ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода, генерируемая на мембране митохондрий в результате окисления субстратов дыхания, является основным источником энергии для синтеза АТФ. Это было доказано, в первую очередь, с помощью действия разобщителей - соединений, вызывающих диссипацию мембранного потенциала путем облегчения трансмембранной диффузии протонов и приводящих тем самым к разобщению окисления и фосфорилирования в митохондриях. В ряде работ было обнаружено, что слишком высокий уровень мембранного потенциала может явиться причиной развития патологических процессов в клетках. Стало ясно, что умеренная степень разобщения может быть полезна в терапевтических целях. Однако, известные в настоящее время разобщители обладают высокой токсичностью. Необходимость решения этой проблемы делает актуальным тщательное исследование механизмов действия протонофорных разобщителей на уровне клеточных органелл (митохондрий) и клеток. Есть основания предполагать, что действие разобщителей на митохондриях существенно отличается от их действия на искусственных бислойных липидных мембранах. Например, согласно некоторым данным, разобщающее действие динитрофенола опосредовано взаимодействием с белком внутренней мембраны митохондрий АДФ/АТФ-транслокатором. С другой стороны, до сих пор не выяснен детальный механизм разобщающего действия жирных кислот, которое осуществляется при участии так называемого разобщающего белка (uncoupling protein) митохондрий. Ранее было обнаружено, что разобщающее действие жирных кислот связано также с работой АДФ/АТФ-транслокатора. Настоящий проект направлен на выяснение молекулярного механизма участия белков в процессе разобщения окислительного фосфорилирования под действием протонофоров, а также создание и характеристику малотоксичных разобщителей на основе так называемых проникающих катионов. Эти соединения, типичным представителем которых является тетрафенилфосфоний, многократно накапливаются в митохондриях благодаря наличию мембранного потенциала. Будут синтезированы и опробованы три ряда веществ – ряд арил-замещенных производных NBD (4-амино-7-нитро-бензоксодиазола), коньюгаты известных анионных разобщителей с трифенилфосфонием и ряд производных родамина 123. В различных системах (плоские липидные мембраны, липосомы с реконструированными белками, выделенные митохондрии) будут исследованы их протонофорные и разобщающие свойства, а также способность к энергозависимому накоплению в митохондриях. Предварительные данные указывают на то, что катионные разобщители имеют существенно большее окно между концентрациями, вызывающими разобщение, и концентрациями, которые уже являются токсичными для митохондрий и клеток.
Transmembrane electrochemical potential difference of hydrogen ions generated at the inner mitochondrial membrane as a result of oxidation of respiratory substrates is the primary source of energy for ATP synthesis. This was proven mainly by the action of uncouplers - compounds causing dissipation of membrane potential by facilitating transmembrane diffusion of protons and thereby leading to uncoupling of oxidation and phosphorylation in mitochondria. A series of studies indicated that excessive generation of membrane potential may cause the development of pathological processes in cells. It became clear that a moderate degree of uncoupling may be useful for therapeutic purposes. However, currently known uncouplers are highly toxic. To overcome this problem, a thorough study of mechanisms of protonophoric uncoupler operation in mitochondria and whole cells is required. A substantial body of evidence allows us to assume that the action of uncouplers on mitochondria significantly differs from their effect on the conductance of artificial bilayer lipid membranes. For example, according to some reports, the uncoupling action of dinitrophenol is mediated by interaction with the inner mitochondrial membrane protein ADP / ATP translocator. On the other hand, the detailed mechanism of the uncoupling effect of fatty acids, which is mediated by the mitochondrial uncoupling protein, has not been clarified yet. Previously, it was found that the uncoupling action of fatty acids is also associated with the operation of ADP / ATP translocator. This project aims to clarify the molecular mechanism of proteins participation in uncoupling of oxidative phosphorylation by protonophores, as well as the design and study of low-toxic uncouplers synthesized on the basis of the so-called penetrating cations. Such cations, e.g., tetraphenylphosphonium, multiply accumulated in mitochondria due to the driving force of the membrane potential. We plan to synthesize and test three series of substances – a number of N-aryl-substituted derivatives of NBD (4-N '- (4-alkylphenyl) amino-7-nitro-benzoxodiazol), conjugates of known anionic uncouplers with triphenylphosphonium, and a series of rhodamine 123 derivatives. We will examine their protonophoric and uncoupling properties in a variety of systems (planar bilayer lipid membranes, liposomes with reconstituted proteins, isolated mitochondria), as well as their ability to energy-dependent accumulation in mitochondria. Preliminary data indicate that cationic uncouplers possess a substantially larger window between the concentrations that cause uncoupling and those that are already toxic to cells and mitochondria.
