Роль цитоскелета в клеточной подвижностиНИР

Role of cytoskeleton in cell motility

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Роль цитоскелета в клеточной подвижности
Результаты этапа: Фокальные контакты (ФК) – сложные белковые комплексы, которые располагаются на базальной поверхности клетки, пронизывают мембрану и обеспечивают физическое взаимодействие цитоскелета и внеклеточного матрикса. Способность ФК распознавать, реагировать и адаптироваться к изменениям в микроокружении служит основой для гипотез, предопределяющих роль ФК в процессе миграции, однако истинное значение молекул, входящих в состав кластера ФК, в обеспечении клеточной подвижности, до сих пор не изучено. К ряду функций ФК, связанных с регуляцией миграции, относятся адгезия, функциональное распределение внутреннего натяжения в клетке и его регуляция (Gardel et al., 2008). Большинство исследований взаимосвязи ФК и миграции посвящены анализу распределения механического усилия и его регуляции со стороны одной или пары сопряженных подсистем: ВКМ–ФК–актин. Таким образом, большинство сведений о взаимосвязи параметров ФК и миграции клеток, лишь косвенно следуют из работ, сосредоточенных на исследовании биофизики механического натяжения в системе клетка-матрикс. При том, что биофизические аспекты миграции изучены достаточно детально, морфологических работ, которые могли бы подтвердить или опровергнуть роль вклада морфологии ФК в миграцию клеток, почти нет. Однозначного ответа на такие простые вопросы как: «существует ли достаточный размер ФК для того, чтобы клетка начала миграцию?» или «какая форма ФК соответствует более высокой подвижности?» не существует. В отношении взаимосвязи натяжения и скорости миграции, в 1991 году была сформулирована математическая модель, описывающая существования оптимума силы адгезии клеток к субстрату, что соответствует наибольшей скорости миграции, при значениях адгезии ниже или выше значения оптимума скорость миграции значительно снижалась (DiMilla, Barbee and Lauffenburger, 1991). В течение следующих 10 лет модель неоднократно подтверждалась в экспериментах с изменением уровня экспрессии интегринов, концентрации компонентов ВКМ или подбора пар интегрин-ВКМ разной аффинности (DiMilla et al., 1993; Sandberg and Huttenlocher, 2016). Кроме того, было показано наличие градиента силы адгезии клетки от ведущего края к хвосту (Schmidt et al., 1993). Объясняется такое поведение тем, что при низкой адгезии слабо связанные с матриксом ФК отрываются от субстрата под действием индуцированного контрактильного ответа клетки. При высокой адгезии силы внтриклеточного сокращения недостаточно для разрыва связи ФК с матриксом. Промежуточные значения силы сцепления клетки с субстратом при этом позволяют миграторному циклу проходить нормально (Gupton and Waterman-Storer, 2006). Однако оставалось неизвестным, физические ли свойства микроокружения или сигналинг со стороны контрактильного аппарата клетки лежат в основе определения оптимума. Вероятно, что оптимизация скорости миграции клеток может происходить за счет пространственно-временной регуляции одновременно, как со стороны актинового цитоскелета, так и со стороны ФК. Для клеток с мезенхимальным типом подвижности было установлено существование оптимального размера ФК, соответствующего наибольшей скорости миграции не было выявлено корреляций, описывающих взаимосвязи морфологии ФК с направленностью движения клеток (Kim and Wirtz, 2013). Известно, что нарушение структуры и регуляции динамики ФК приводит к нарушению нормальной подвижности клеток, что становится причиной развития патологий, таких как, например, хронические воспаления, фиброзы или опухолевый рост и метастазирование (Seetharaman and Etienne-Manneville, 2020). В этом контексте установление взаимосвязи механизмов регуляции динамики структуры ФК и клеточной подвижности важно для разработки новых стратегий диагностики, профилактики и лечения опухолей. Методы Культивирование клеток в основном режиме работы Были использованы выведенные в лаборатории клетки стабильных линий HaCat-vinRFP (спонтанно иммортализованные кератиноциты человека, постоянно экспрессирующие винкулин, конъюгированный с RFP) и A549 (клетки аденокарциномы базального эпителия легких человека, постоянно экспрессирующие винкулин, конъюгированный с RFP). Между пассажами клетки культивировали 2-3 суток в смеси сред DMEM и F12 в соотношении 1:1 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко, Россия) и гентамицина (90 мкг/мл) при температуре 37 оС во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2. Проточная цитофлуорометрия и клеточная сортировка Для снижения гетерогенности внутри популяции по уровню экспрессии винкулина-RFP в клетках линий A549-vinRFP и HaCat-vinRFP использовались методы проточной цитофлуориметрии и клеточной сортировки. По результатам цитофлуорометрического анализа была проведена сортировка клеток на субпопуляции в соответствии с уровнями флуоресценции винкулина-RFP. Были отсортированы клетки линии A549-vinRFP: а) со средним уровнем флуоресценции в канале RFP PE (27% событий с медианным значением флуоресценции 1.68); б) с высоким уровнем флуоресценции в канале RFP PE (15% событий с медианным значением флуоресценции 18.77). Клетки со средним уровнем флуоресценции были вторично отсортированы после экспериментов по РНК-интерференции на две субпопуляции в соответствии со значениями флуоресценции siRNA конструкта, конъюгированного с GFP: а) с низким уровнем флуоресценции в канале GFP FITC (11% событий с медианным значением флуоресценции 252); б) с высоким уровнем флуоресценции в канале GFP FITC (10% событий с медианным значением флуоресценции 5728). РНК интерференция Для нокдауна винкулина в клетках было использовано 2 варианта малых интерферирующих РНК (миРНК). Дизайн производили при помощи BLOCK-iT™ RNAi Designer. Прямые олигонуклеотидные последовательности: 5’-GCGAUACCACAACUCCCAUdTdT-3’ (AUA) 5’-GCGGUUGGUACUGCUAAUAdTdT-3’ (GUU) Трансфекция монослойной культуры производилась 100 pmol миРНК. В качестве трансфецирующего агента, в соответствии с протоколом производителя, был использован TurboFect™ (Thermo Fisher Scientific). Спустя сутки, клетки рассаживались на 35 мм чашки Петри со стеклянным дном для дальнейшего прижизненного наблюдения. Эффективность нокдауна была подтверждена при помощи метода ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени Для определения уровня экспрессии методом ПЦР в реальном времени были получены осадки клеток линии A549 после РНК интерференции и контрольных клеток. Для этого клетки, доведенные до монослоя снимали с помощью 300 мкл 0.05% раствора трипсина-ЭДТА и переносили в 2 мл среды с 0.5% сыворотки. Далее клетки сортировали по уровню сигнала конъюгированного с миРНК флуорофора. Полученные после сортировки суспензии клеток в смеси сыровотки и PBS центрифугировали (1000 g, 5 минут), после чего супернатант сливали, осадок переносили в криопробирку. Образцы хранились при -80°C. Полученные пробы использовали для выделения тотальной РНК. Для этого использовали коммерческий набор RNeasy Mini Kit (Qiagen) и следовали рекомендациям производителя. Измерения концентрации РНК проводили на спектрофотометре NanoPhotometer. Качество выделенной РНК контролировали по параметрам: А260/А230 и А260/А280. Для получения кДНК проводили обратную транскрипцию при помощи коммерческого набора Promega (Cat.# A3500). Полученную коллекцию кДНК хранили при -20 °C. Праймеры были написаны с использованием базы данных NCBI, онлайн-сервиса Primer BLAST, программы Oligo Analyzer 1.0.3 Олигонуклеотидные последовательности праймеров NM_003373.4 Homo sapiens vinculin (VCL), transcript variant 2, mRNA: VCL прямой ATCTCCCCGATGGTGATGGA (Длина 20, Tm=60.1) VCL обратный ATGTCATTGCCCTTGCTGGA (Длина 20, Tm=59.96) а также олигонуклеотидные последовательности для референтных генов домашнего хозяйства YWHAZ (белок активации тирозин-3-монооксигеназы / триптофан-5-монооксигеназы) и HPRT1 (гипоксантин-фосфорибозилтрансфераза1): YWHAZ, прямой ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA (Длина 23, Tm=60) YWHAZ, обратный CCGCCAGGACAAACCAGTAT (Длина 20, Tm=60) HPRT1, прямой TGTAATGACCAGTCAACAGGGGACA (Длина 25, Tm=60) HPRT1, обратный TCCAACACTTCGTGGGGTCCT (Длина 21, Tm=60) При проведении ПЦР в реальном времени использовался неспецифичный ДНК-интеркалятор SYBR Green I (набор реагентов iTaqSuperMix, Bio-Rad). Для каждой пары праймеров готовили мастер - микс из расчета для одной лунки: 10 мкл iTaq буфера, 7 мкл ddH2O и 1 мкл эквимолярной смеси прямого и обратного праймера (рабочая концентрация каждого праймера составила 10 пмоль/реакция). В лунку 96-луночного планшета вносили по 2 мкл кДНК и 18 мкл мастер-микса. Каждая пара праймеров для каждой культуры ставилась в трипликате. Была установлена следующая последовательность температур в цикле: 1. 95℃ 30 секунд (только перед первым циклом) 2. 95℃ 5 секунд 3. 61.5℃ (температура отжига праймеров к VCL) 1 минута 4. 