ИСТИНА

Биогенез рибосом – это сложный и упорядоченный во времени энергоемкий процесс, который оказывает решающее влияние на способность клеток к росту и пролиферации. В ходе выполнения проекта будут получены стабильно трансфецированные клетки линии HEK293 с регулируемым нокдауном одного из факторов биогенеза, в которых будет повышено содержание одного из предшественников пре-рРНК. Будут разработаны методы выделения прерибосомных комплексов из полученных клеточных линий на основе методов субфракционирования ядерных экстрактов в градиенте сахарозы и тандемной аффинной хроматографии. Выполнение проекта будет способствовать расширению фундаментальных знаний о функциональной протеомике ядрышка и биогенезе рибосом и также может стать ключом к разработке более качественных методов лечения рибосомопатий или онкологических заболеваний.

Ribosome biogenesis is a complex and time-consuming energy-intensive process that has a decisive influence on the ability of cells to grow and proliferate. Its initial stages, including rDNA transcription, rRNA processing, and assembly of ribosomal particles, occur in the nucleoli. Yeast studies have provided a wealth of data on the fundamental principles of ribosome assembly, but many traits are not preserved in higher eukaryotes. Many factors of ribosome biogenesis with homologs in yeast appear to have slightly different or additional functions in humans, while the role of many yeast homologs in humans in ribosome biogenesis has not been described, and their relationship with preribosome complexes has not been experimentally confirmed. During of the project, stably transfected HEK293 cells with controlled knockdown of one of the biogenesis factors will be obtained, in which the content of one of the pre-rRNA precursors will be increased. Methods will be developed for the isolation of preribosomal complexes from the obtained cell lines based on the methods of subfraction of nuclear extracts in the sucrose gradient and tandem affinity chromatography. During the study, using mass spectrometry, a proteomic analysis of several complexes of preribosomal complexes containing rRNA, ribosomal proteins and ribosome biogenesis factors will be carried out. The implementation of the plan proposed by the project participants will contribute to the expansion of fundamental knowledge about the functional proteomics of the nucleolus and the biogenesis of ribosomes. Information on the proteomic composition of ribosome precursors will not only expand the scientific understanding of this important cellular process, but can also be the key to developing better methods for treating ribosomopathies or oncological diseases.

В ходе исследования будут получены новые сведения о белково-нуклеиновом составе интермедиатов сборки рибосомных субчастиц. Новые данные создадут возможность разработки подхода к выделению интермедиатов сборки рибосом для структурных исследований. Понимание ключевых стадий процессинга рибосом позволит перейти на новый уровень в поске мишеней для их регуляции, что может быть воспользовано в области создания подходов к терапии рибосомопатий, а также онкологических заболеваний. Полученные в ходе реализации настоящего проекта данные позволят в дальнейшем перейти к разработке системы для выделения интермедиатов сборки рибосом с целью дальнейшего структурного исследования.

Участники проекта обладают опытом в изучении биогенеза сложных рибонуклеиновых комплексов, а также в области регуляции трансляции. Руководитель проекта внес значительный вклад в исследование механизмов биогенеза и функционирования теломеразы человека, а также биосинтеза белка. Один из основных исполнителей имеет опыт работы в области исследования биогенеза рибосом мыши.

Реализация проекта «Анализ белково-нуклеинового состава интермедиатов сборки рибосомных субчастиц в генетически модифицированных клетках человека», поддержанного грантом РФФИ 20-04-00796 А, в течение 3-х лет позволила получить уникальные клеточные линии, которые воспроизводимо демонстрируют характерный фенотип предшественников рибосомных РНК в ответ на нокдаун факторов биогенеза рибосом, что в дальнейшем позволит характеризовать прерибосомные комплексы и детально анализировать влияние каждого из белков на их структурные перестройки. В ходе работы над проектом были обнаружены белки, ранее не описанные в качестве участником биогенеза рибосом, и показано влияние их нокдауна на профиль предшественников рибосомальных РНК. Помимо этого были разработаны подходы, позволяющие, во-первых, провести выделение, очищение, обогащение и субфракционирвоание ядерного лизата и, во-вторых, инкорпорирование в прерибосомные частицы тегированного с помощью полипептида FLAG раннего фактора биогенеза рибосом. Наличие подобных подходов позволит в дальнейшем осуществлять высокоспецифичное выделение прерибосомных частиц с целью их характеризации, а также позволит расширить панель тегируемых белков для описания широкого спектра предшественников рибосом. Также в ходе работы была охарактеризована роль белка SURF6 в биогенезе рибосом. Впервые на клетках высших эукариот была показана связь данного белка преимущественно с предшественником большой 60S субъединицы рибосом, а также описано влияние нокдауна SURF6 на изменения профиля предшественников рибосомных РНК. Также было продемонстрировано, что снижение содержания белка SURF6 не приводит ядрышковому стрессу и p53-зависимому аресту клеточного цикла, что отчасти объясняется более сложной организацией ядрышка у высших эукариот и наличием дополнительных регуляторных путей, которые делают процесс биогенеза рибосом более лабильным в зависимости от условий.