ИСТИНА

Пыльца и споры растений – один из основных компонентов биологических аэрозолей и, одновременно, одна из основных причин аллергических заболеваний. По данным ВОЗ, от них страдает более 20% населения земного шара, в первую очередь жители мегаполисов экономически развитых стран. Обязательным элементом комплекса противоаллергических мероприятий является аэробиологический мониторинг, позволяющий отслеживать и прогнозировать динамику концентрации основных аллергенов в атмосфере, корректировать терапию и образ жизни больных поллинозами. Стандартным методом идентификации пыльцы в образцах воздуха является метод световой микроскопии. Этот метод обладает рядом ограничений, одно из наиболее существенных - невозможность провести видовую идентификацию пыльцы в образцах воздуха. Необходим более эффективный и чувствительный метод идентификации пыльцы в сложных по составу смесях, позволяющий точно определять источник аллергенного белка в атмосфере, что может иметь решающее значение в современной персонализированной медицине при внедрении в аллергологическую практику компонент-специфической диагностики. Таким методом может стать ДНК-штрихкодирование, позволяющее проводить качественный (на уровне вида или рода) и количественный анализ смесей биологического происхождения. Использование ДНК-штрихкодирования в аэробиологии началось в последние 3-4 года (Kraaijeveld et al, 2015; Mohanty, Buchheim, Levetin, 2017; Leontidou et al, 2017; Ghitarrini et al, 2018), однако до настоящего времени удовлетворительные результаты не были получены. В России аэробиологические исследования с применением параллельного высокопроизводительного секвенирования (ПВС) для идентификации состава биологических аэрозолей не проводились. Предлагаемый проект направлен на разработку протоколов выделения и идентификации ДНК пыльцы из проб воздуха и оценку их эффективности для пыльцевого мониторинга атмосферы. Отработку методики предлагается провести на основе анализа пыления злаков, пыльца которых сходна морфологически, но обладает разной аллергенной активностью. В работе будет использован метагеномный анализ образцов с помощью высокопроизводительного секвенирования ДНК-штрихкодов (маркеров) trnL-F, ITS и ETS на приборах второго поколения (Illumina). Также впервые будет исследована возможность создания экспресс-технологии анализа проб пыльцы с помощью секвенирования на платформе третьего поколения Oxford Nanopore. Результаты анализа будут сопоставлены с данными аэробиологического и фенологического мониторинга.

Pollen and spores are one of the main components of biological aerosols and, at the same time, one of the main causes of allergic diseases. According to the WHO, more than 20% of the world's population suffers from them, primarily residents of megapolises of economically developed countries. An obligatory element of anti-allergic strategy is aerobiological monitoring, which allows you to track and predict the dynamics of the concentration of major allergens in the atmosphere, correct the therapy and lifestyle of patients with pollinosis. The standard method of pollen identification in air samples is light microscopy. This method has several limitations; one of the most significant is the inability of species identification on the base of pollen morphology. It is necessary to develop a more effective and sensitive method for identification of pollen in complex mixtures, which allows one to determine accurately the source of allergenic protein in the atmosphere. Precise identification is extremely important in modern personalized medicine, in allergology this approach is based on the component-resolved diagnosis. The problems of species identification can be solved by DNA barcoding, which allows not only identify but also make quantitative analysis of biological mixtures. DNA barcoding in aerobiology started to use in the last 3-4 years (Kraaijeveld et al, 2015; Mohanty, Buchheim, Levetin, 2017; Leontidou et al, 2017; Ghitarrini et al, 2018), but to date, satisfactory results have not been obtained. In Russia, aerobiological studies using DNA barcoding were not carried out. The proposed project aims to develop protocols for the isolation and identification of pollen DNA from air samples and to evaluate their effectiveness for pollen monitoring of the atmosphere. Pollination of Poaceae will be used as test-system: grass pollen is morphologically similar, but different species have different allergenic activity. We propose a metagenomic analysis of samples using high-performance sequencing of trnL-F, ITS and ETS DNA barcodes (markers) on devices of the second generation (Illumina).For the first time there will be investigated the express technology of analysis of pollen samples using sequencing on the third generation platform Oxford Nanopore. The results of the analysis will be compared with the data of aerobiological and phenological monitoring.