72℃ 40 секунд (оптимум работы Taq-полимеразы, стадия элонгации), шаг 2-4 повторяли 39 циклов. Анализ результатов ПЦР в реальном времени проводился с использованием программы Excel. Для каждого исследуемого гена по техническому трипликату было получено три значения Cq (номер порогового цикла). После вычисления стандартного отклонения отбрасывали значение Cq, для которого SD>0.6. Из оставшихся значений вычисляли среднее (Cq mean). Для того чтобы сравнить уровень экспрессии винкулина, переходили от средних значений порогового цикла к относительному количеству кДНК (Q). Для этого наименьшее значение Cq mean принимали за 1. Значения Q для этого же гена рассчитывали по следующей формуле: Q = 2 (Cq mean, минимальное - Cqmean, анализируемое) где Q - относительное количество кДНК, Cq mean минимальное - наименьшее среднее значение порогового цикла в выборке из 5 клеточных линий, Cq mean анализируемое -среднее значение порогового цикла в исследуемой клеточной линии (Ребриков Д.В. и др., 2009). После вычисления показателя Q для каждого гена, рассчитывали фактор нормализации (NF) по методике, предложенной Вандесомпеле и соавторами (Vandesompele et al., 2002). NF представляет собой среднее геометрическое от значений Q двух референтных генов для данной культуры: 𝑁𝐹 = 2 × 𝑄(𝑌𝑊𝐻𝐴𝑍) × 𝑄(𝐻𝑃𝑅𝑇1) Далее вычисляли относительное количество исследуемой кДНК (Qnorm) по формуле: 𝑄𝑛𝑜𝑟𝑚 = 𝑄 / 𝑁𝐹 Полученные данные были визуализированы с помощью построения бокс плотов в программе GraphPad Prism 8. Анализ клеточной подвижности Для анализа взаимосвязи скорости групповой миграции клеток и морфологических параметров ФК (площадь, соотношение длин осей (AR- axes ratio) в условиях изменения физико-химических свойств микроокружения была использована модель экспериментальной раны на разных субстратах. В качестве субстратов были выбраны стекло, витронектин (Gibco Life Technologies Inc., США), фибронектин (Sigma-Aldrich, США) и поли-D-лизин (Sigma–Aldrich Co., США). Приготовление субстратов производилось в соответствии с протоколами производителей, после чего оставались на воздухе до полного высыхания. Далее субстраты наносились в один слой на поверхность стекла внутри сектора четырехлуночной чашки Петри. За 24 часа до постановки эксперимента, клетки рассаживались в лунки чашек Петри с подготовленными субстратами в концентрации, необходимой для получения монослойной культуры спустя 24 часа. Непосредственно перед экспериментом в стерильных условиях с помощью одноразового носика пипетки на 20 мкл делали крестообразный разрез клеточного монослоя. Клетки ополаскивали свежей порцией культуральной среды. Для анализа взаимосвязи параметров миграции (скорость, направленность, длина пройденного пути, эффективность) клеток и морфологических параметров ФК (площадь, AR, интенсивность) в условиях изменения экспрессии винкулина была использована модель свободного блуждания. За 24 часа до постановки эксперимента, клетки рассаживались на 35 мм чашки Петри со стеклянным дном в низкой концентрации. Флуоресцентная и фазовоконтрастная микроскопия Для оптимизации культивирования в условиях прижизненной съемки клетки в чашках покрывались слоем минерального масла, а клетки линии А549 переводились на смесь сред DMEM-F12+CO2 independent (1:1). Визуализацию клеток проводили на инвертированном микроскопе Zeiss Axio Observer 7 (Zeiss, Германия) с помощью фазовоконтрастных объективов 20x/0.8 Plan Apochromat, 40x/1.30 Oil Plan Neofluor, 63x/1.46 Oil Plan Apochromat. Изображения записывались на компьютер с помощью охлаждаемой КМОП камеры ORCAFlash 4.2 (Hamamatsu, Япония), с использованием ПО ZEN3.0. Экспозиция при съемке флуоресценции составляла 200 мс, при мощности лазера 488 нм 12% и 150 мс при съемке фазовоконтрастных изображений. Режим съемки для модели раны 300 кадров с интервалом 2 минуты (10 часов), для модели свободного блуждания 120 кадров с интервалом 5 минут (10 часов). 16-и битные изображения обрабатывали в программе ImageJ для подавления шумов и увеличения контраста (размытие по Гауссу, изменение параметров яркость-контраст, вычитание фона). Oбработку и дальнейший анализ полученных фильмов проводили в программе ImageJ (NIHImage, США). Статистический анализ данных В качестве целевых параметров для анализа были определены площадь, интенсивность, число и вытянутость ФК (рассчитывалась как соотношение длин осей), а также скорость, эффективность миграции и длина пройденного пути. Скорость при использовании модели зарастания раны рассчитывалась как сокращение расстояния между двумя движущимися фронтами за кратные 2 минутам промежутки времени. Скорость миграции клеток в свободном блуждании была рассчитана в соответствии с методикой, описанной Денисом Вирцем, как корень среднеквадратичного смещения за промежуток времени, равный интервалу между кадрами (5мин) (Kim and Wirtz, 2013). Статистический анализ проведен с использованием ПО GraphPadPrism8.0, а также в программной среде R (R Core Team (2020). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/) с использованием библиотек "stats" ver. 4.0.3 (R Core Team 2020), "PMCMR" ver. 4.3 (Pohlert, 2014) и "ggplot2" ver. 3.3.2 (Wickham 2016). Для оценки значимости различий анализируемых переменных использовали ранговый критерий Краскела–Уоллиса с апостериорным тестом Данна и коррекцией Холма-Бонферрони для множественных сравнений. Для оценки взаимосвязи между анализируемыми переменными проведен корреляционный анализ. В качестве меры взаимосвязи при проведении корреляционного анализа использован ранговый коэффициент корреляции Спирмена. Результаты и обсуждение В первой части эксперимента, после выведения линии A549 (карцинома базального эпителия легких человека), постоянно экспрессирующей винкулин-RFP, чтобы удостовериться в отсутствии цитотоксического эффекта вектора и его влияния на морфологию и динамику ФК, были проанализированы их площадь и время жизни. Данные сравнивались со значениями, полученными для клеток A549 дикого типа после транзиентной трансфекции винкулином-RFP. Медианное время жизни ФК при транзиентной трансфекции составило 50 мин (разброс 10-235 мин, N=100 в 10 клетках) против 55 мин (разброс 45-195 мин, N=20, в 5 клетках) в клетках с постоянной экспрессией. Медианная площадь составила 0.97 мкм2 (разброс 0.13-5.33 мкм2, N=400 в 10 клетках). Следовательно, способ введения репортерного белка в клетку не сказывается на физиологии клеток и регистрируемых значениях параметров ФК, поэтому выборки были объединены. Чтобы проверить значение выбора репортерного белка для визуализации ФК были проведены аналогичные сравнительные расчеты площади и времени жизни ФК с использованием винкулин-RFP и талин-RFP конструктов. Оба структурных белка примерно одновременно рекрутируются к месту формирования адгезии и, предположительно, взаимозаменяемы в качестве репортеров. В полученных данных не было выявлено отличий во времени жизни и площади для клеток, трансфицированных винкулином- RFP, и клеток, трансфицированных талином-RFP (критерий Манна-Уитни, p>0.05). Медианное значение времени жизни для клеток с талином-RFP в качестве репортерного белка составило 63 мин (6-274, N=100 в 10 клетках), медианное значение площади 1.00 мкм2 (0.19-5.08, N=500 в 10 клетках). Таким образом, данные, полученные как для талина, так и для винкулина в качестве репортных белков, релевантны и взаимозаменяемы. В дальнейшей работе в качестве репортерного белка использовали винкулин-RFP. Далее морфология и динамика ФК в клетках линии A549 была изучена более детально. ФК локализуются преимущественно на периферии клетки (не далее 10 мкм от плазматической мембраны). Динамические изменения площади и интенсивности ФК соответствуют классическим представлениям о жизненном цикле ФК. Стадии сборки (время, когда площадь контакта увеличивается), стабильного существования (время, когда площадь контакта максимальна и практически не меняется) и разборки (время, когда площадь контакта уменьшается) хорошо различимы. Формирование ФК происходит фронтом по краю активной ламеллы, каждый новый фронт располагается ближе, чем предыдущий, к убегающему вперед краю клетки. ФК более ранней генерации всегда крупнее ФК нового фронта. Рост ФК происходит в направлении от клеточного края, при этом ФК приобретают продолговатую форму (Рис. 1a). Популяция ФК единовременно присутствующих в клетке гетерогенна по форме и размеру. Медианный размер ФК составил 0.99 мкм2 (разброс 0.12-5.33, N=500 в 15 клетках). Форма ФК была описана соотношением длин (AR-axes ratio) самой длинной и самой короткой осей, проведенный через центр ФК. Медианное значение AR составило 1.73 (1-5.54, N=500 в 15 клетках). Время жизни ФК было рассчитано как период от формирования ФК denovo до его полной разборки, медианное значение составило 50 мин (10-225 мин, N=120 в 15 клетках). Далее были проанализированы параметры ФК в неопухолевых кератиноцитах человека. Локализация и общая динамика ФК в клетках линии HaCat соответствовали тому, что наблюдали в клетках карциномы. Подавляющее большинство ФК находятся на периферии, полоса формирования ФК по периферии клеток в HaCat более широкая ламелла, чем в A549. ФК значительно более вытянуты (Рис.1б), за счет чего складывается впечатление, что они крупнее, чем ФК в A549. Статистический анализ показывает отсутствие достоверных различий по параметру размера ФК (для HaCat 0.98 мкм2, разброс 0.12-5.33, N=500 в 15 клетках, критерий Манна-Уитни, p>0,05) (Рисунок 2а). Медианное значение AR HaCat почти в 1.5 раза превышает значение AR для A549 (2.46 (1.021-7.09, N=500 в 15 клетках) против 1.73 (1-5.54, N=500 в 15 клетках)) (Рисунок 2б). Время жизни ФК в клетках HaCat примерно в 1,5 раза ниже по сравнению с