Вирусы растений и искусственные вирусоподобные частицы: изучение биологических и структурных особенностей и использование в биотехнологииНИР

Plant viruses and artificial virus-like particles: a study of the biological and structural features and application in biotechnology

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Вирусы растений и искусственные вирусоподобные частицы: изучение биологических и структурных особенностей и использование в биотехнологии
Результаты этапа: 1. Получение моделей кандидатных вакцин на основе вирионов фитовирусов и вирусоподобных частиц, полученных на их основе. 1.1. Разработка универсальной панели антигенов для вакцины против ротавируса. С использованием консенсусного и консервативного подхода спроектированы антигены ротавируса ΔVP8P[8], ΔVP8P[6], ΔVP8P[4], ΔVP5, 5x12, 875x6 и ΔVP8+875x6. Показано, что коммерческая антисыворотка к ротавирусу не взаимодействует с актуальными последовательностями ΔVP8. Установлено, что рекомбинантные антигены ΔVP8P[8], ΔVP8P[6], ΔVP8P[4] и ΔVP8+875x6 вызывают эффективный иммунный ответ у лабораторных животных при одновременной иммунизации, а иммунизация антигеном ΔVP8+875x6 повышает титры антител к антигену ΔVP5 у лабораторных животных . 1.2. Вектор на основе генома вируса табачной мозаики (ВТМ), содержащий ген белка оболочки кукумовируса, обеспечивает образование стабильных инфекционных икосаэдрических частицы в листьях растений. Изучены биологические свойства и образование вирусных частиц в растении, зараженном химерным вирусом основе генома вируса табачной мозаики (ВТМ) с заменой гена белка оболочки (БО) ВТМ на ген белка оболочки вируса мягкой крапчатой мозаики лиатриса (Gayfeather mild mottle mosaic virus, GfMMV-Mo) - TMVCPGfMMV. Показана схожесть симптоматики при заражении GfMMV-Mo и TMVCPGfMMV. Показано накопление в растениях икосаэдрических частиц, белок которых взаимодействовал с антителами к частицам GfMMV-Mo, продемонстрирована их инфекционность . 1.3. Изучение влияния одновременной генетической модификации терминальных последовательностей БО ВТМ, экспонированных на поверхности частиц, на эффективность дальнего транспорта рекомбинантного вируса и сборку химерных вирионов в растениях. Показано, что эффективность накопления стабильных вирусоподобных частиц с модификацией обеих концевых областей БО ВТМ - N- и C- концевой (TMV-NC-lys) ниже, чем для частиц, модифицированных только с С-конца БО. Отличий по симптоматической картине развития инфекции между векторами с «одинарной» и «двойной» модификацией не выявлено. Показано, что препараты вирионов TMV-NC-lys, выделенных из растений, состоят из жестких палочковидных ВТМ-подобных частиц. 2. Получение новых результатов о структуре и функциональных свойствах белков ряда фитовирусов для выявления их роли в патогенезе и взаимодействии с клеточными белками хозяина. 2.1. Биоинформатический анализ модуля транспортных генов у вирусов растений, содержащих (+)РНК. Показано, что консервативный модуль из трех перекрывающихся генов, называемый «тройным генным блоком» (TGB), присутствует у целого ряда вирусов, принадлежащих к разным семействам и родам, а модули TGB различаются по структурным свойствам кодируемых ими белков. Выявлено два дополнительных класса TGB. 2.2. Исследование белков транспортного блока вируса зеленой пятнистости гибискуса. Исследован новый транспортный модуль вируса зеленой пятнистости гибискуса (Hibiscus green spot virus, HGSV) BMB2. состоящий из двух генов - «бинарный двигательный блок» (BMB). Показано, что второй транспортный белок вируса HGSV BMB2, является интегральным белком ЭПР, вызывает пережатия трубочек ЭПР, имеет сродство к участкам мембран с высокой степенью искривления, транспортируется и накапливается в плазмодесмах, кардинально увеличивая их пропускную способность. Установлено, что BMB2 направляет BMB1 во внутреннюю полость плазмодесм и к соседним клеткам, и что внутриклеточный транспорт BMB2 к сайтам, ассоциированным с плазмодесмами, не задействует секреторный путь, но требует наличия функциональной сети ER/actin. Обнаружены высокомолекулярные комплексы ВМВ2 в растительных клетках. Показано, что образование сужений канальцев ER не является специфическим для BMB2, но также индуцируется белком TGB2 Х-вируса картофеля. 