Будут синтезированы и опробованы три ряда веществ – ряд арил-замещенных производных NBD (4-амино-7-нитро-бензоксодиазола), коньюгаты известных анионных разобщителей с трифенилфосфонием и ряд производных родамина 123. В различных системах (плоские липидные мембраны, липосомы с реконструированными белками, выделенные митохондрии) будут исследованы их протонофорные и разобщающие свойства, а также способность к энергозависимому накоплению в митохондриях. Путем ингибиторного анализа будет изучено участие различных митохондриальных белков в разобщающем действии как известных, так и вновь синтезированных протонофоров. Новые соединения будут оценены как потенциальные препараты против ожирения, диабета второго типа, и целого ряда других тяжелых патологий.
У нашей группы имеется существенный задел по работе над проектом. Он касается как публикаций, так и методов химического синтеза и изучения функциональной активности. Из опубликованных нами работ, которые лежат в основе настоящего проекта, следует, в первую очередь, выделить нашу статью в J.Biol.Chem. (Antonenko et al., 2011). Она описывает синтез и свойства эфиров родамина 19, которые накапливаются в митохондриях потенциал-зависимым образом и оказывают разобщающее действие. Другой важной недавней работой нашей группы, опубликованной в Chemical Communications, является синтез и характеристика mitoFluo – коньюгата флуоресцеина и децил-трифенилфосфония (Denisov et al., 2014). Выше были описаны основные экспериментальные методы, которые поставлены у нас в лаборатории. Помимо этого можно выделить следующие наиболее важные результаты экспериментальных работ коллектива, которые найдут применение в заявленном проекте. Нами обнаружено, что додециловый и октиловый эфиры флуоресцеина проявляют протонофорное действие на липидных мембранах и оказывают разобщающее действие на митохондрии (Shchepinova et al.,BBA-Bioenergetics, 2014). Было показано, что рН-зависимость работы катионного протонофора имеет зеркальный вид по отношению к работе анионного протонофора. Выражается это в том, что катионный протонофор хорошо переносит протоны при щелочных рН, в то время как анионные протонофоры работают в диапазоне более кислых pH (Rokitskaya et al., Europ. Biophys. J., 2013). Энергозависимое накопление эфиров родамина 19 существенно зависело от длины алкильного хвоста (Antonenko et al., J.Bioenerg.Biomembr., 2012), причем если при малой длине хвоста такое накопление было хорошо выражено, то с ростом гидрофобности энергозависимость накопления во многом терялась. Она опять появлялась при добавлении липосом, которые конкурировали с мембранами митохондрий за связывание таких липофильных родаминов.
За время работы по проекту с 2016 по 2018 гг. были синтезированы и исследованы несколько перспективных новых соединений, которые проявляли протонофорные свойства и разобщали окислительное фосфорилирование на изолированных митохондриях. Сравнительное изучение протонофорной активности соединений, полученных путем коньюгирования флуоресцеина с катионной группировкой трифенилфосфония, позволило выявить значение длины углеводородного линкера. Одним из наиболее значительных достижений нашей работы стало получение mitoCCCP - коньюгата катиона децилтрифенилфосфония с известным протонофором карбонилцианианид-м-хлорфенилгидразоном (СССР). Впервые удалось присоединить митохондриально-направленную катионную группу к классическому протонофорному разобщителю так, чтобы он не потерял своей разобщающей активности. Показано, что mitoСССР в микромолярных концентрациях повышает скорость дыхания и значительно снижает мембранный потенциал митохондрий, выделенных из печени крысы. Кроме того, mitoСССР индуцирует набухание митохондрий в среде с ацетатом калия, что говорит о протонофорной природе действия данного соединения. Достигнутый нами успех был связан с проведением тщательной работы по созданию и структурно-функциональному изучению нескольких серий разобщителей, а именно конъюгатов алкилтрифенилфосфониев с обладающими способностью к депротонированию флуоресцирующими красителями, такими как флуоресцеин и аминопроизводное нитробензоксодиазола (NBD). Эти соединения, наряду с разобщающей активностью, как и ожидалось, обнаружили способность энергозависимо накапливаться в митохондриях, о чем можно было судить по их яркой флуоресценции. Исследовано участие белковых переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающей активности ряда соединений, синтезированных на