A549 (Рисунок 2в). Полученные результаты мало согласуются с высказываемыми в литературе предположениями о значении опухолевой трансформации в уменьшении размера и усилении торновера ФК. Такие изменения связывают с повышением миграторного потенциала опухолевых клеток. Предполагается, что мелкие и динамичные ФК в клетках опухолей снижают силу адгезии и облегчают миграцию. Из сравнения морфологии ФК в клетках карциномы базального эпителия легких и в неопухолевых кератиноцитов человека очевидно, что опухолевая трансформация не всегда сопровождается уменьшением размера ФК. Кроме того, ФК в опухолевых эпителиоцитах Могут быть стабильнее (иметь большую продолжительность жизни), чем в неопухолевых HaCat Для оценки миграторного потенциала клеток обеих линий была использована модель экспериментальной раны. В качестве характеристических параметров использовали скорость сближения клеточных фронтов и процент зарастания раны. Для клеток карциномы в процессе зарастания раны можно выделить 2 фазы: быструю и медленную (Рисунок 3а, рыжая кривая). В течение первых 30 минут после внесения раны в монослой клеток А549 скорость сближения клеточных фронтов растет и достигает своего максимума Для оценки миграторного потенциала клеток обеих линий была использована модель экспериментальной раны. В качестве характеристических параметров использовали скорость сближения клеточных фронтов и процент зарастания раны. Для клеток карциномы в процессе зарастания раны можно выделить 2 фазы: быструю и медленную (Рисунок 3а, рыжая кривая). В течение первых 30 минут после внесения раны в монослой клеток А549 скорость сближения клеточных фронтов растет и достигает своего максимума (медианное значение 0.0092 мкм/час, разброс 0.0016–0.0345) – первая, быстрая фаза. После этого наступает вторая – медленная фаза, миграция клеток замедляется. Спустя 10 часов, медианная скорость зарастания раны уже практически в 2 раза ниже изначальной (0.0057 мкм/час, разброс 0.0034–0.0101, критерий Манна-Уитни, p=0,01). За 10 часов полного зарастания раны (300 мкм) не происходит. Спустя 10 часов съемки целостность клеточного фронта нарушается, из монослоя клеток обособляются лидирующие клетки, которые переходят к свободному блужданию вдоль края раны. По сравнению с клетками карциномы, нормальные кератиноциты мигрируют менее эффективно, развивая меньшие скорости. Зарастание раны происходит также с прохождением двух фаз: медленной и быстрой. Максимальная скорость сближения клеточных фронтов достигается в первые полчаса после внесения раны в монослой (медианное значение 0.0038 мкм/час, разброс 0.0001–0.0116), что почти в 2.5 раза меньше, чем медианная скорость в первые 30 минут миграции клеток А549 (График 2а, синяя кривая). Спустя 10 часов, скорость зарастания раны снижается почти в 2 раза (0.0020 мкм/час, 0.0011–0.0049). За 5 часов (300 минут) рана зарастает только на 14% (против 43% для A549), за 10 часов (600 минут) только на четверть (25% против 81% для А549). При этом, по истечении 10 часов съемки HaCat не утрачивают целостности клеточного фронта, хотя неровность края раны, вызванная более высокой протрузивной активностью некоторых клеток, присутствует. Таким образом, HaCat мигрируют медленнее и с меньшей эффективностью, по сравнению с клетками линии А549, однако обладают более высокой скоординированностью в процессе групповой миграции. В совокупности с данными по морфологии ФК можно заключить, что удлиненная форма ФК в HaCat, по всей вероятности, связана с более высокой скоординированностью групповой миграции кератиноцитов. Развитость аппарата межклеточных контактов в HaCat обеспечивает эффективную трансдукцию механического усилия внутри монослоя с четким распределением ролей лидирующих клеток и клеток последователей (что согласуется с литературными данными, согласно которым в ходе коллективной миграции клетки через межклеточные контакты контролируют процесс поляризации и распределения тягового усилия в составе группы, в результате чего возникает иерархия клеток, выделяются субпопуляции клеток-лидеров и клеток-последователей: лидирующие клетки осуществляют рецепцию химических и физических факторов запуская и корректируя процесс движения. Клетки-последователи адаптируются к условиям, ориентируясь на сигналы, транслируемые лидирующими клетками (Theveneau et al., 2013; Scarpa et al., 2015; Zimmermann et al., 2016). Это значит, что наиболее высокое тяговое усилие будет формироваться в клетках, наиболее близко расположенных к краю раны. В то же время, из литературных данных известно, что рост тягового усилия в клетке сопровождается удлинением ФК по направлению приложения тягового усилия (Balaban et al., 2001; Riveline et al., 2001). Следовательно, значительно более вытянутая форма ФК в HaCat по сравнению с А549 косвенно указывает на увеличение тягового усилия в лидирующих клетках движущего фронта. Во второй части эксперимента, чтобы проверить наличие зависимости между параметрами миграции раковых клеток и размером ФК в условиях изменения свойств микроокружения, клетки карциномы были высажены на разные субстраты: стекло, поли-D-лизин (PDL), витронектин, фибронектин. Предполагалось, что чем эластичнее субстрат, тем менее эффективна будет миграция, и тем крупнее будут ФК контакты, чтобы удовлетворять потребности клетки в большем натяжении, необходимом для протрузии и ретракции. В ходе эксперимента были получены результаты, иллюстрирующие изменение морфологии ФК. В зависимости от субстрата варьировал размер (Таблица 1), но не соотношение длин осей (AR) ФК (Таблица 2). Каждому типу субстрата соответствует свое статистически достоверно отличное ото всех медианное значение размера ФК. Самые маленькие ФК формировались на поли-D-лизине (PDL), самые крупные – на фибронектине. При этом на стекле и на витронектине размер ФК имеет промежуточные значения. Таким образом, клетки карциномы адаптируются к переменам в микроокружении, регулируя размер ФК. Однако зависимость от эластичности субстрата не линейная, на стекле, как на субстрате наименьшей эластичности ФК имеют промежуточное значение. Такое распределение указывает на то, что больший вклад в определение морфологии ФК вносит химическое разнообразие лигандов к интегринам, содержащихся в матриксе, нежели его непосредственно физические свойства. Из литературы известно, что синтетический синтезированный, чистый, PDL, как и PLL (poly-L-lysine), обладает низким сродством к интегринам (Salmela et al., 2017), в то время как фибронектин представляет собой вытяжку из телячьей сыворотки и наиболее гетерогенен по составу лигандов, активирующих интегрины (Bachman et al., 2015). С помощью модели экспериментальной раны удалось установить, что при миграции по разным субстратам клетки А549 имеют различную скорость сближения клеточных фронтов и процент зарастания раны. Для клеток карциномы, как и при миграции по стеклу, для каждого субстрата в процессе зарастания раны можно выделить 2 фазы: быструю и медленную (Рисунок 4а). Скорость миграции клеток меняется не линейно. При миграции по стеклу и по PDL клетки достигают максимальной скорости сближения клеточных фронтов (медианное значение для поли-D-лизина 0.016 мкм/час, разброс 0.038–0.002) за первые 30 минут, с момента внесения раны в монослой клеток, после чего наступает медленная фаза и снижение скорости зарастания раны. Для клеток, мигрирующих по витронектину и фибронектину быстрая фаза зарастания продолжительнее, клетки набирают скорость в течение первого часа миграции, значения максимальных скоростей сближения клеточных фронтов при этом выше: 0.0163 мкм/час (разброс 0.0451–0.0049) и 0.0211 мкм/час (разброс 0.0379–0.0038) для витронектина и фибронектина соответственно. Спустя 10 часов, скорость зарастания раны для всех типов подложек за исключением стекла, снижается до медианного значения порядка 0.01 мкм/час (разброс 0.002–0.451). Спустя 10 часов, полное зарастание раны происходит на фибронектине и витронектине, на PDL к этому времени рана затягивается на 93% (Рисунок 4б).Для получения популяций с разными уровнями экспрессии винкулина в клетке было проведено несколько раундов сортировки с выделением клеточных субпопуляций, соответствующих требованиям к уровню экспрессии целевого белка. Поскольку в ходе эксперимента использовали клеточную линию с постоянной экспрессией винкулина-RFP, отсортировать субпопуляции с разными уровнями экспрессии винкулина было возможно по флуоресценции в красном канале. Клетки были разделены на 2 субпопуляции с высоким (P4 сектор, медианное значение флуоресценции в RFP-PE канале 18.768% от общего числа клеток) и средним (P3 сектор, медианное значение флуоресценции в RFP-PE канале 1.680% от общего числа клеток) уровнями экспрессии винкулина (Рис. 5). Для получения клеток с низким уровнем экспрессии винкулина в клетках проводили нокдаун при помощи РНК-интерференции миРНК, конъюгированных с GFP. Эффективность нокдауна была подтверждена при помощи RT-PCR. Более выраженный качественный и количественный эффект подавления экспрессии винкулина в клетках обеспечил5’-GCGAUACCACAACUCCCAUdTdT-3’ (AUA) вариант олигонуклеотидной последовательности миРНК (Рис. 6), именно AUA вариант использовался в дальнейшем для нокдауна с последующим анализом морфологии ФК и параметров миграции. Подавление экспрессии винкулина в клетках качественно проявлялось в снижении интенсивности флуоресценции контактов в канале Rhod при высоком уровне сигнала от миРНК в канале FITC. Как при повышенной, так и при пониженной экспрессии винкулина менялась интенсивность флуоресценции и число ФК в клетках (Рис.7).