ИСТИНА

Трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода, генерируемая на мембране митохондрий в результате окисления субстратов дыхания, является основным источником энергии для синтеза АТФ. Это было доказано, в первую очередь, с помощью действия разобщителей - соединений, вызывающих диссипацию мембранного потенциала путем облегчения трансмембранной диффузии протонов и приводящих тем самым к разобщению окисления и фосфорилирования в митохондриях. В ряде работ было обнаружено, что слишком высокий уровень мембранного потенциала может явиться причиной развития патологических процессов в клетках. Стало ясно, что умеренная степень разобщения может быть полезна в терапевтических целях. Однако, известные в настоящее время разобщители обладают высокой токсичностью. Необходимость решения этой проблемы делает актуальным тщательное исследование механизмов действия протонофорных разобщителей на уровне клеточных органелл (митохондрий) и клеток. Есть основания предполагать, что действие разобщителей на митохондриях существенно отличается от их действия на искусственных бислойных липидных мембранах. Например, согласно некоторым данным, разобщающее действие динитрофенола опосредовано взаимодействием с белком внутренней мембраны митохондрий АДФ/АТФ-транслокатором. С другой стороны, до сих пор не выяснен детальный механизм разобщающего действия жирных кислот, которое осуществляется при участии так называемого разобщающего белка (uncoupling protein) митохондрий. Ранее было обнаружено, что разобщающее действие жирных кислот связано также с работой АДФ/АТФ-транслокатора. Настоящий проект направлен на выяснение молекулярного механизма участия белков в процессе разобщения окислительного фосфорилирования под действием протонофоров, а также создание и характеристику малотоксичных разобщителей на основе так называемых проникающих катионов. Эти соединения, типичным представителем которых является тетрафенилфосфоний, многократно накапливаются в митохондриях благодаря наличию мембранного потенциала. Будут синтезированы и опробованы три ряда веществ – ряд арил-замещенных производных NBD (4-амино-7-нитро-бензоксодиазола), коньюгаты известных анионных разобщителей с трифенилфосфонием и ряд производных родамина 123. В различных системах (плоские липидные мембраны, липосомы с реконструированными белками, выделенные митохондрии) будут исследованы их протонофорные и разобщающие свойства, а также способность к энергозависимому накоплению в митохондриях. Предварительные данные указывают на то, что катионные разобщители имеют существенно большее окно между концентрациями, вызывающими разобщение, и концентрациями, которые уже являются токсичными для митохондрий и клеток.

Transmembrane electrochemical potential difference of hydrogen ions generated at the inner mitochondrial membrane as a result of oxidation of respiratory substrates is the primary source of energy for ATP synthesis. This was proven mainly by the action of uncouplers - compounds causing dissipation of membrane potential by facilitating transmembrane diffusion of protons and thereby leading to uncoupling of oxidation and phosphorylation in mitochondria. A series of studies indicated that excessive generation of membrane potential may cause the development of pathological processes in cells. It became clear that a moderate degree of uncoupling may be useful for therapeutic purposes. However, currently known uncouplers are highly toxic. To overcome this problem, a thorough study of mechanisms of protonophoric uncoupler operation in mitochondria and whole cells is required. A substantial body of evidence allows us to assume that the action of uncouplers on mitochondria significantly differs from their effect on the conductance of artificial bilayer lipid membranes. For example, according to some reports, the uncoupling action of dinitrophenol is mediated by interaction with the inner mitochondrial membrane protein ADP / ATP translocator. On the other hand, the detailed mechanism of the uncoupling effect of fatty acids, which is mediated by the mitochondrial uncoupling protein, has not been clarified yet. Previously, it was found that the uncoupling action of fatty acids is also associated with the operation of ADP / ATP translocator. This project aims to clarify the molecular mechanism of proteins participation in uncoupling of oxidative phosphorylation by protonophores, as well as the design and study of low-toxic uncouplers synthesized on the basis of the so-called penetrating cations. Such cations, e.g., tetraphenylphosphonium, multiply accumulated in mitochondria due to the driving force of the membrane potential. We plan to synthesize and test three series of substances – a number of N-aryl-substituted derivatives of NBD (4-N '- (4-alkylphenyl) amino-7-nitro-benzoxodiazol), conjugates of known anionic uncouplers with triphenylphosphonium, and a series of rhodamine 123 derivatives. We will examine their protonophoric and uncoupling properties in a variety of systems (planar bilayer lipid membranes, liposomes with reconstituted proteins, isolated mitochondria), as well as their ability to energy-dependent accumulation in mitochondria. Preliminary data indicate that cationic uncouplers possess a substantially larger window between the concentrations that cause uncoupling and those that are already toxic to cells and mitochondria.

Будут синтезированы и опробованы три ряда веществ – ряд арил-замещенных производных NBD (4-амино-7-нитро-бензоксодиазола), коньюгаты известных анионных разобщителей с трифенилфосфонием и ряд производных родамина 123. В различных системах (плоские липидные мембраны, липосомы с реконструированными белками, выделенные митохондрии) будут исследованы их протонофорные и разобщающие свойства, а также способность к энергозависимому накоплению в митохондриях. Путем ингибиторного анализа будет изучено участие различных митохондриальных белков в разобщающем действии как известных, так и вновь синтезированных протонофоров. Новые соединения будут оценены как потенциальные препараты против ожирения, диабета второго типа, и целого ряда других тяжелых патологий.