первом этапе проекта, а именно: ряда N-арил-замещенных производных NBD (4-N’-(4-алкилфенил)амино-7-нитро-бензоксодиазолов) и в первую очередь, наиболее эффективного из них - C6-фенил-NBD. В частности, изучено возможное участие аспартат-глутаматного антипортера в разобщающем действии производных NBD. С этой целью исследовано влияние субстратов данного переносчика (аспартата и глутамата), а также его ингибитора - диэтилпирокарбоната - на разобщающую активность N-арил-замещенных производных NBD и mito-c10-NBD. Оказалось, что глутамат, аспартат, и ингибитор этого переносчика, диэтилпирокарбонат, эффективно ресопрягают митохондрии как в случае их разобщения под действием C6-фенил-NBD, так и разобщения с помощью mito-c10-NBD. Ранее участие аспартат-глутаматного антипортера было описано только в случае разобщения жирными кислотами (Samartsev et al., 1997). Кроме того, было изучено возможное участие АТФ/АДФ транслокатора (ANT) в разобщающем действии N-арил-замещенных производных NBD, mito-c10-NBD и mito-с10-СССР в экспериментах с использованием ингибитора ANT - карбоксиатрактилозида (Катр): Катр частично снимал разобщающее действие C6-фенил-NBD, но был неэффективен в случае mito-c10-NBD и mito-с10-CCCP. В рамках данного проекта проделана большая работа по изучению протонофорной активности триклозана, результаты которой позволили пересмотреть современное представление о механизмах антибактериального действия этого известного биоцида, в частности показать существенный вклад разобщающей активности триклозана в его антибактериальное действие. Существенным результатом работы по проекту явилось также обнаружение высокой антибактериальной активности разобщающих агентов на основе NBD, в особенности конъюгатов NBD с децилтрифенилфосфонием.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 12 мая 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Молекулярный механизм участия белковых переносчиков в процессе разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях под действием протонофорных разобщителей |
Результаты этапа: Известно, что частичное разобщение окислительного фосфорилирования проявляет положительный терапевтический эффект в лабораторных моделях некоторых заболеваний. Путем присоединения гидрофобного катиона трифенилфосфония к флуоресцеину через децильный линкер нами был получен флуоресцентный разобщитель mitoFluo, способный селективно накапливаться в митохондриях. Мы провели сравнительное исследование свойств mitoFluo с его вновь синтезированным аналогом C4-mitoFluo, имеющим короткий (бутильный) линкер. MitoFluo, но не C4-mitoFluo, вызывал сброс мембранного потенциала, приводивший к стимуляции дыхания митохондрий. Огромная разница в разобщающей активности mitoFluo и C4-mitoFluo на выделенных митохондриях соответствовала различию в их протонофорной активности на искусственных БЛМ. Протон-транспортирующая активность mitoFluo продемонстрирована нами также на протеолипосомах с бактериородопсином. Установлено, что достаточно длинный алкильный линкер необходим для создания эффективного митохондриально-направленного разобщителя на основе конъюгатов катионной группировки (трифенилфосфония) с соединениями, обладающими свойствами протонофоров. Обнаружено, что mitoFluo проявляет существенное защитное действие в лабораторных моделях патологий, связанных с окислительным стрессом, например, моделях повреждения мозга и почек. В поисках новых эффективных разобщителей окислительного фосфорилирования мы синтезировали серию 4-ариламино производных 7-нитробенз-2-окса-1,3-диазола (NBD). В нашей недавней работе (Denisov et al., Bioelectrochemistry, 2014) было показано, что конъюгированные с NBD алкиламины обладают разобщающей активностью. Было сделано заключение о том, что неблагоприятные для разобщающей активности значения рКа у этих соединений (около 10) компенсируются повышением липофильности за счет присоединения алкильной цепи. В литературе имеются сведения о том, что введение арильного заместителя в 4-амино-NBD группу приводит к сдвигу рКа в область нейтральных значений. В связи с этим мы синтезировали и изучили свойства ряда 4-ариламино производных NBD, а именно: алкилфенил-амино-NBD (Cn-phenyl-NBD) с различной длиной алкильной цепи Cn. Протонофорная активность Cn-phenyl-NBD при нейтральных pH, оцененная путем измерения электрического тока через плоскую бислойную липидную мембрану, возрастала монотонно от C1- до C6-phenyl-NBD. Все эти соединения увеличивали скорость дыхания и уменьшали мембранный потенциал митохондрий, выделенных из печени крысы. C6-phenyl-NBD в субмикромолярных концентрациях оказывал сильное антибактериальное действие на Bacillus subtilis, которое проявлялось в деполяризации клеточной мембраны бактерий и подавлении их роста. | ||