Медианное значение флуоресценции для клеток с высокой экспрессией составило 417.66 у.е. (9.19–12224.82), что более чем в 10 раз превышает медианное значение для клеток со средним уровнем винкулина и почти в 30 раз превышает медианное значение для клеток с подавленной экспрессией винкулина (35.94 у.е. (1.20–1930.00) и 15.48 у.е. (0.35–528.85) соответственно), различия достоверны (тест Данна, p<0.05). Интересно, что как при повышенной, так и при пониженной экспрессии винкулина клетки формируют примерно в 2 раза больше ФК на краю. Повышенная экспрессия винкулина не влияет на медианный размер ФК (1.03 мкм2 (0.04–10.986) при 1.02 мкм2 (0.02–6.58) в клетках со средним уровнем экспрессии). Наряду с тем, что клетки с повышенной экспрессией формируют более крупные ФК, растет и число маленьких ФК. Повышение экспрессии также не влияет на форму. Подавление экспрессии винкулина, влияет на размер ФК, но не влияет на его форму. Медианный размер ФК при подавлении винкулина 0.45 мкм2 (0.03–4.68), что вдвое меньше медианного размера ФК в клетках со средним уровнем экспрессии 1.02 мкм2 (0.02–6.58). Рост числа ФК в клетках при повышенной экспрессии, по всей видимости, может быть объяснен результатом распределения избытка белка в клетке по принципу петли положительной обратной связи в ответ на повышение тягового усилия, создаваемого ФК предыдущей генерации (о повышении тягового усилия свидетельствует удлинение ФК). При пониженной экспрессии увеличение числа контактов можно объяснить компенсаторным эффектом, возникающим в ответ на снижение тягового усилия из-за невозможности кластеризации крупных винкулиновых агрегатов и уменьшения размера ФК. Корреляционный анализ внутри группы параметров ФК показал, что как при повышенной, так и при пониженной экспрессии винкулина изменение размера ФК, не взаимосвязано с изменением его формы, но положительно коррелирует с количеством белка (Рис. 8), то есть, чем выше интенсивность флуоресценции винкулина в составе ФК, тем больше размер ФК. Внутри субпопуляции клеток с повышенной экспрессией была установлена корреляция между количеством белка и числом ФК в клетке. Из сравнения медианных значений количества ФК в клетках трех разных субпопуляций следует, что при отличном от среднего уровне экспрессии клетки формируют большее число ФК (коэффициент корреляции Спирмана -0,73). Корреляционный анализ позволяет детализировать каждую выборку в отдельности и указывает на то, что клетки с наибольшей экспрессией винкулина формируют наименьшее число ФК. Следовательно, рост числа контактов при отклонении от оптимума экспрессии изменяется нелинейно и при достижении некоторого порогового значения экспрессии, число ФК в клетке снова снижается. Вероятно, что такой тренд не наблюдается для клеток с пониженной экспрессией из-за искусственной ограниченности выборки: более низкие уровни флуоресценции не позволяют детектировать ФК при съемке и оценивать его морфологические параметры. Корреляция экспрессии винкулина с другими параметрами ФК. Кружок на пересечении демонстрирует значимость корреляции, коэффициент значимости указан внутри кружка, цвет кружка на пересечении отражает знак корреляции (розовый – взаимосвязь параметров прямо пропорциональна, голубой – обратно пропорциональна). Более детальное изучение и корреляционный анализ внутри группы параметров ФК показал, что как для совокупной выборки клеток с разными уровнями экспрессии, так и внутри каждой группы существует взаимосвязь числа ФК в клетках и суммарной площади адгезии (коэффициенты корреляции Спирмана 0.84, 0.63 и 0.78 для клеток с высокой, средней и низкой экспрессии соответственно и 0.63 для совокупной выборки). Данные подтверждаются регрессионным анализом (Рис.9). Медианная площадь ФК отрицательно коррелирует с числом ФК (Рис. 9а). В отличие от сильно положительных корреляций между суммарной площадью и числом ФК (Рис. 9б), медианная площадь ФК с суммарной площадью адгезии коррелирует слабо положительно (коэффициент Спирмана не превышает порога значимости ни для одной из выборок). Совокупность полученных данных указывает на то, что именно число ФК вносит больший вклад в суммарную площадь адгезии, чем медианный размер индивидуальных ФК и указывают на существование некоторого компенсаторного механизма в клетке, направленного на поддержание постоянства суммарной площади адгезии. Механизм, вероятно, реализуется через установление баланса между размером и числом ФК в клетке. Очевидно, что повышение стабильности значения суммарной площади клетки стабилизирует и миграторный потенциал, нивелируя эффекты, направленные на изменения параметров ФК. Таким образом, поскольку предполагается, что суммарная площадь адгезии клетки на субстрате определение ее способность к перемещению, имеет смысл исследовать влияние числа ФК в клетке на миграторный потенциал и, в частности на скорость миграции клетокДля детального анализа миграторного потенциала клеток в условиях изменения экспрессии винкулина была использована модель свободного блуждания. Клетки линии А549 обладают мезенхимальным типом подвижности и эффективно мигрируют по стеклу поодиночке, предпочитая одиночную миграцию групповой. Процесс миграции включает все фазы миграции в ее классической интерпретации: поляризации, формирования зоны переднего края, адгезии сформированной протрузии к субстрату и ее стабилизации за счет формирования в зоне переднего края ФК, развития сократительного усилия на переднем краю и его реализации в продвижении тела клетки вслед за убегающим вперед активным ведущим краем и ретракции, подтягивания, «хвоста» клетки. Границы фаз хорошо различимы. Изменение экспрессии винкулина в клетках не нарушает механики клеточной подвижности, клетки сохраняют способность к преодолению расстояний в 10 раз превышающий диаметр ядра, что является качественным показателем активной миграции клеток, но не пассивным смещением в процессе распластывания. Медианное расстояние, преодолеваемое клетками за 7 часов (временной промежуток, за который клетки не успевают выйти из кадра или изменить траекторию движения после деления) для клеток с повышенным уровнем экспрессии составило 84.50 мкм (23.18–156.53), что незначительно меньше медианного значения для клеток со средним и низким уровнем винкулина (94.79 мкм (48.194–289.178) и 87.07 мкм (15.46–173.61) соответственно), различия не являются статистически достоверными (Рис. 10a). Наряду с проходимым расстоянием, был проанализирован параметр эффективности миграции клетки. Параметр представляет особенный интерес в контексте проверки, выдвинутой в литературе гипотез, указывающих на вклад винкулина в поддержание направленности движения клеток (Rahman et al., 2016; Chen et al., 2018). Значение параметра эффективности в работе было рассчитано как отношение общего смещения относительно начальной точки движения к длине пройденной траектории. Медианные значения эффективности для клеток с повышенным средним и низким уровнем экспрессии: 0.32 (0.06–0.62), 0.27 (0.09–0.85) и 0.49 (0.50–1.28) соответственно, различия статистически не достоверны, критерий Краскела-Уоллеса, p<0.05) (Рисунок 10). Таким образом, в клетках линии A549 в процессе свободной миграции по стеклу, изменение уровня экспрессии винкулина не приводит к изменению эффективности миграции. Сравнение значений медианной скорости свободной миграции и медианной скорости при миграции клеток в рану позволяет грубо оценить разницу в миграторном потенциале, реализуемом клетками: групповая миграция происходит примерно в 4 раза медленнее, чем одиночная (медианная скорость движения клеточного фронта при миграции клеток линии A459 по стеклу составляет порядка 0.05 мкм/час). От морфологии ФК в большей степени зависит скорость. В ряду значимых для совокупной выборки выделяется корреляция медианной скорости с формой ФК (График11). Согласно данным матрицы, более высокую скорость будет развивать те клетки, чьи ФК менее вытянуты (коэффициент значимости Спирмана -0.49). Взаимосвязь скорости миграции с формой ФК согласуется с данными о том, что удлинение ФК происходит в результате требования к генерации большего тягового усилия, а значит, в таком случае переход между фазами адгезии-контракции будет занимать больше времени, и клетка будет развивать меньшую скорость. Другой значимой корреляцией для совокупной выборки оказалась пара медианная скорость миграции - суммарная площадь адгезии (Рисунок 11), что подтверждает ранее выдвинутое предположение, о влиянии на суммарной площади адгезии клетки на субстрате на ее способность к перемещению, эффективно переключаясь между фазами миграторного процесса в его классическом понимании. Чем больше суммарная площадь адгезии, тем, очевидно, больше времени требуется клетке на переход между фазами адгезии-стабилизации и стабилизации-ретракции, тем ниже медианная скорость. Таким образом, корреляционный анализ указывает на существование взаимосвязи морфологии ФК и скорости миграции клеток. Вклад морфологии ФК зависит от уровня экспрессии винкулина. Такие параметры как дальность и эффективность миграции от уровня экспрессии винкулина не