У нашей группы имеется существенный задел по работе над проектом. Он касается как публикаций, так и методов химического синтеза и изучения функциональной активности. Из опубликованных нами работ, которые лежат в основе настоящего проекта, следует, в первую очередь, выделить нашу статью в J.Biol.Chem. (Antonenko et al., 2011). Она описывает синтез и свойства эфиров родамина 19, которые накапливаются в митохондриях потенциал-зависимым образом и оказывают разобщающее действие. Другой важной недавней работой нашей группы, опубликованной в Chemical Communications, является синтез и характеристика mitoFluo – коньюгата флуоресцеина и децил-трифенилфосфония (Denisov et al., 2014). Выше были описаны основные экспериментальные методы, которые поставлены у нас в лаборатории. Помимо этого можно выделить следующие наиболее важные результаты экспериментальных работ коллектива, которые найдут применение в заявленном проекте. Нами обнаружено, что додециловый и октиловый эфиры флуоресцеина проявляют протонофорное действие на липидных мембранах и оказывают разобщающее действие на митохондрии (Shchepinova et al.,BBA-Bioenergetics, 2014). Было показано, что рН-зависимость работы катионного протонофора имеет зеркальный вид по отношению к работе анионного протонофора. Выражается это в том, что катионный протонофор хорошо переносит протоны при щелочных рН, в то время как анионные протонофоры работают в диапазоне более кислых pH (Rokitskaya et al., Europ. Biophys. J., 2013). Энергозависимое накопление эфиров родамина 19 существенно зависело от длины алкильного хвоста (Antonenko et al., J.Bioenerg.Biomembr., 2012), причем если при малой длине хвоста такое накопление было хорошо выражено, то с ростом гидрофобности энергозависимость накопления во многом терялась. Она опять появлялась при добавлении липосом, которые конкурировали с мембранами митохондрий за связывание таких липофильных родаминов.

За время работы по проекту с 2016 по 2018 гг. были синтезированы и исследованы несколько перспективных новых соединений, которые проявляли протонофорные свойства и разобщали окислительное фосфорилирование на изолированных митохондриях. Сравнительное изучение протонофорной активности соединений, полученных путем коньюгирования флуоресцеина с катионной группировкой трифенилфосфония, позволило выявить значение длины углеводородного линкера. Одним из наиболее значительных достижений нашей работы стало получение mitoCCCP - коньюгата катиона децилтрифенилфосфония с известным протонофором карбонилцианианид-м-хлорфенилгидразоном (СССР). Впервые удалось присоединить митохондриально-направленную катионную группу к классическому протонофорному разобщителю так, чтобы он не потерял своей разобщающей активности. Показано, что mitoСССР в микромолярных концентрациях повышает скорость дыхания и значительно снижает мембранный потенциал митохондрий, выделенных из печени крысы. Кроме того, mitoСССР индуцирует набухание митохондрий в среде с ацетатом калия, что говорит о протонофорной природе действия данного соединения. Достигнутый нами успех был связан с проведением тщательной работы по созданию и структурно-функциональному изучению нескольких серий разобщителей, а именно конъюгатов алкилтрифенилфосфониев с обладающими способностью к депротонированию флуоресцирующими красителями, такими как флуоресцеин и аминопроизводное нитробензоксодиазола (NBD). Эти соединения, наряду с разобщающей активностью, как и ожидалось, обнаружили способность энергозависимо накапливаться в митохондриях, о чем можно было судить по их яркой флуоресценции. Исследовано участие белковых переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающей активности ряда соединений, синтезированных на первом этапе проекта, а именно: ряда N-арил-замещенных производных NBD (4-N’-(4-алкилфенил)амино-7-нитро-бензоксодиазолов) и в первую очередь, наиболее эффективного из них - C6-фенил-NBD. В частности, изучено возможное участие аспартат-глутаматного антипортера в разобщающем действии производных NBD. С этой целью исследовано влияние субстратов данного переносчика (аспартата и глутамата), а также его ингибитора - диэтилпирокарбоната - на разобщающую активность N-арил-замещенных производных NBD и mito-c10-NBD. Оказалось, что глутамат, аспартат, и ингибитор этого переносчика, диэтилпирокарбонат, эффективно ресопрягают митохондрии как в случае их разобщения под действием C6-фенил-NBD, так и разобщения с помощью mito-c10-NBD. Ранее участие аспартат-глутаматного антипортера было описано только в случае разобщения жирными кислотами (Samartsev et al., 1997). Кроме того, было изучено возможное участие АТФ/АДФ транслокатора (ANT) в разобщающем действии N-арил-замещенных производных NBD, mito-c10-NBD и mito-с10-СССР в экспериментах с использованием ингибитора ANT - карбоксиатрактилозида (Катр): Катр частично снимал разобщающее действие C6-фенил-NBD, но был неэффективен в случае mito-c10-NBD и mito-с10-CCCP. В рамках данного проекта проделана большая работа по изучению протонофорной активности триклозана, результаты которой позволили пересмотреть современное представление о механизмах антибактериального действия этого известного биоцида, в частности показать существенный вклад разобщающей активности триклозана в его антибактериальное действие. Существенным результатом работы по проекту явилось также обнаружение высокой антибактериальной активности разобщающих агентов на основе NBD, в особенности конъюгатов NBD с децилтрифенилфосфонием.