| 1 |
15 января 2020 г.-30 декабря 2020 г. |
Физиологическое влияние и значимость структурных перестроек в аппарате трансформации энергии при переходе к экстремофилии |
| Результаты этапа: Последние достижения в области биоэнергетики позволили определить основания для процветания ряда микробов в средах с экстремальной соленостью, щелочностью и буферной емкостью. Сочетание многочисленных экспериментальных подходов, в том числе, прямого метода визуализации транспорта натрия с помощью радиоизотопного анализа с использованием 22-Na и косвенных методов с использованием эффектов ионофоров и разобщителей, привело нас к решению этой проблемы. С их помощью мы обнаружили у этих микробов функционирование ранее предсказанного нового дыхательного фермента, натрий-перекачивающую цитохромоксидазу, которая устраняет проблему низкого содержания дельта-мю H+, образующегося в жестких щелочных условиях, и эффективно преобразует энергию в благоприятное значение дельта-мю Na+.
Несмотря на четкие доказательства активности такого фермента в микробах, в которых он был обнаружен, возможный механизм его действия, казалось, было трудно объясним. Мы использовали последние данные генетических экспериментов, филогенетического анализа, рентгенографии и молекулярно-динамических расчетов для решения этой проблемы. Данные о полном опероне натрий-перекачивающей цитохромоксидазы, который мы секвенировали в ходе этого исследования, и рентгеновский анализ кристаллов высокогомологичной протон-перекачивающей цитохромоксидазы, выполненный группой Х. Михеля (Buschmann et al., 2010), позволили нам реконструировать трехмерную структуру нового фермента. Таким образом, была разрешена загадка контактов аминокислотных остатков 13 альфа-спиралей каталитической субъединицы нового фермента между собой в трехмерном пространстве. Кроме этого, моделирование структуры субъединиц нового фермента позволила определить такие важные биохимические свойства субъединиц как pI, что в совокупности с приведенными ниже данными других структурных особенностей дает ключ к пониманию механизмов адаптации бактерии к условиям обитания, характеризующимся одновременно двумя экстремальными показателями - крайне щелочными рН и близкими к насыщающим концентрациями солей натрия.
В ходе выполнения этапа проведена иммунодетекция и идентификация этой Na+-перекачивающей цитохром-с-оксидазы, являющейся продуктом оперона ccoNOQP. С помощью кроличьих поликлональных антител, полученных на предсказанную С-концевую аминокислотную последовательность каталитической субъединицы, показано, что оксидаза cbb3-типа синтезируется в клетках бактерии и локализуется в её мембранах; субъединица оксидазы с мол. массой 48 кДа является каталитической, СcoN; субъединицы с мол. массами 29 и 34 кДа, СcoO и СcoP, соответственно, являются цитохромами с. Определены теоретические значения pI субъединиц СcoN, СcoO и СcoP. Показано, что части субъединиц CcoO и CcoP, экспонированные в водную фазу на P-стороне цитоплазматической мембраны клеток, обогащены отрицательно заряженными аминокислотными остатками, в отличие от граничащих с водной фазой частей интегральной субъединицы CcoN. Сделано заключение, что таким образом, Na+-перекачивающая цитохром-с-оксидаза T. versutus, как по функции, так и по структуре демонстрирует приспособленность к экстремально щелочным условиям. |
| 2 |
15 января 2021 г.-30 декабря 2021 г. |
Физиологическое влияние и значимость структурных перестроек в аппарате трансформации энергии при переходе к экстремофилии |
| Результаты этапа: Обитатели содовых озер, Thioalkalivibrio versutus, являются гало- и алкалифильными бактериями, которые, как было ранее показано, дышат с помощью впервые продемонстрированной Na+-транслоцирующей цитохром-с-оксидазы (CO). Фермент генерирует натрий-движущую силу (дельта s) величиной -270 мВ на плазматической мембране бактерий. Однако у этих бактерий работа возможных дельта s-потребителей, которые могли бы замкнуть круговорот Na+ в плазматической мембране и образовать Na+-энергетический цикл, не была доказана. Нами получены подвижные клетки, которые использованы для изучения возможного Na+-энергетического цикла у этих бактерий. Полученная подвижность активировалась протонофором в соответствии с таким же эффектом на клеточное дыхание и, наоборот, полностью блокировалась ингибитором Na+-активируемого флагеллярного мотора амилоридом. Добавление аскорбата к неподвижным голодающим бактериальным клеткам запускало опосредованное цитохромоксидазой дыхание и подвижность бактерий, причем оба показателя демонстрировали одинаковую зависимость от концентрации натрия и нечувствительность к арсенату. Мы пришли к выводу, что у T.versutus Na+-транслоцирующая СО и Na+-активируемый флагеллярный мотор работают в режиме Na+-энергетического цикла.
Результаты согласуются с гипотезой об энергетической стратегии алкалифилов, а также объясняют экологические предпочтения T.versutus. Известно, что эти бактерии приурочены к узкой зоне, называемой хемоклином. Наши данные позволяют предположить, что натриевый энергетический цикл, образованный цитохром оксидазой и флагеллой, служит механизмом, с помощью которого бактерии удерживаются в этой зоне при наличии натрия и высокощелочного рН среды. |
| 3 |
11 января 2022 г.-29 декабря 2022 г. |
Физиологическое влияние и значимость структурных перестроек в аппарате трансформации энергии при переходе к экстремофилии |
| Результаты этапа: Результаты наших исследований:
1. Экспериментально продемонстрировано, что бактерии Thioalkalivibrio из щелочных высокосолёных содовых озёр обладают флагеллярным мотором Na+-типа.
2. У T. versutus Na+-транслоцирующая цитохром-с-оксидаза и флагеллярный мотор Na+-типа работают в режиме натриевого энергетического цикла.
3. Получено объяснение а) процветанию натронофильных бактерий в условиях низкого дельта p на их мембранах и б) компенсации бактериями гораздо более высоких энергетических затрат для выживания в суровых экстремальных условиях.
4. Результаты исследования проливают свет на энергетическую причину приуроченности этих бактерий к узкой зоне хемоклина и процветания в экстремальных условиях содовых озер. |
