![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Эффективное заражение вирусом целого растения является важнейшим этапом патогенеза. Центральную роль в этом процессе выполняет дальний или системный транспорт вируса по проводящей системе растения, который включает перенос транспортной формы вирусного генома через систему специализированных клеток в ситовидные элементы флоэмы, транспорт с током ассимилятов и выход через ту же систему клеток в обратном направлении в клетки мезофилла и эпидермиса незараженного листа. Механизмы, вовлеченные в этот процесс, изучены недостаточно даже для такой популярной модели как тобамовирусы. Известно, что для транспорта тобамовирусов по флоэме необходим белок оболочки, а транспортной формой является вирион. В настоящее время детерминанты дальнего транспорта выявлены в составе вирусной репликазы и предположены в составе транспортного белка, тогда как роль белка оболочки определяется исключительно сборкой вирусной частицы. Учитывая многофункциональность вирусных белков, представляется маловероятным, что активность белка оболочки в дальнем транспорте ограничивается только структурной функцией. Основной целью данного проекта является поиск детерминант дальнего транспорта в составе белка оболочки тобамовирусов, прежде всего для вируса табачной мозаики, и выявление клеточных белков партнеров, вовлеченных в транслокацию вируса по флоэме, на основании характеристики интерактомов белка оболочки ВТМ дикого типа и мутантных вариантов. Планируется также оценить транскриптомы флоэмного эскудата незараженных и инфицированных тобамовирусом растений. Реализация проекта позволит расширить знания о механизмах системного транспорта палочковидных спиральных вирусов, как со стороны вирусных белков, так и со стороны их клеточных партнеров, и определить новые подходы для создания растений, устойчивых к вирусным инфекциям.
Поиск детерминант дальнего транспорта в составе белка оболочки тобамовирусов, прежде всего для вируса табачной мозаики, и выявление клеточных белков партнеров, вовлеченных в транслокацию вируса по флоэме, на основании характеристики интерактомов белка оболочки ВТМ дикого типа и мутантных вариантов. Планируется также оценить транскриптомы флоэмного эскудата незараженных и инфицированных тобамовирусом растений. Реализация проекта позволит расширить знания о механизмах системного транспорта палочковидных спиральных вирусов, как со стороны вирусных белков, так и со стороны их клеточных партнеров, и определить новые подходы для создания растений, устойчивых к вирусным инфекциям.
Исполнителями проделана большая работа по характеристике поверхностных структурных эпитопов белка оболочки ВТМ в составе вириона. Исполнители обладают инфекционными кДНК копиями нативного и химерного вируса табачной мозаики U1 и различных мутантных вариантов вируса (содержащих мутации в гене белка оболочки ВТМ), которые, согласно нашим предположениям, могут иметь влияние на системный транспорт вирусов. На основании анализа литературных данных, в качестве таких участков были выбраны поверхностно расположенные фрагменты БО ВТМ, а именно N- и С-концевые участки, а также поверхностная центральная петля. Проведены предварительные эксперименты по изучению влияния вышеописанных мутаций белка оболочки ВТМ на протекание вирусной инфекции: мутантными вариантами вирусов заражены растения Nicotiana benthamiana и оценена скорость развития симптомов. Большое число публикаций членов нашего коллектива за последние 5 лет на тему исследования вирусов и их взаимодействия с растением-хозяином, опубликованных в отечественных и международных научных изданиях (в том числе и высокорейтинговых) также указывает на существенный задел коллектива в исследуемой области. Участники проекта имеют значительный опыт работы в изучении белков, участвующих в процессах вирусного патогенеза, опыт работы по колокализации вирусных белков и клеточных ядерных/ядрышковых белков in vivo и анализу взаимодействий между клеточными и вирусными белками in vivo и in vitro.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 14 марта 2016 г.-20 декабря 2016 г. | Особенности дальнего транспорта мутантных вирусов табачной мозаики с делециями в составе С-конца белка оболочки. |
