ИСТИНА

В результате взаимодействия кислорода с триплетным возбужденным состоянием фотосенсибилизаторов (ФС) образуются активные формы кислорода (АФК), которые оказывают деструктивное воздействие на различные компоненты клетки. Данное явление лежит в основе фотодинамической терапии опухолей и фотодинамической инактивации микроорганизмов. В настоящее время наиболее часто в качестве фотосенсибилизаторов (ФС) применяются соединения тетрапиррольного ряда. Однако небольшие значения сечения поглощения ФС в районе 400 – 600 и 700 – 1100 нм препятствуют использованию значительной части видимой и инфракрасной (ИК) областей спектра для осуществления фотодинамического эффекта. Ранее нашим коллективом был отработан подход к решению данной проблемы за счет создания гибридных комплексов, в которых наночастица выполняет роль светособирающей антенны, увеличивая эффективное сечение поглощение ФС. Это позволяет значительно повысить выход АФК в экспериментах in vitro, однако, эффективность фотодинамического действия гибридной системы зависит не только от сочетания фотофизических параметров и энергетического взаимодействия наночастицы и ФС, определяемых структурой комплекса, но и возможностью его доставки. В рамках данного проекта нами будет изучены возможности функциональной модификации оболочки наночастицы для решения двух задач: (1) доставки молекул фотосенсибилизатора во внутриклеточные компартменты опухолевых клеток и (2) обеспечение взаимодействия со структурами биопленок, сформированных бактериями. В первом случае для создания и исследования свойств таких конструкций будет использован трансферрин и клетки эпидермоидной карциномы человека А431. Особое внимание будет уделено изучению эффектов фото- и цитотоксичности отдельных компонентов и целых гибридных систем. Для повышения тропности к бактериальным клеткам к оболочкам наночастиц будут привиты катионные группы. В экспериментах на модели полнослойной раны мыши будут получены данные о влиянии разработанных гибридных систем на основе квантовых точек и фотосенсибилизаторов на регенерацию инфицированных ран кожи. С помощью оптических методов будет изучен процесс доставки и фотодинамические свойства ФС в составе гибридных комплексов. Результаты проекта могут быть использованы для разработки препаратов направленного действия на основе наночастиц для антибактриальной и противоопухолевой терапии.

As a result of the interaction of oxygen with the triplet excited state of photosensitizers (PS), reactive oxygen species (ROS) are formed, which have a destructive effect on various components of the cell. This phenomenon underlies the photodynamic therapy of tumors and the photodynamic inactivation of microorganisms. Currently, tetrapyrrole compounds are most often used as photosensitizers (PS). However, small values ​​of the FS absorption cross section in the region of 400 - 600 and 700 - 1100 nm prevent the use of a significant part of the visible and infrared (IR) spectral regions for the realization of the photodynamic effect. Earlier, our team worked out an approach to solve this problem by creating hybrid complexes in which the nanoparticle plays the role of a light-harvesting antenna, increasing the effective cross-section for PS absorption. This makes it possible to significantly increase the yield of ROS in in vitro experiments; however, the efficiency of the photodynamic action of the hybrid system depends not only on the combination of photophysical parameters and energetic coupling of the nanoparticle and PS determined by the structure of the complex, but also on the possibility of its delivery. Within the framework of this project, we will study the possibilities of functional modification of the nanoparticle shell to solve two problems: (1) the delivery of photosensitizer molecules to cancer cells and (2) the cells of microorganisms. In the first case, transferrin and a model of human epidermoid carcinoma will be used to create and study the properties of such structures. Particular attention will be paid to studying the effects of photo- and cytotoxicity of individual components and entire hybrid systems. To increase tropism for bacterial cells, cationic groups will be added to the surface of nanoparticle. In experiments on a model of a full-layer mouse wound, the effect of biofilms formed from Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus strains on the rate of wound healing and regeneration of skin tissues, and features of the interaction of nanoparticles with biofilms wil be studied. Using optical methods, the delivery process and the photodynamic properties of PSs in hybrid complexes will be studied. Project results can be used in biomedical applications.

