсивность мечения, сопоставимая с таковой, наблюдаемой на предварительно пермеабилизованных образцах после формальдегидной фиксации.
Для совмещения описанного протокола с процедурой ChromEMT (включая последующую электронную томографию) был оптимизирован метод Ag-амплификации с Au-импрегнацией, чтобы получить частицы меньшего размера (не более 15 нм), устойчивые к окислению в процессе осмификации продуктов фото-окисления диаминобензидина (Ou et al, 2017). В результате удалось стандартизировать все ключевые параметры многоступенчатого процесса детекции, обеспечивающие удовлетворительный электронный контраст ДНК в сочетании с высокой плотностью мечения новосинтезированной ДНК на фоне оптимальной сохранности ультраструктуры хроматина. Полученные образцы (срезы толщиной до 300 нм) были предварительно проанализированы при помощи одноосевой электронной томографии с применением энергетической фильтрации электронов, которая показала равномерное распределение метки в объеме хроматиновых доменов, дополнительно подтвердив высокую проницаемость компактизованного хроматина для использованных зондов. Был также разработан алгоритм анализа томограмм для автоматического измерения линейных параметров репликативно-меченых доменов хроматина. Алгоритм основан на сегментации 3D-карт локальных плотностей распределения Ag-наночастиц с последующим построением карт расстояний до границы сегментированных областей. Данный метод позволил оценить линейные параметры структур сложной формы, вычленив фибриллярные компоненты диаметром около 120 нм, соответствующие хромонемному уровню компактизации хроматина. В дальнейшем данный подход будет использован для ультраструктурного анализа эффектов мутаций когезинового комплекса на организацию хроматиновых доменов;
2) для количественного анализа влияния мутаций в генах, кодирующих компоненты когезинового комплекса и их регуляторы, на пострепликативную реорганизацию хроматина разработаны алгоритмы на основе методов машинного обучения, позволяющие автоматически дискриминировать паттерны репликации, выявляемые при помощи мечения EdU и Click-химии. В качестве исходных данных алгоритм использует экваториальные оптические срезы ядер, полученные при помощи микроскопии структурированного облучения (SIM). Первичный анализ изображений проводился в пакете CellProfiler 3.0, обучение программы распознавания паттернов проводили в интерактивном режиме в программе CellProfiler Analyst, автоматическую классификацию и статистический анализ осуществляли в программе Orange, используя алгоритм случайного леса после исключения негативных по EdU клеток из анализа, применения алгоритма иерархической кластеризации Уорда для автоматического разделения 1 и 2 паттернов репликации и коррекции параметров глубины построения деревьев. В результате многоступенчатого обучения была достигнута 97% вероятность корректного определения паттерна репликации в контрольной рандомизированной выборке. Данный подход будет в дальнейшем использоваться для автоматического анализа эффектов мутаций компонентов когезинового комплекса на пост-репликативную реорганизацию высших уровней компактизации ДНК;
3) получены клеточные линии на основе мышиных клеток линии NIH-3T3, экспрессирующие TALE-GFP, связывающиеся с последовательностями главного сателлита мыши. Данные линии планируется использовать для оптимизации методов недеструктивного таргетного мечения хромосомных доменов для электронномикроскопического анализа. Предварительные эксперименты с использованием pre-embedding иммуноокрашивания с помощью Nanogold-меченых антител против GFP (любезно предоставлены A.S.Belmont) продемонстрировали высокую эффективность мечения с оптимальным соотношением сигнал/шум и равномерное распределение метки в объеме хромоцентров, что указывает на хорошую проницаемость компактизованных хроматиновых доменов для используемых зондов. Данная модель будет использована для дальнейшей оптимизации протоколов мечения с целью применения для детекции малокопийных и уникальных хромосомных локусов.
4) для нокдауна хромосомных белков при помощи РНК-интерференции созданы плазмиды на основе вектора pgShin, кодирующие шпилечные РНК против Smc3 и регулятора когезии Wapl. Плазмиды также кодируют eGFP, что позволяет проводить микроскопический анализ эффектов нокдауна целевых белков в гетерогенных клеточных популяциях;
5) для визуализации малокопийных и уникальных хромосомных локусов, с целью амплификации сигнала при детекции методами флуоресцентной и электронной микроскопии были созданы генетические конструкции, кодирующие MCP-6His, MCP-Snap-Tag и MCP-eGFP. Эти конструкции будут в дальнейшем использоваться в комбинации с CRISPR/dCas и гидовой РНК, несущей множественные MS2-повторы (Quin et al, 2017). |