2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Молекулярный механизм участия белковых переносчиков в процессе разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях под действием протонофорных разобщителей |
Результаты этапа: 1. Впервые синтезирован конъюгат гидрофобного катиона трифенилфосфония (TPP+) с классическим митохондриальным разобщителем карбонил-цианид-м-хлорофенил-гидразоном (CCCP). 2. Синтезирован конъюгат трифенилфосфония (TPP+) с N-пентил-7-нитробензоксадиазолом (mito-c5-NBD). 3. Зарегистрированы протонные токи через плоскую БЛМ, индуцированные конъюгатами трифенилфосфония (TPP+) с N-децил-7-нитробензоксадиазолом (mito-c10-NBD) и N-пентил-7-нитробензоксадиазолом (mito-c5-NBD): оба конъюгата индуцировали электрический ток через БЛМ в условиях фиксации приложенного к мембране напряжения (50 мВ), при этом mito-c10-NBD был в 3-4 раза эффективнее по сравнению с mito-c5-NBD. Добавление флоретина, способного, как известно, снижать дипольный потенциал мембраны, приводило к значительному увеличению тока в случае как mito-c10-NBD, так и mito-c5-NBD. Эти результаты свидетельствуют о том, что проникающими являются катионные формы изучаемых конъюгатов 4. Определена величина рКа mito-c10-NBD в присутствии липосом: она оказалась равной 11,3. 5. С помощью метода флуоресцентной корреляционной спектроскопии показано, что mito-c5-NBD, так же как и mito-c10-NBD, эффективно накапливается митохондриями, причем этот процесс зависит от энергизации митохондрий: добавление классического разобщителя СССР, сбрасывающего мембранный потенциал, приводит к выходу конъюгатов из митохондрий. 6. Показано, что mito-c10-NBD повышает скорость дыхания и значительно снижает мембранный потенциал митохондрий в концентрации около 20 мкМ, в то время как mito-c5-NBD проявляет очень низкую разобщающую активность на выделенных митохондриях печени крысы. 7. Измерения набухания митохондрий в среде с ацетатом калия под действием изучаемых нами новых разобщителей показали, что из ряда N-арил-замещенных производных 7-нитробензоксадиазола, С6-фенил-NBD и С4-фенил-NBD проявляют наибольшую протонофорную активность в митохондриях, гораздо менее активны С1-фенил-NBD и фенил-NBD. 8. Как mito-c10-NBD, так и mito-c5-NBD, индуцировали набухание митохондрий, что свидетельствовало о наличии у них протонофорной активности, при этом mito-c10-NBD был эффективнее mito-c5-NBD, в согласии с данными по действию этих соединений на мембранный потенциал митохондрий и активности в индукции тока на БЛМ. 9. Обнаружено, что глутамат эффективно ресопрягает митохондрии как в случае их разобщения под действием C6-фенил-NBD и C4-фенил-NBD, так и разобщения с помощью mito-c10-NBD, что указывает на вовлечение мембранных белков в разобщающую активность ряда арил-замещенных производных NBD (Cn-фенил-NBD) и mito-c10-NBD в митохондриях. Ранее ресопрягающее действие глутамата было описано только в случае разобщения жирными кислотами. Другой субстрат аспартат-глутаматного антипортера, аспартат, а также ингибитор этого переносчика, диэтилпирокарбонат, также подавляли разобщающее действие C6-фенил-NBD. 10. Изучено возможное участие АТФ/АДФ транслокатора (ANT) в раобщающем действии N-арил-замещенных производных NBD и mito-c10-NBD в экспериментах с использованием ингибитора ANT - карбоксиатрактилозида (Катр): Катр частично снимал разобщающее действие C6-фенил-NBD, но был неэффективен в случае mito-c10-NBD. 11. Показано, что 6-кетохолестанол, агент, способный ресопрягать митохондрии в присутствии FCCP и CCCP, частично снимает разобщающее действие C6-фенил-NBD, но не mito-c10-NBD. 12. Впервые обнаружено, что способность снижать мембранный потенциал выделенных митохондрий печени крысы такими широко применяемыми разобщителями как карбонилцианид-n-трифторметокси-фенилгидразон (FCCP) или динитрофенол (DNP) уменьшается в присутствии миллимолярных концентраций цианида, известного ингибитора цитохром-оксидазы. В этих опытах для энергизации митохондрий использовался АТФ в присутствии ротенона, ингибирующего окисление эндогенных субстратов через комплекс I. Цианид также подавлял действие FCCP и DNP в митохондриях, энергизованных сукцинатом в присутствии феррицианида. Цианид не влиял на протонофорное действие FCCP и DNP на искусственных бислойных липидных мембранах. Причины влияния цианида на активность протонофоров на митохондриях обсуждены в рамках предположения о влиянии конформационного состояния массовых белков мембраны на состояние окружающих липидов. В частности, изменение локальной микровязкости и диэлектрической постоянной может изменять эффективность работы переносчиков-протонофоров. | ||