Результаты этапа: В процессе вирусной инфекции роль белка оболочки (БО) ВТМ, весьма вероятно, не ограничивается формированием вириона, транспортной формы тобамовирусов для системного транспорта, а включает взаимодействия с хозяйскими факторами. Основной целью первого года проекта было определение детерминант системного транспорта тобамовирусов, не связанных с формированием вирионов. С использованием полной инфекционной кДНК копии ВТМ штамма U1 получены три мутантных варианта ВТМ с последовательными делециями трех консервативных элементов в гене БО, кодирующем С-концевой участок этого белка: в мутантных БО отсутствуют 20 (ВТМdelYNR), 15 (ВТМdelFE) и 9 аминокислотных остатков (ВТМdelLV), соответственно. Агроинфильтрация растений N.benthamiana полученными конструкциями показала, что симптомы вирусной инфекции, включая хлороз, деформацию листьев и появление некрозов, выявляются в случае всех трех мутантных вариантов ВТМ. Наиболее выраженные симптомы характерны для варианта с максимальной делецией С-концевого участка БО. Однако по сравнению с инфекцией растений ВТМ дикого типа эти симптомы носят менее суровый характер и, в целом, наблюдается заметная задержка развития системной инфекции растений. Оценка эффективности заражения по накоплению РНК ВТМ на разных стадиях инфекции с помощью ОТ-ПЦР показала, что синтез мутантных вирусных РНК (репликация вируса) в инфильтрированных листьях по сравнению с инфекцией растений ВТМ дикого типа ниже не менее, чем в 2 раза (ВТМdelYNR) и не менее, чем в 5 раз (ВТМdelFE и ВТМdelLV). Существенно, что в системных листьях зараженных растений уровень накопления мутантных вирусных РНК был на порядок ниже по сравнению с уровнем накопления РНК ВТМ дикого типа. Предположено, что мутантные варианты БО, лишенные С-конца, могут влиять на различные этапы вирусной инфекции, в частности, на репликацию вирусной РНК и возможно, на образование транспортных комплексов и межклеточный транспорт и опосредованно на дальний транспорт, а также способствовать экспонированию детерминанты патогенности в коровой части БО. Полученные результаты указывают на многофункциональность С-концевого неупорядоченного участка в составе БО ВТМ. | ||
2 | 16 марта 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Особенности дальнего транспорта мутантных вирусов табачной мозаики с делециями в составе С-конца белка оболочки. |
Результаты этапа: Считается, что белок оболочки (БО) палочковидного тобамовируса табачной мозаики (ВТМ) абсолютно необходим для системного транспорта, поскольку наиболее вероятной транспортной формой тобамовирусов, компетентной для дальнего транспорта, являются вирионы. Роль БО ВТМ в дальнем транспорте не ограничивается формированием транспортно компетентной формы. Одной из возможных функций, выполняемых БО тобамовирусов в процессе дальнего транспорта, является его роль как белка-адаптора для взаимодействия с хозяйскими факторами в процессе развития системной инфекции. Поверхностно экспонированный С-концевой участок БО ВТМ, возможно, является важным для протекания успешной вирусной инфекции. С использованием полной инфекционной кДНК копии ВТМ штамма U1 мы получили мутантные варианты ВТМ с делециями в гене БО, соответствующими С-концевом участку БО ВТМ. На данном этапе работы были получены три мутантных варианта ВТМ. У мутанта с наибольшей делецией – delYNR были удалены 20 аминокислотных остатков с 138 а.о., у мутанта deltaTSG – удалены 6 а.о. и мутанта deltaPAT – удалены 3 а.о.. Полученные инфекционные кДНК копии ВТМ в бинарном векторе, несущие мутантные гены БО, использовали для заражения растений N.benthamiana методом агроинфильтрации листьев. Оценка симптомов и молекулярно-биологических особенностей вирусной инфекции показала, что только делеция 3-х С-концевых аминокислотных остатков не влияет на характеристики вирусной инфекции, которые полностью соответствуют характеристикам инфекции ВТМ дикого типа, включая симптомы, эффективность межклеточного и системного транспорта, уровень РНК ВТМ в инфицированных и системных листях и образование вирионов. Все остальные делеции приводят к полному ингибированию инфекции, поскольку в инфицированных листьях не удалось обнаружить ни вирусную РНК, ни мутантные БО или вирионы. Наиболее вероятными является предположение об ингибировании репликации вирусной РНК и/или угнетении межклеточного (ближнего) транспорта вируса. Таким образом, полученные на данном этапе результаты свидетельствуют о том, что внутренне неупорядоченный С-концевой участок БО ВТМ или кодирующая его последовательность включает функциональные детерминанты/детерминанту, необходимые для успешной вирусной инфекции растений. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".