1 год Создание референсной базы (выделение ДНК из живых или гербарных референсных образцов) Подбор праймеров для ETS Закладка пробных площадей для фенологических наблюдений, оценка на этих пробных площадях видового состава злаков и их обилия. Определение пыльцевой продуктивности основных видов злаков средней полосы. Отработка методики расчета фенологического индекса с учетом реальных значений пыльцевой продуктивности. Аэробиологический мониторинг при помощи волюметрических пыльцевых ловушек (Москва Рязань) Отбор образцов воздуха для секвенирования (Москва и Рязань) Отработка методики смыва пыльцы с лент пыльцевых ловушек на материале, отобранном в Москве летом 2019г. и весной 2020г. Секвенирование отобранных аэробиологических образцов, анализ результатов

Участники рабочего коллектива имеют опыт по всем планируемым направлениям исследований и доступ ко всему необходимому для проведения проекта оборудованию. В двух точках наблюдений – Москве и Рязани – станции аэробиологического мониторинга существуют длительное время, в Москве с 1992 г., в Рязани – с 2007 г. В 2015-2018 гг были проведены исследования, направленныена определение региона, отраженного в составе пыльцевого спектра, выявления зависимости состава спектра от высоты установки пыльцевой ловушки и оценки влияния локальной растительности на его состав. В 2018 году в Москве были начаты предварительные исследования, направленные на детализацию кривой пыления злаков. В настоящий момент отработана методика описания фенологического состояния злаков, собран материал для оценки их пыльцевой продукции, опробована методика расчета фенологического индекса. В течение вегетационных сезонов 2018 и 2019 были опробованы разные методики отбора аэробиологических проб для ДНК-штрихкодирования . Д.Омельченко, А.Криницына, А.Сперанская имеют большой опыт в проведении молекулярно-биологических исследований, владеют необходимыми навыками для проведения работ по выделению ДНК из пыльцы растений, постановке ПЦР, созданию ДНК-библиотек для секвенирования. А.Касьянов имеет большой опыт в разработке биоинформатических баз данных и метагеномном анализе. Он участвовал в разработке базы данных HOCOMOCO и TRAVA, в проекте de novo сборки генома C. bursa-pastoris и de novo сборки транскриптомов F.tatricum и F.esculentum. Д.Омельченко, А.Криницына, А.Сперанская и А.Касьянов выступали в качестве исполнителей в проекте по разработке методик для анализа видового состава пищевой продукции растительного происхождения с помощью высокопроизводительного секвенирования, успешно завершенного в 2019 году, где в частности получили опыт работы с выделением, секвенированием ДНК и анализом пыльцы в составе продуктов питания (мёд).

1. Будет создана референсная библиотека последовательностей генетических маркеров trnL-F, ITS и ETS для видов злаков, наиболее распространенных в средней полосе России. Создание референсной библиотеки предполагается завершить на первом этапе реализации проекта. 2. Будут проверены и оптимизированы условия для амплификации ETS в сложных смесях 3. Будет охарактеризована внутригеномная и внутри- и межвидовая изменчивость маркерных участков исследованных видов, будут выбраны оптимальные пороги для идентификации 4. Будет проведен анализ проб воздуха, собранных в двух точках в течение основного периода пыления злаков в 2020-2022 годах с помощью двух методов – палинологического и молекулярного (меташтрихкодирование). Результаты исследования будут сопоставлены с данными фенологических наблюдений. 6. Будет получен детализированный (на уровне видов и родов) усредненный за три года календарь пыления злаков средней полосы России. 6. Будет предложен протокол отбора, выделения и видовой идентификации пыльцы в аэробиологических образцах методом ДНК-штрихкодирования.