зависят. Наибольшее значение в определении скорости миграции имеют форма ФК, по всей видимости, отражающая силу натяжения в системе клетка-матрикс и суммарная площадь адгезии как фактор, лимитирующий по времени скорость смены фаз цикла процессов миграции. В совокупности, данные комплексного анализа морфологических параметров ФК, параметров миграции клеток, полученные в ходе всех трех частей эксперимента, а также детальный анализ их взаимосвязи позволяют заключить, что морфология ФК во многом предопределена генетически: клетки общего, эпителиального, происхождения в разной степени опухолевой трансформированности отличаются по форме ФК. При этом, морфологические параметры ФК сильно зависят от химического состава и физических свойств микроокружения. Изменение морфологических параметров ФК влияет на миграторный потенциал клеток, преимущественно на скорость миграции. Наибольший вклад в определении миграторного потенциала клеток вносит суммарная площадь адгезии, которая в большей степени зависит от числа, но не от медианного размера индивидуальных ФК. Значительный вклад в миграторный потенциал клеток, опосредованный регуляцией морфологии ФК, вносит микроокружение. Изменение экспрессии такого структурного белка как винкулин не влияет на дальность и эффективность миграции. По всей видимости, ФК вовлечены в контроль миграции через молекулярную регуляцию баланса внутри механически сопряженной системы клетка-матрикс. Морфологические изменения ФК являются следствием смещения точки баланса, обеспечивающего клеткам наилучшую миграцию в текущих условиях. Дальнейшее изучение регуляторных механизмов функциональной интеграции морфологии ФК и миграторного потенциала клеток на основании выявленных взаимосвязей позволит установить ключевых участников регуляции и приблизиться к выявлению потенциальных мишеней для таргетной противоопухолевой терапии, направленной на подавление патологической миграции клеток.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Роль цитоскелета в клеточной подвижности
Результаты этапа: Фокальные контакты (ФК) представляют собой большие мультибелковые комплексы, которые преобразуют физические сигналы от внеклеточного матрикса в химические сигналы внутри клетки и, таким образом, регулируют подвижность клеток. Из-за их ключевой роли в передаче сигнала и силовой передачи ФК необходимы для всех типов клеточной подвижности, включая двумерную миграцию на субстрате (Winograd-Katz, Fässler, Geiger, & Legate, 2014). ФК играют ключевую роль в контроле развития и регуляции иммунного ответа (Arts et al., 2021; Maartens & Brown, 2015; Wilson et al., 2020). Изменение динамики и структуры ФК, приводящее к метастазированию и нарушению эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), является одним из важнейших направлений в исследованиях рака (Bianchi-Smiraglia, Paesante, & Bakin, 2013; Lau et al., 2012; Meng et al., 2009). Сложная внутриклеточная структура ФК включает в себя три различных слоя: нижний сигнальный слой интегрина, слой, связанный с механохимической трансдукцией, и регуляторный слой актина, причем эта структура повсеместно распространена среди различных типов клеток (Chastney et al., 2020; Paszek et al., 2012; Stubb et al., 2019). Киназа фокальной адгезии (FAK) расположена в нижнем слое и служит одним из ключевых сигнальных белков как благодаря своей киназной активности, так и благодаря структурным свойствам (Kleinschmidt and Schlaepfer, 2017). При рекрутировании и активации паксиллина в сайт ФК киназа FAK взаимодействует с паксиллином и связывает талин (Schaller & Parsons, 1995: Lopez-Colome et al., 2017), после чего эти белки начинают работать как «горячие точки» для дальнейшей сборки ФК (Richardson, Malik, Hildebrand, & Parsons, 1997). В раковых клетках FAK играет важную роль в образовании метастазов, способствуя миграции и инвазии клеток. Повышенная экспрессия FAK, а также ее функциональная активация положительно коррелируют со скоростью метастазирования, плохим прогнозом и выживаемостью (Fan et al., 2016; Schlepfer, Mitra and Ilic, 2004; Wang et al., 2019). Многочисленные данные указывают на то, что FAK способствует выживанию и пролиферации раковых клеток и регулирует метаболизм раковых клеток, тем самым стимулируя не только миграцию клеток и инвазию, но и другие процессы, способствующие развитию опухоли (Demircioglu et al., 2020; Serrels et al., 2015; Tavora et al., 2014; You et al., 2015). Растущий объем данных подтверждает критическую роль FAK в патогенезе опухоли, что делает ее многообещающей мишенью для противоопухолевой терапии. Жесткость и состав субстрата определяют структуру, морфологию и динамику ФК. Например, клетки на жестких субстратах имеют более крупные ФК с повышенной экспрессией ключевых регуляторных и структурных молекул, таких как паксиллин, винкулин или зиксин (Adutler-Lieber et al., 2014; Cavalcanti-Adam et al., 2007; Chiu et al., 2014; Engler, Sen, Sweeney, & Discher, 2006), тогда как на 2D-подложках с пониженной жесткостью или в 3D-гелях ФК обычно меньше (Doyle, Carvajal, Jin, Matsumoto, & Yamada, 2015; Yue et al., 2016). Некоторые данные подтверждают корреляцию между размером очаговой адгезии и подвижностью клеток для некоторых типов клеток, таких как фибробласты или миобласты (Kim & Wirtz, 2013; Thompson et al., 2010). Однако, может ли изменение параметров ФК, происходящее в ответ на сигналы субстрата, измененная экспрессия, ингибирование или активация белков FA влиять на миграцию эпителиальных и раковых клеток, остается неизученным. На данном этапе работы мы использовали высокопроизводительную микроскопию для описания функциональной взаимосвязи между параметрами ФК и параметрами миграции клеток с помощью изменения эластичности субстрата и изменения экспрессии белков, ингибирующих ФК, в иммортализованных эпителиальных кератиноцитах человека (HaCaT) и клетках карциномы легкого (A549). Методы Клеточные линии Клетки A549 (карцинома легкого) и HaCaT (нормальные кератиноциты человека) были получены из коллекции культур ATCC (Манассас, Вирджиния, США) и культивированы в среде DMEM/F12 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ПанЭко, Россия) с 25 мм HEPES (ПанЭко, Россия) и 0,8 мг/мл гентамицина при 37°C, при 5% CO2. Виды покрытия субстрата Лунки планшетов покрывали фибронектином, витронектином или поли-D-лизином в концентрации 5 мкг/см2 (все реагенты Sigma-Aldrich, Нью-Йорк, США); лунки покрывали 500 мкл раствора в течение 1 ч при 37°C, избыток раствора отбирали и лунки высушивали в стерильных условиях. Анализ зарастания экспериментальной раны Клетки сажали на 6-луночные планшеты и выращивали до монослоя. Экспериментальную рану наносили кончиком стерильной 10-мкл пипетки (ширина ≈350 мкм). Остатки клеток удаляли путем двукратного промывания средой и снимали миграцию клеток в рану в течение 600 минут. Изображение в реальном времени получали на инвертированном флуоресцентном микроскопе Zeiss AxioObserver под управлением программного обеспечения Zen 3.1 Blue Edition с объективом × 20/1,6 (фазовый контраст) при 36,5–37 °C в CO2-независимой среде (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), с использованием Hamamatsu ORCA-Flash4.0 V2 (Hamamatsu Photonics, Хамамацу, Япония) с 10-минутными интервалами между кадрами. В каждой лунке планшета ставили 6 экспериментальных ран, весь эксперимент проводили в трипликате. Каждое измерение производилось в соответствии с методом, описанным в работе Kauanova et al. (Kauanova, Urazbaev and Vorobjev, 2021) с использованием ImageJ. РНК-интерференция Клетки аденокарциномы легкого A549 трансфицировали FAK siRNA, siRNA vinculin или контрольной неспецифической siRNA с использованием реагента для трансфекции Metafecten (Biontex, Мюнхен, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки в чашках Петри диаметром 35 мм выращивали до 70% конфлюэнтности и трансфицировали 100 пмоль siRNA на лунку (объемное соотношение реагента для трансфекции к siRNA 5:1). После 12 часов инкубации среду с трансфекционными комплексами меняли на свежую. Все последовательности siRNA были разработаны с помощью бесплатного программного обеспечения BLOCK-IT (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress /) и приобретен у “ДНК-Синтез” (Москва, Россия). Последовательности для каждой siRNA приведены в Таблице 1. Выделение РНК и обратная транскрипция РНК выделяли из клеточных суспензий с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Джермантаун, Мэриленд, США) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию РНК измеряли с помощью нанофотометра (Implen, Мюнхен, Германия) и оценивали ее чистоту в соответствии с коэффициентами поглощения А260/А280 и А260/А230. кДНК транскрибировали с использованием набора для синтеза кДНК iScript Advanced (Bio-Rad Laboratories Inc., Геркулес, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя, в реакцию брали 50 нг общей РНК. Праймеры и ПЦР в реальном времени qPCR в реальном времени проводили на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories Inc., Геркулес, Калифорния, США) с использованием iTaq Universal SYBR Green Supermix (Biorad Laboratories Inc., Геркулес, Калифорния, США). Протокол реакции включал денатурацию (95°C, 10 мин), за которой следовали 39 циклов амплификации (95°C, 15 с; X °C (точная температура отжига для каждой пары праймеров приведена в