3. Получение данных о распространенности, круге хозяев, антигенных свойствах, генетическом разнообразии и молекулярной гетерогенности российских изолятов экономически важного вируса оспы (шарки) сливы (ВШС), поражающего плодовые культуры для целей планирования ведения безвирусного плодоводства. Показано, что в Европейской части России существует популяция вируса оспы (шарки) сливы (ВШС) (Plum pox virus, PPV), представленная штаммами D, M, Rec, превалирующими в зарубежной Европе, и штаммами W, C, CR и CV, которые практически не встречаются за пределами бывшего СССР (W, C) или обнаружены только в России (CR, CV). На вишне открыт новый штамм вируса CV (Cherry Volga). Показано, что штамм W является генетически самым изменчивым штаммом PPV. Выявлен ряд аминокислотных замен в штаммспецифичном эпитопе 56PATKP60 природных изолятов штамма D, затрудняющих диагностику. Создана насчитывающая около двухсот образцов штаммов D, M, C, CR, CV, Rec, W коллекция российских изолятов PPV в виде лиофилизированного материала. Частичные и полные последовательности геномов новых изолятов PPV депонированы в GenBank.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Вирусы растений и искусственные вирусоподобные частицы: изучение биологических и структурных особенностей и использование в биотехнологии
Результаты этапа: Получение моделей кандидатных вакцин на основе вирионов фитовирусов и вирусоподобных частиц, полученных на их основе. 1.1. Получение и характеристика рекомбинантного антигена вируса болезни Ньюкасла для создания прототипа кандидатной ветеринарной вакцины. Вакцинные штаммы вируса, которые применяются в настоящее время против болезни Ньюкасла (заболевание птиц), генетически сильно удалены от циркулирующих сейчас штаммов вируса болезни Ньюкасла (NDV). Нами был спроектирован рекомбинантный белок Сastle1, содержащий актуальные на данный момент эпитопы поверхностного белка вируса – нейраминидазы - и генетическая конструкция для его экспрессии. Белок Сastle1 был экспрессирован в клетках E. сoli, выделен, очищен и охарактеризован. Показано, что Сastle1 взаимодействует с антисывороткой к цельному вириону NDV. 1.2. Анализ прототипов кандидатной вакцины против COVID-19 и ее компонентов для доклинических исследований Спайковый белок (S-белок) является основным антигеном коронавирусов и эволюционирует быстрее, чем создаются противовирусные вакцины. Нами были получены кандидатные вакцины, содержащие различные рекомбинантные варианты фрагментов спайкового белка коронавируса в качестве антигенов и разработанные ранее на кафедре вирусологии сферические частицы (СЧ) контролируемого размера, полученные при кратковременном нагревании вируса табачной мозаики, в качестве платформы-адъюванта. Кандидатные вакцины против COVID-19 и все их компоненты по отдельности были охарактеризованы с помощью физико-химических методов для доклинических исследований. 