Целью проекта является создание и изучение функциональных свойств гибридных конструкций на основе углеродных наночастиц и фотосенсибилизаторов для фотодинамической и противомикробной терапии. Для достижения цели нам необходимо решить следующие задачи: 1. Синтезировать наночастицы с заданными спектральными характеристиками и функционализировать оболочку наночастицы для оптимизации взаимодействия с (1) клетками эпидермоидной карциномы человека линии А431 и (2) биоплёнками, сформированными бактериями Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. 2. Произвести сборку гибридной структуры из функционализированной наночастицы и фотосенсибилизатора (на основе хлорина е6) и охарактеризовать её спектральные характеристики и способность к генерации активных форм кислорода in vitro. 3. Изучить процесс интернализации и внутриклеточное распределение наночастиц и гибридных комплексов, функционализированных трансферрином, в клетках эпидермоидной карциномы человека А431. Провести исследование их цитотоксичности и оценить эффективность фотодинамического действия. 4. Гистологическими и иммунофлуоресцентными методами провести сравнительные исследования деградации бактериальных пленок и заживления кожи в модели инфицированной биопленками полнослойной раны кожи мыши без воздействия и под воздействием гибридных конструкций на основе углеродных наночастиц и фотосенсибилизаторов.

Флуоресцентные наночастицы, включая КТ, сами по себе обладают уникальными оптическими свойствами и являются многообещающими донорами энергии электронного возбуждения, способными осуществлять безызлучательный перенос энергии возбуждения на различные акцепторные молекулы по индуктивно-резонансному механизму (FRET). Наиболее эффективным инструментом исследования переноса энергии является метод флуоресцентной спектроскопии высокого временного разрешения. В нашем распоряжении имеется созданная с участием исполнителей настоящего проекта Максимова Е.Г. и Гвоздева Д.А. комбинированная установка, позволяющая регистрировать мгновенные и стационарные спектры образцов КТ. Технические характеристики данной установки позволяют одновременно регистрировать флуоресценцию донора и акцептора энергии, что дает возможность оценивать не только параметры тушения донора, но и вычислять коэффициент усиления флуоресценции акцептора. С помощью данного метода удалось изучить особенности переноса энергии в гибридных комплексах флуоресцентных наночастиц и таких молекул, как фталоцианины (Фц), белки (аллофикоцианин, АФЦ) и белковые комплексы, входящие в состав фотосистем цианобактерий. Установлено, что КТ образуют стабильные комплексы с АФЦ в водных растворах, проведена дополнительная стабилизация гибридных структур за счет ковалентного химического связывания, что приводило к 20-кратному усилению флуоресценции АФЦ при возбуждении КТ. Обнаруженный эффект предоставляет новые возможности для практического применения гибридных систем в качестве флуоресцентных маркеров, гибридных фотосенсоров, элементов гибридных фотопреобразующих ячеек. Особенно подчеркнем, что мы были одними из первых, кто получил гибридные структуры типа КТ-РЦ, за счет электростатических взаимодействий и КТ-АФЦ за счет ковалентного химического связывания.

Будут созданы гибридные структуры на основе углеродных квантовых точек, покрытых полимерной оболочкой, и фотосенсибилизаторов – производных хлорина е6. Для задач фотодинамической терапии раковых заболеваний полимерная оболочка наночастиц будет модифицирована векторными молекулами (например, трансферрин). В таком случае, мы ожидаем увеличение эффективности фотодинамического действия гибридной структуры на опухолевые клетки (эпидермоидной карциномы человека А431) за счет: а) специфичности препарата к опухолевым клеткам, б) увеличения скорости проникновения гибридной структуры внутрь опухолевых клеток и в) высокой скорости генерации активных форм кислорода при освещении клеток актиничным светом. Для задач фотодинамической инактивации микроорганизмов полимерная оболочка наночастиц будет иметь положительных заряд, способствующий связыванию гибридной структуры с отрицательно заряженной поверхностью бактериальной клеточной стенки. Мы ожидаем получить выраженный фотодинамический эффект, оказываемый разработанными нами гибридными структурами на основе квантовых точек и фотосенсибилизаторов, для элиминации опухолевых клеток, а также добиться деградации биопленок под действием этих гибридных структур в моделях инфицированных полнослойных ран кожи мыши, что повлияет на скорость и качество регенерации модельных ран. Таким образом, будет реализована концепция «фотосенсибилизатора третьего поколения», имеющего широкие перспективы применения в различных областях медицины. В процессе создания гибридных структур будут определены ключевые параметры, определяющие эффективность их фотодинамического действия, что позволит осуществлять направленный поиск компонентов для оптимизации гибридных структур на их основе.