Таблице 2), 30 с; и 72°C, 60 с). Все реакции были поставлены в трипликате. Один образец кДНК в каждом планшете служил промежуточным калибратором для объединения данных в один эксперимент. Последовательности праймеров приведены в Таблице 2. Праймеры были приобретены у “ДНК-Синтез” (Москва, Россия). Специфичность праймера была подтверждена анализом кривой плавления. Значения Ct были определены для кривых qPCR в реальном времени путем установки порогового значения в 5 SD для каждого эксперимента. Данные qPCR были нормализованы в соответствии с Vandesompele et al. (Vandesompele et al., 2002), используя UBC и HPRT1 в качестве референтных генов. Характеристика стабильных клеточных линий HaCaT и A549 Чтобы получить клеточные линии HaCaT и A549 со стабильной экспрессией винкулина, мы клонировали кДНК винкулина в лентивирусный вектор pSLIK, содержащий RFP в качестве репортера и ген устойчивости к пуромицину (Eurogene, Россия); лентивирусный вектор был котрансфицирован в упаковочные клетки HEK293 (ATCC #CRL-11268) с помощью реагента HP X-tremeGENE согласно протоколу производителя, вирусные частицы собирали через 24 и 48 часов после трансфекции и затем использовали для трансдукции клеток A549 и HaCaT. Зараженные клетки выращивали в 0,1% пуромицине (Gibco, Thermo Fischer Scientific, Калифорния, США), а затем сортировали по интенсивности флуоресценции в RFP-канале (возбуждение 561 нм, излучение 585/15 нм BP) с использованием клеточного сортера FACSAria SORP (BD Biosciences) с ноззлом 85 мкм и соответствующими параметрами давления. Иммунофлуоресценция Стабильно экспрессирующие RFP-конъюгированный винкулин A549-vin-RFP или HaCaT-vin-RFP клетки фиксировали в 4% растворе параформальдегида в течение 15 мин при комнатной температуре. После 3 промывок PBS и пермеабилизации клеток смесью 0,01% Triton-X100 и 0,01% Tween-20 в PBS в течение 60 минут при RT клетки инкубировали с первичными рекомбинантными антителами к паксиллину (ab32084 (Y113) лот GR215998-38, Abcam, Великобритания) в конечном разведении 1:200 при 37°C в течение 60 минут и вторичные антитела против кролика, конъюгированные с Alexa-633 (Abcam, Великобритания) в конечном разведении 1:200 и совместно окрашенные DAPI (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) для визуализация ядер. Изображения были получены с помощью Zeiss AxioObserver со светодиодным источником света Colibry 7 и объективом PlanApochromat 63x1.46 Oil. Использовался следующий фильтрующий куб: GFP (фильтр возбуждения 450-490 нм, светоделитель 495 нм, излучение 500-550 нм) и mKate (фильтр возбуждения 540-580 нм, светоделитель 585 нм, излучение 593-668 нм). Данные были получены с помощью программного обеспечения Zeiss Zen Blue 3.1. Ингибиторный анализ Для инактивации FAK клетки A549 и HaCaT обрабатывали 1 мкм селективного ингибитора FAK PF-573228 (Селлек, Техас, США) в течение 2 часов перед съемкой клеток. Анализ изображений Данные микроскопии анализировали с помощью программы ImageJ (NIH). Площадь ФК, соотношение сторон и значения продолжительности жизни были измерены и рассчитаны для ФК, как описано в Gladkikh et al. (Gladkikh, Kovaleva, Tvorogova, & Vorobjev, 2018). Выборка из 200-500 фокальных контактов была измерена для каждой экспериментальной точки. Флуоресцентные изображения были обработаны с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop (Adobe Systems, США). Статистика Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, США). Для сравнения различий между двумя независимыми группами использовался критерий Манна-Уитни, значение Р <0,05 считалось значимым. Данные представлены в виде медианы с диапазоном для параметров ФК или в виде среднего ± SD для экспрессии мРНК и анализа зарастания раны. Результаты Мы описали размер и морфологию ФК в клетках HaCaT и A549, нанесенных на стекло. ФК, содержащие винкулин, в обеих клеточных линиях преимущественно расположены на краю клетки (рис. 1А). ФК в клеточной линии A549 имеют среднюю площадь 1,17 мкм2 (диапазон 0,11-5,33, n=500) и обычно имеют эллипсоидальную форму (среднее соотношение сторон составляет 1,73, диапазон 1,0-5,54). ФК в клетках HaCaT имеют аналогичную среднюю площадь (0,98 мкм2, диапазон 0,12-8,36), но более вытянуты (среднее соотношение сторон составляет 2,46, диапазон 1,02-7,09, n=500). Чтобы оценить взаимосвязь между дескрипторами ФК и подвижностью клеток, мы провели эксперименты с экспериментальной раной, используемые как золотой стандарт для анализа миграции эпителиальных клеток. Для изменения размера ФК мы использовали субстраты различной жесткости (стекло, поли-D-лизин, витронектин и фибронектин). Для обеих клеточных линий клетки на фибронектине имели наибольшую медианную площадь ФК: 2,44 мкм2 для A549 (диапазон 0,29-6,05), 1,32 мкм2 для HaCaT (диапазон 0.11-7.37) (рис. 1Б), в то время как средняя площадь ФК для клеток на стекле была наименьшей среди всех субстратов (p<0,0001 для A549, p=0,0002 для HaCaT, непарный критерий Манна-Уитни). При анализе зарастания экспериментальной раны мы наблюдали корреляцию между средним размером ФК и скоростью закрытия раны на соответствующем субстрате. Для обеих клеточных линий самая высокая скорость миграции наблюдается на фибронектине, где ФК были самыми большими. Мы получили 100±11.75% закрытия раны для A549 и 61.74 ± 16.88%% для клеток HaCaT на фибронектине за 600 минут. Клетки на стекле имели самую низкую скорость миграции (81.70±15.54% закрытия раны для клеток A549, 43.95±13.31% для клеток HaCaT), клетки на витронектине и поли-L-лизине имели промежуточные скорости миграции (рис. 1В). Затем мы измерили общую экспрессию мРНК винкулина (как структурного белка) и FAK (как регуляторного белка) и обнаружили повышенную экспрессию винкулина в клетках A549 и HaCaT на фибронектине в течение 72 часов, по сравнению с клетками на стекле. Среднее относительное количество мРНК винкулина для клеток A549 составило 1,14 ± 0,19 на фибронектине по сравнению с 0,60±0,10 на стекле, для клеток HaCaT оно составило 0,83 ± 0,01 на фибронектине против 0,62±0,01 на стекле, хотя различия были статистически незначимыми (рисунок 2 А, Б). Экспрессия мРНК FAK также была повышена в клетках на фибронектине (среднее относительное количество мРНК 0,77±0,05 против 1,18±0,03 для клеток A549 и 0,95±0,15 против 1,23±0,21 для клеток HaCaT) по сравнению с клетками на стекле (рис. 2 Б, Г) (различия были статистически значимыми только для клеток A549, р=0,03, непарный тест Манна-Уитни) Поскольку повышенный уровень этих белков в клетках на фибронектине коррелировал с повышенной подвижностью клеток, далее мы анализировали, может ли направленное изменение уровня экспрессии этих белков привести к изменению параметров подвижности клеток. Чтобы изучить роль изменения уровня экспрессии винкулина в клеточной подвижности, мы проанализировали движение клеток на различных субстратах при снижении уровня экспрессии винкулина с помощью siRNA. Используя siRNA к винкулину, мы получили снижение уровня экспрессии этой мРНК в 4-10 раз для A549 и 10-60-кратное снижение уровня экспрессии винкулина в клетках HaCaT (рис. 2 А, В). Пониженные уровни экспрессии винкулина в экспериментах находились в пределах физиологического диапазона для этого белка, поскольку клетки сохраняли свою способность мигрировать по субстрату, были способны к перемещению на большие расстояния (более 10 диаметров ядра) и сохраняли общую нормальную морфологию (рис. 3А, 4А). Снижение уровня экспрессии винкулина в клетках A549 привело к 2,6-кратному уменьшению площади ФК (медианная площадь ФК 0,45 мкм2 по сравнению с 1,17 мкм2 в контроле) и к 4,8-кратному снижению средней интенсивности флуоресценции (с 417 у.е. в контроле до 87 у.е. в клетках со сниженным уровнем экспрессии винкулина), но не повлияло на морфология ФК (медиана AR 1,79 по сравнению с 1,73 в контроле). Снижение уровня экспрессии винкулина в клетках HaCaT также привело к 2-кратному уменьшению площади ФК (с 0,98 мкм2 до 0,55 мкм2), средняя интенсивность флуоресценции на стекле также снизилась с 372 у.е. в контроле до 205 у.