1.3. Получение и характеристика антител к рекомбинантным эпитопам белка оболочки вируса желтухи свеклы (ВЖС) Для получения диагностических антител к вирусу желтухи свеклы (ВЖС) с помощью биоинформатических методов была получена трехмерная модель капсида ВЖС и на ней были выделены участки, которые доступны для связывания с антителами. Два таких участка гена белка оболочки ВЖС – были клонированы, экспрессированы в клетках E. coli, рекомбинантные белки выделены, очищены и использованы для иммунизации мышей. В результате получены антитела, которые узнавали положительный контроль к ВЖС. Проблема получения диагностических антител возникла потому, что качество антител, получаемых иммунизацией животных препаратами ВЖС, недостаточно очищенными в силу низкого уровня накопления этого вируса в растениях, или просто целым рекомбинантным белком оболочки ВЖС, в силу расположения многих его эпитопов внутри вириона, характеризуются низкой специфичностью и чувствительностью. 2. Получение новых результатов о структурных и функциональных свойствах белков ряда фитовирусов для выявления их роли в патогенезе и взаимодействии с клеточными белками хозяина. 2.1. Создание на основе модифицированного генома Х-вируса картофеля экспериментальной системы, позволяющей выявлять транспортную функцию кодируемых геномом вируса белков, а также детектировать способность как вирусных, так и растительных белков увеличивать пропускную способность плазмодесм. Транспорт вирусов растений из клетки в клетку через плазмодесмы (ПД) обеспечивается кодируемыми вирусами транспортными белками (ТБ). Первичная структура кодируемого вирусом белка не дает достаточной информации для предсказания потенциальной функции ТБ. Нами была создана простая экспериментальная система на основе модифицированного генома Х-вируса картофеля, позволяющая выявлять транспортную функцию кодируемых геномом вируса белков, а также детектировать способность как вирусных, так и растительных белков увеличивать пропускную способность плазмодесм. 2.2. Влияние экспрессии в листьях растений Nicotiana tabacum хеликазного домена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса табачной мозаики (ВТМ) и других белков растительного и животного происхождения на развитие программируемой клеточной смерти (ПКС). Механизм PCD растений в настоящее время недостаточно изучен и отличается от PCD животных. Устойчивость растений к различным, в том числе вирусным, патогенам может зависеть, в частности, от программируемой клеточной смерти (programmed cell death, PCD), вызывающей появление локальных некрозов (гиперчувствительный ответ) на первично зараженных листьях. Для исследования молекулярных механизмов PCD в растениях была разработана модельная система, предусматривающая временную экспрессию в листьях генов растительного вируса и генов животного происхождения: гена, кодирующего хеликазный домен РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса табачной мозаики (белок 50), и генов человека, кодирующих белки Bax и Bcl-xl. Показано, что белок Bax человека, как и белок р50 ВТМ, способен вызывать в модельной системе реакцию гиперчувствительного ответа. Вектор, кодирующий Bcl-xl, инокулированный в смеси с Вах, напротив, оказывал ингибирующее воздействие на появление признаков PCD в растениях. Для последующего получения диагностических антител рекомбинантные белки р50 и Bcl-xl, клонированы, выделены и очищены. 3. Получение данных о распространенности, круге хозяев, антигенных свойствах, генетическом разнообразии и молекулярной гетерогенности российских изолятов экономически важного вируса оспы (шарки) сливы (ВШС), поражающего плодовые культуры для целей ведения безвирусного плодоводства. Вирус оспы сливы (plum pox virus, PPV) PPV вызывает болезнь, называемую шаркой, которая наносит существенный экономический ущерб. Молекулярно-биологические свойства российских изолятов остаются мало изученными. В результате обследования ряда насаждений, в текущем году выявлено и частично охарактеризовано 15 новых изолятов PPV, относящимся к штаммам C, CR, W, D, и М.