3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Молекулярный механизм участия белковых переносчиков в процессе разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях под действием протонофорных разобщителей |
Результаты этапа: 1. Cинтезирован конъюгат гидрофобного катиона трифенилфосфония (TPP+) с классическим митохондриальным разобщителем карбонил-цианид-м-хлорофенил-гидразоном (CCCP), имеющий углеводородный линкер из восьми углеродных атомов. 2. Синтезированы дециловый и додециловый эфиры родамина 110 как потенциальные разобщители окислительного фосфорилирования. 3. Зарегистрированы переходные токи через плоскую БЛМ, индуцированные конъюгатом трифенилфосфония (TPP+) и классического разобщителя СССР (mito-c10-СССР), а также коньюгата ТРР+ и NBD: оба конъюгата индуцировали при кислых рН характерную кривую релаксации электрического тока через БЛМ при приложении к мембране напряжения (50-100 мВ). Эти данные качественно соответствуют модели транспорта протонов на mito-c10-CCCP (mito-C10-NBD) в результате циклического транспорта протонированной (катионной) и депротонированной (цвиттерионной) формам данного соединения. 4. Показано, что добавление mito-с10-CCCP приводит к индукции транспорта протонов через мембрану пиранин-содержащих липосом в условиях создания градиента рН на мембране. Сравнение с индукцией транспорта протонов mito-с10-CCCP с СССР показало, что СССР действует при более низких концентрациях, по сравнению с mito-с10-CCCP. 5. Определена величина рКа mito-c10-СССР в присутствии липосом: она оказалась равной 3,7. 6. С помощью метода флуоресцентной корреляционной спектроскопии показано, что mito-с10-BR и mito-c10-eosin, так же как и С10-R110, накапливается в митохондрии, однако этот процесс не зависит от энергизации митохондрий: добавление субстрата дыхания сукцината и классического разобщителя СССР, сбрасывающего мембранный потенциал, не приводит к накоплению и выходу конъюгатов из митохондрий, соответственно. 7. Показано, что mito-c10-СССР повышает скорость дыхания и значительно снижает мембранный потенциал митохондрий в концентрации около 2 мкМ, в то время как mito-c10-BR, mito-c10-eosin, так же С10-R110 проявляет очень низкую разобщающую активность на выделенных митохондриях печени крысы. Показано также, что что mito-c10-СССР повышает скорость набухания митохондрий в среде ацетата калия, что говорит о протонофорной природе действия данного соединения. 8. Показано, что конъюгаты карборана с нейтральным триазолом (c-triazole) и катионом триазолия (c-triazolium) индуцируют протонный транспорт на БЛМ и липосомах, при этом c-triazole был более эффективен. c-triazole был также более эффективен чем c-triazolium при измерении стимуляции скорости дыхания митохондрий и снижению их мембранного потенциала. 9. Показано, что mito-c10-NBD и mito-c5-NBD проявляют антибактериальное действие в субмикромолярных и микромолярных концентрациях, соответственно. Было показано, что рост бактерий Bacillus subtilis сильно замедляется при добавлении mito-c10-NBD или mito-c5-NBD. 10. Показано, что известный антимикробный агент триклозан индуцирует транспор ионов водорода на модельных бислойных липидных мембранах и выделенных митохондриях. Триклозан оказался очень сильным протонофором на БЛМ, так что его действующие концентрации были значительно меньше, чем в случае СССР. В случае выделенных митохондрий, разобщающие концентрации триклозана, которые стимулировали скорость дыхания и снижали мембранный потенциал митохондрий, были примерно на два порядка больше по сравнению с СССР. Таким образом, в случае триклозана имеется явное противоречие между его протонофорным действием на БЛМ и митохондриями (в сравнении с СССР). Был сделан вывод о том, что антибактериальное действие триклозана определяется не только его способностью ингибировать фермент, участвующий в построении клеточной стенки, но и в результате нарушения энергетики бактерий в результате сброса их мембранного потенциала. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".