е. в клетках со сниженным уровнем экспрессии винкулина. Мы подтвердили уменьшение площади ФК путем окрашивания клеток, с нокдауном винкулина антителами к паксиллину в качестве альтернативного белка-репортера ФК (рис. 3Б, 4Б). В экспериментах по зарастанию раны снижение уровня винкулина в клетках HaCaT и A549 существенно не снижало скорость закрытия раны как на стекле, так и на фибронектине. Для клеток A549 с нокдауном винкулина закрытие раны через 600 минут составило 99,29±2,45% на фибронектине и 97.70±25.34% на стекле, что аналогично контрольным значениям (рис. 3Г). Для клеток HaCaT закрытие раны через 600 минут составило 52.16±15.0% на фибронектине и 43,19±9,18% на стекле, что также близко к контролю (рис. 4В, 4Г). В контроле как на стекле, так и на фибронектине клеточный фронт в процессе зарастания раны оставался ровным. Через 3 часа отдельные клетки теряли контакт с основным клеточным фронтом и начинали мигрировать в рану. Направление миграции отдельных клеток совпадало с направлением миграции фронта клеток. После нокдауна винкулина даже на ранних стадиях закрытия раны (в течение 3 часов) край клеточной раны стал изрезанным и неровным. Движение клеток в слое стало нескоординированным. Через 3 часа клетки вышли из монослоя, продолжая хаотично перемещаться вдоль границы монослоя (латеральная миграция). Для анализа влияния FAK на параметры клеточных контактов, мы провели нокдаун FAK с помощью siRNA в тех же экспериментальных условиях, что и для винкулина. Используя специфическую siRNA, мы получили 4-6-кратное снижение экспрессии FAK в клетках A549 и 3-4-кратное снижение уровня экспрессии FAK в клетках HaCaT (рис. 2 Б, Г). Снижение уровня экспрессии FAK в клетках A549 не влияло на площадь или морфологию ФК (средняя площадь ФК 1,11 мкм2, медиана AR 1,84), снижение уровня экспрессии FAK в клетках HaCaT также не влияло на морфологию ФК (медиана площади FA 0,98, медиана AR 1,84) (рис. 4А). Чтобы подтвердить отсутствие изменений площади ФК, мы окрашивали клетки с нокдауном FAK антителами к паксиллину в качестве альтернативного белка-репортера ФК (рис. 3B, 4B). Мы не обнаружили существенных различий в морфологии клеток для контрольных клеток и клеток с нокдауном FAK, но скорость закрытия раны в клетках с низкой экспрессией FAK резко замедлилась. Клетки A549 со сниженным уровнем экспрессии FAK при нанесении на фибронектин закрывали до 65,84 ± 5,25% % раны за 600 минут (по сравнению со 100% в контроле) (рис. 3 Е, Ж). Тот же эффект наблюдался для клеток HaCaT на фибронектине, поскольку закрытие раны составило всего 43,52±16,06% % по сравнению с 61,74±16,88% % в контроле (рис. 4В, Д). Для клеток с нокдауном FAK на стекле закрытие раны составляло 77,65±19,68% за 600 минут для клеток A549, и 26,88±13,04% % для клеток HaCaT. Кроме Кроме того, при снижении уровня экспрессии FAK достоверно снизилось время жизни ФК. Для A549 среднее время жизни ФК уменьшилось с 45 до 32 минут на фибронектине и с 42 до 30 минут на стекле. Для клеток HaCaT среднее время жизни ФК уменьшилось с 20 до 12 минут на фибронектине и с 30 до 20 минут на стекле. Чтобы подтвердить этот вывод, мы использовали селективный ингибитор FAK-киназы PF-573228 и оценили влияние ингибирования FAK на параметры ФК и скорость закрытия раны в экспериментальных условиях. Инкубация с 1 мкм PF-573228 не повлияла на среднюю площадь ФК клеток HaCaT и A549, а также на соотношение сторон и интенсивность флуоресценции (данные не показаны), но резко снизила скорость закрытия раны. Процент закрытия раны на стекле для клеток A549 с инактивированным FAK составил всего 59.42±5.69% (по сравнению со 100% в контроле) и только 19,26±7,48% для клеток HaCaT (по сравнению с 44% в контроле). Процент закрытия раны фибронектином для клеток A549 с инактивированным FAK составил всего 77,87±3,77% и 30,15±5,86% для клеток HaCaT. Заключение Наши результаты показывают, что снижение экспрессии винкулина приводит к существенному уменьшению размера ФК, но не влияет на параметры миграции эпителиальных клеток в монослое, хотя в ране появляется много хаотично мигрирующих неполяризованных клеток. Это согласуется с предыдущими наблюдениями о том, что винкулин играет ключевую роль в поляризации и постоянном движении клеток, а снижение уровня его экспрессии приводит к повторному изменению направления миграции (Rahman et al., 2016). Эти данные также указывают на то, что нокдаун винкулина нарушает не только клеточный матрикс, но и межклеточные адгезии. В отличие от винкулина, истощение FAK не влияет на размер ФК, но значительно замедляет движение слоя эпителиальных клеток как для нормальных кератиноцитов, так и для клеток рака легкого, что согласуется с другими исследованиями, показывающими, что инактивация FAK значительно снижает скорость клеток (Iwanicki et al., 2008; Richardson et al., 1997; Сяо и др., 2013). Интересно, что влияние нокдауна FAK на скорость клеток гораздо менее драматично при оценке в модели случайного блуждания (Fraley et al., 2010), что может отражать ключевое различие между миграцией клеток в слое и подвижностью отдельных клеток. Примечательно, что мы наблюдали статистически значимое снижение продолжительности жизни ФК в клетках с нокдауном FAK. Согласно литературным данным, киназа FAK стимулирует обновление ФК (Giannone et al., 2004; Webb et al., 2004) посредством тонкой настройки динамики других регуляторных белков (Horton et al., 2016; von Wichert, Haimovich, Feng, & Sheetz, 2003). Известно, что клетки с инактивированной или сниженной FAK имеют уменьшенное время разборки и значительно более длительное время жизни FA (Ilić et al., 1995; Slack-Davis et al., 2007). Большинство из этих наблюдений были сделаны на отдельных клетках в 2D случайном блуждании или 3D модели миграции. В наших экспериментах мы оценивали время жизни ФК для клеток, движущихся внутри эпителиального слоя, и показали, что нокдаун FAK приводит к значительному уменьшению времени жизни ФК как для клеток, нанесенных на стекло, так и для клеток на фибронектине. Наши данные показывают, что площадь ФК не так критична, как время жизни ФК, для определения скорости клетки в монослое. Короткоживущие ФК не успевают прикрепиться к субстрату и не создают эффективного натяжения для продвижения слоя вперед, хотя этот вывод еще предстоит подтвердить в анализах с прямым измерением сил сцепления для клеточных слоев, движущихся по гибким (сминающимся) подложкам. Вместе эти данные свидетельствуют о том, что изменение либо уровня экспрессии, либо активации регуляторной киназы FAK резко изменяет скорость миграции как нормальных, так и раковых эпителиоцитов, что делает FAK многообещающей мишенью для замедления миграции клеток рака легких.
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Роль цитоскелета в клеточной подвижности
Результаты этапа: Верификация нокдауна методами ПЦР и Вестерн блот анализа Подтверждение эффективности подавления экспрессии всех изоформ MYO1C (далее миозин 1С) на уровне мРНК проводили при помощи количественного ПЦР в реальном времени с использованием праймеров к консенсусной последовательности гена MYO1C (MYO1Cpan). Уровень экспрессии гена-мишени в контроле был принят за 1. Данные приведены в относительных единицах, полученных путем деления на контроль без трансфекции. Трансфекция siRNA к консенсусной последовательности гена MYO1C приводит к снижению уровня экспрессии мРНК общего миозина 1С в клетках РС-3 в 3.5 раза, в клетках DU145 в 2.1 раза (р≤0.1, критерий Манна-Уитни, n=3) (Рис. 3А, Б). Данные ПЦР в реальном времени были верифицированы методом вестерн блот анализа с использованием антител к консенсусному эпитопу, который показал снижение количества миозина 1С как при нокдауне изоформы А, так и при нокдауне тотального миозина 1С (Рис. 3Д, Е). Подтверждение эффективности подавления изоформы А миозина 1С проводили только на уровне мРНК с использованием специфичных к данной изоформе праймеров (MYO1C-А). За контроль, равный 1, принимали экспрессию гена-мишени в клетках без трансфекции. При использовании siRNA к изоформе А миозина 1С наблюдается статистически достоверное снижение экспрессии изоформы А миозина 1С в клетках линии РС-3 (р≤0.1, критерий Манна-Уитни, n=3) в 4.4 раза (Рис. 3В), в клетках DU145 – в 3.9 раза (Рис. 3Г). Таким образом, для модельных клеточных линий PC-3 и DU145 методами ПЦР в реальном времени и вестерн блот анализа было показано эффективное подавление как изоформы А миозина 1С, так и всех изоформ миозина 1С при использовании siRNA к соответствующим последовательностям. Экспрессия маркеров ЭМП/МЭП в клеточной линии РС-3 Изменение уровней экспрессии маркеров ЭМП/МЭП после нокдауна изоформ миозина 1С в клетках линии РС-3 было измерено методом количественного ПЦР в реальном времени (Рис. 4). Данные приведены в относительных единицах, полученных путем деления на контроль без трансфекции, значения экспрессии гена мишени в котором принимали за 1. В клетках PC-3 мы не выявили статистически достоверного изменения в уровне экспрессии маркеров ЭМП/МЭП: SNAIL, SLUG, E-кадгерина, виментина. Для маркера ЭМП/МЭП N-кадгерина n = 2, поэтому статистические тесты не применимы. Однако на уровне тенденции заметно, что нокдаун изоформы А миозина 1С, и всех трех изоформ приводит к повышению экспрессии транскрипционных факторов SNAIL и SLUG и снижению экспрессии N-кадгерина. Нокдаун изоформ миозина 1С также не приводит к заметным морфологическим изменениям клеток РС-3 в культуре. После нокдауна изоформ миозина 1С клетки преимущественно формируют эпителиальные островки, как и в контроле (Рис. 5). Данные ПЦР в реальном времени были верифицированы методом иммуноцитохимического окрашивания на уровне трансляции с расчетом средней интенсивности флуоресценции (СИФ) миозина 1С и маркеров ЭМП/МЭП. СИФ отражает плотность молекул белка внутри выделенной области в цитоплазме. Оценка двойного окрашивания миозин 1С /SNAIL Медиана СИФ миозина 1С в контрольных клетках составляет 559.4 усл.ед. (306.2-724.5, n = 10), после проведения нокдауна достоверно снижается в 2 раза, до 297 усл.ед. (89.72-527.8, n = 10) (р = 0.0005, критерий Манна-Уитни). В контрольных клетках РС-3 SNAIL выявляется в виде равномерно распределенных по цитоплазме гранул, тогда как после подавления экспрессии миозина 1С его локализация становится преимущественно околоядерной. Медиана СИФ для SNAIL в контрольных клетках составляет 4226 усл.ед. (3368-6629, n = 10), после проведения нокдауна достоверно увеличивается в 1.4 раза, до 6818 усл.ед. (5215-8141, n = 10) (р = 0.0011, критерий Манна-Уитни) (Рис. 6).  Оценка двойного окрашивания миозин 1С /SLUG Медиана СИФ миозина 1С в контрольных клетках РС-3 составляет 591.2 усл.