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Вирусы растений и искусственные вирусоподобные частицы: изучение биологических и структурных особенностей и использование в биотехнологии
Результаты этапа: 1. Получение моделей кандидатных вакцин на основе вирионов фитовирусов и вирусоподобных частиц, полученных на их основе. 1.1. Получение и характеристика вакцинного кандидата против SARS-CoV-2 . Создан новый вакцинный кандидат против SARS-CoV-2, содержащий три разных рекомбинантных антигена, включающих в разных сочетаниях рецептор-связывающий домен S-белка (RBD) и два его высоко консервативных участка с использованием белка оболочки вируса табачной мозаики в качестве платформы-адъюванта. Изучена способность рекомбинантных антигенов взаимодействовать с антителами к S-белку SARS-CoV-2 или S-белку SARS-CoV и с сыворотками людей, переболевших COVID-19, показана их способность реагировать с клеточным рецептором вируса - АСЕ2. Показана иммуногенность композиций (СЧ + 3 антигена), их безопасность и протективность. 1.2. Создание и характеристика рекомбинантных антигенов ротавируса для современной вакцины против широкого спектра штаммов ротавируса. Для увеличения универсальности проектируемых вакцин пептид, соответствующий высоко консервативному нейтрализующему эпитопу одного из основных ротавирусных антигенов, эпитоп вирусного белка VP8 “ер8” (1MASLIYRQLL10) был слит с полученными нами рекомбинантными ранее ротавирусными рекомбинантными антигенами - VP8*P[8] и VP8*P[4]. Исследованы антигенные свойства полученных рекомбинантных антигенов в реакции с сыворотками к полевым штаммам ротавируса, циркулирующим на территории РФ, показана их иммуногенность. 2. Получение новых результатов о структурных и функциональных свойствах белков ряда фитовирусов для выявления их роли в патогенезе и взаимодействии с клеточными белками хозяина. 2.1. Создание модельной системы для изучения программируемой клеточной смерти в растениях с использованием гиперчувствительного ответа растения на вирусную инфекцию. Для изучения программируемой клеточной смерти (ПКС) в растительных клетках сделана попытка разработать модельную систему. Получены предварительные результаты: показано, что в данной растительной системе гены человека проапоптотический ген Bax и антиапоптотический ген Bcl-xl сохраняют свой антагонизм, экспрессия гена человека Bcl-xl не влияет на развитие ПКС, связанной с экспрессией вирусного белка р50, а экспрессия гена VPE сама по себе не приводит к развитию ПКС. 2.2. Биоинформатический анализ особенностей геномов некоторых РНК-содержащих вирусов. Проведен биоинформатический анализ геномов плюс-РНК-содержащих вирусов, кодирующих белки семейства SP24, по-видимому, отвечающего за адаптацию к новых хозяевам. В базах данных NCBI выявлены кодирующие SP24-подобные белки вирусы разнообразных таксонов эукариот - плоских червей, бокаловидного червя, моллюсков и губок, а также высших растений и водорослей. Установлены особенности трех типов сигналов проскока слабого терминатора (PRT) в генах РНК полимеразы в вирусных РНК и изучено распространение сигналов сдвига рамки считывания -1 PRF и +1 PRF среди разных групп РНК-содержащих вирусов. 3. Получение данных о распространенности, круге хозяев, антигенных свойствах, генетическом разнообразии и молекулярной гетерогенности российских изолятов экономически важного вируса оспы (шарки) сливы (ВШС), поражающего плодовые культуры для целей ведения безвирусного плодоводства. Определены нуклеотидные последовательности шести новых полных геномов изолятов вируса шарки сливы (plum pox virus, РPV, род Potyvirus, семейство Potyviridae), относящихся к штамму С (PPV-C). На косточковых культурах обнаружены относящиеся к другим семействам следующие вирусы косточковых культур - cherry virus A (CVA), little cherry virus 1 (LChV1), prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) и prune dwarf virus (PDV), представитель группы умбра-подобных вирусов, по-видимому, fig umbra-like virus (FULV). Их геномы были полностью секвенированы, охарактеризованы и депонированы в GenBank. Произведен филогенетический анализ и установлены возможные родственные связи полученных российских изолятов указанных вирусов с ранее известными.
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Вирусы растений и искусственные вирусоподобные частицы: изучение биологических и структурных особенностей и использование в биотехнологии
Результаты этапа:
5 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Вирусы растений и искусственные вирусоподобные частицы: изучение биологических и структурных особенностей и использование в биотехнологии
Результаты этапа:
6 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Вирусы растений и искусственные вирусоподобные частицы: изучение биологических и структурных особенностей и использование в биотехнологии
Результаты этапа:
7 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. Вирусы растений и искусственные вирусоподобные частицы: изучение биологических и структурных особенностей и использование в биотехнологии
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".