ед. (432.1-82.3, n = 10). Подавление экспрессии данного белка приводит к достоверному снижению его медианного значения СИФ в 2.1 раз, до 283,3 усл.ед. (218.3-423.7, n = 10) (р<0.0001, критерий Манна-Уитни). SLUG выявляется как в контрольных клетках, так и после нокдауна миозина 1С. В контрольных клетках SLUG представлен в виде гранул, которые относительно равномерно диспергированы в цитоплазме. После нокдауна миозина 1С локализация гранул SLUG становится преимущественно околоядерной. В контрольных клетках РС-3 медианное значение СИФ для SLUG составляет 6933 усл.ед. (5505-8359, n = 10), после проведения нокдауна медиана СИФ достоверно увеличивается в 1.2 раза, до 8065 усл.ед. (7231-10649, n = 10) (р = 0.0068, критерий Манна-Уитни) (Рис. 7). Оценка двойного окрашивания миозин 1С /E - кадгерин Медианное значение СИФ миозина 1С в контроле составляет 1289 усл.ед. (1071-1627, n = 10), после проведения нокдауна медиана СИФ достоверно снижается в 1.9 раз, до 610.8 усл.ед. (547.4-885, n = 10) (р<0.0001, критерий Манна-Уитни). В контрольных клетках Е-кадгерин распределен относительно равномерно, медиана СИФ составляет 535.2 усл.ед. (292.6-852.3, n = 10), при подавлении миозина 1С Е-кадгерин локализован преимущественно в околоядерной области, медиана СИФ увеличивается в 1.3 раза, до 758.9 усл.ед. (617.6-1185, n = 10) (р = 0.0011, критерий Манна-Уитни) (Рис. 8). Оценка двойного окрашивания миозин 1С /N-кадгерин Медиана СИФ миозина 1С в контрольной группе PC-3 составляет 949.2 усл.ед. (804.1-1173, n = 10), после проведения нокдауна медианное значение СИФ уменьшается в 1.9 раз, до 428.1 усл.ед. (233.9-899.6, n = 10) (р<0.0001, критерий Манна-Уитни). Как в контрольных клетках, так и при подавлении миозина 1С N-кадгерин имеет диффузное распределение. В контрольных клетках медиана СИФ N-кадгерина составляет 638.6 усл.ед. (463.8-915.3, n = 10). При подавлении миозина 1С интенсивность флуоресценции N-кадгерина достоверно снижается в 1.4 раза, медианное значение СИФ составляет 440.3 усл.ед. (280.4-699.2, n = 10) (р = 0.0052, критерий Манна-Уитни) (Рис. 9). Оценка двойного окрашивания миозин 1С /виментин Медианное значение СИФ миозина 1С в контрольных клетках РС-3 составляет 1148 усл.ед. (718.8-1697, n = 10), при подавлении изоформ миозина 1С медиана СИФ уменьшается в 1.8 раз и составляет 687 усл.ед. (472.6-853.8, n = 10) (статистически достоверные отличия, р = 0.0001, критерий Манна-Уитни). В контрольных клетках и в клетках после подавления экспрессии миозина 1С виментин представлен как в виде коротких филаментов, так и в виде везикул. Медиана СИФ виментина в контрольных клетках составляет 1617 усл.ед. (1422-2053, n = 10). После проведения нокдауна филаменты виментина разбираются, он представлен в виде гранул, медиана СИФ составляет 1857 усл.ед. (1375-2349, n = 10), что статистически не отличается от контрольных значений (р>0.05, критерий Манна-Уитни) (Рис. 10). Таким образом, результаты иммуноцитохимического окрашивания согласуются с молекулярными данными ПЦР в реальном времени и свидетельствуют о протекании ЭМП в клетках РС-3 после нокдауна миозина 1С. Экспрессия маркеров ЭМП/МЭП в клеточной линии DU145 Уровень экспрессии маркеров ЭМП/МЭП после нокдауна изоформ миозина 1С в клетках линии DU145 был измерен при помощи количественного ПЦР в реальном времени (Рис. 11). Данные приведены в относительных единицах, полученных путем деления на контроль без трансфекции (значения экспрессии гена-мишени в контроле приняли за 1). При нокдауне изоформы А миозина 1С и всех изоформ миозина 1С наблюдается статистически достоверное (р≤0.1, критерий Манна-Уитни, n = 3) увеличение экспрессии транскрипционного фактора SNAIL в 2 раза. Также при нокдауне всех изоформ миозина 1С в 1.5 раза снижается экспрессия виментина (р≤0.1, критерий Манна-Уитни, n = 3). Для маркеров ЭМП/МЭП SLUG, Е-кадгерина и N-кадгерина n = 2, поэтому статистическая обработка данных не проводилась. Тем не менее, для SLUG и N-кадгерина наблюдается тенденция к росту уровня экспрессии, а для Е-кадгерина к снижению при нокдауне как всех изоформ миозина 1С, так и только изоформы А, относительно контроля. Нокдаун изоформ миозина 1С приводит к изменениям в морфологии клеток DU145 в культуре. После нокдауна изоформ миозина 1С клетки преимущественно располагаются поодиночке в отличие от контроля, в котором клетки формируют эпителиальные островки (Рис. 12). Данные ПЦР в реальном времени были верифицированы методом иммуноцитохимического окрашивания с расчетом средней интенсивности флуоресценции для миозина 1С и каждого маркера ЭМП/МЭП. Оценка двойного окрашивания миозин 1С /SNAIL Медианное значение СИФ миозина 1С в контрольных клетках DU145 составляет 1217 усл.ед. (812-2373, n = 10), после трансфекции siRNA к консенсусному участку белок-кодирующей области гена MYO1C медиана СИФ уменьшается в 1.7 раз и медиана составляет 776.7 усл.ед. (415.8-1245, n = 10) (статистически достоверные отличия, р = 0.0021, критерий Манна-Уитни). В контрольных клетках DU145 SNAIL выявляется в виде мелких гранул и относительно равномерно диспергирован в цитоплазме. После нокдауна миозина 1С локализация SNAIL становится преимущественно околоядерной. Медиана СИФ SNAIL в контрольных клетках составляет 938 усл.ед. (8.43-2793, n = 10). После подавления экспрессии миозина 1С медиана СИФ SNAIL составляет 2765 усл.ед. (50.18-5166, n = 10), что статистически отличается от контрольных значений в 2.7 раз (р = 0.0152, критерий Манна-Уитни) (Рис. 13). Оценка двойного окрашивания миозин 1С /SLUG В контрольных клетках DU145 медиана СИФ миозина 1С составляет 1727 усл.ед. (59.06-2366, n = 10). После проведения нокдауна медианное значение СИФ статистически достоверно снижается в 2.9 раз и становится 507.9 (3.05-1271, n = 10) (р = 0.0221, критерий Манна-Уитни). SLUG в контрольных клетках DU145 представлен в виде гранул и распределен относительно равномерно в цитоплазме. После нокдауна миозина 1С SLUG преимущественно локализуется около ядра. Медиана СИФ SLUG в контрольных клетках составляет 2231 (1677-3206, n = 10). После трансфекции siRNA к консенсусному участку белок-кодирующей области гена MYO1C СИФ SLUG возрастает в 2.1 раз, медианное значение составляет 4895 усл.ед. (3597-6311, n = 10) (различия статистически достоверны, р<0.0001 критерий Манна-Уитни) (Рис. 14). Оценка двойного окрашивания миозин 1С /E - кадгерин Медиана СИФ миозина 1С в контрольных клетках составляет 1642 усл.ед. (1157-2057, n = 10). При нокдауне медианное значение СИФ уменьшается в 3.2 раза и составляет 410,8 усл.ед. (153.4-919.5, n = 10) (статистически достоверные отличия, р = 0.0001, критерий Манна-Уитни). Е-кадгерин в контрольных клетках DU145 распределен относительно равномерно. После подавления экспрессии миозина 1С локализация Е-кадгерина смещается в околоядерную область. Медиана СИФ Е-кадгерина в контрольных клетках составляет 1711 усл.ед. (1303-2712, n = 10). После проведения нокдауна медиана СИФ Е-кадгерина увеличивается в 1.8 раз относительно контрольных значений и составляет 3199 усл.ед. (2695-4144, n = 10) (р<0.0001, критерий Манна-Уитни) (Рис. 15). Оценка двойного окрашивания миозин 1С /N - кадгерин Медианное значение СИФ миозина 1С в контрольных клетках составляет 175.3 усл.ед. (2.28-239.6, n = 10), после проведения нокдауна достоверно снижается в 3.2 раза, до 47.48 усл.ед. (13.69-105, n = 10) (р = 0.0164, критерий Манна-Уитни). N-кадгерин распределен относительно равномерно по всей цитоплазме клеток DU145 как в контроле, так и после нокдауна миозина 1С. В контрольных клетках медиана СИФ N-кадгерина составляет 270.1 усл.ед. (161.6-532.2, n = 10), подавление миозина 1С приводит к увеличению СИФ N-кадгерина в 2 раза, до 659.2 усл.ед. (474.6-822.7, n = 10) (р = 0.0001, критерий Манна-Уитни) (Рис. 16). Оценка двойного окрашивания миозин 1С /виментин В контрольных клетках DU145 медиана СИФ миозина 1С составляет 1311 усл.ед. (3.3-1876, n = 10), при подавлении экспрессии миозина 1С его медианное значение СИФ уменьшается в 2.3 раза и составляет 507.7 усл.ед. (151.4-1072, n = 10) (статистически достоверные отличия, р = 0.0185, критерий Манна-Уитни). Как в контрольных, так и в клетках с нокдауном миозина 1С виментин не собирается в филаменты, а локализован в виде гранул по всей цитоплазме. Медиана СИФ виментина в контрольных клетках составляет 675.5 усл.ед. (379.7-1012, n = 10). После проведения нокдауна медиана СИФ виментина увеличивается в 3.2 раза и составляет - 2058 усл.ед. (1073-2813, n = 10), что статистически отличается от контрольных значений (р<0.0001, критерий Манна-Уитни) (Рис. 17). Таким образом, результаты иммуноцитохимического выявления маркеров ЭМП/МЭП согласуются с молекулярными данными ПЦР в реальном времени и подтверждают протекание ЭМП в клетках DU145 после нокдауна миозина 1С.
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Роль цитоскелета в клеточной подвижности
Результаты этапа:
5 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Роль цитоскелета в клеточной подвижности
Результаты этапа:
6 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Роль цитоскелета в клеточной подвижности
Результаты этапа:
7 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. Роль цитоскелета в клеточной подвижности
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".