![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Реакции эмбриональных клеток на механические напряжения (МН) – один из ведущих факторов морфогенеза и клеточной дифференцировки, однако механизмы этих реакций лишь только начинают изучаться. Предполагается вести работу в следующих направлениях: - исследование активных реакций эмбриональных клеток на МН; - поиск механозависимых генов; - выявление рецепторов, сигнальных путей и молекулярных генераторов МН в эмбриональных клетках; - моделирование клеточных реакций на МН - исследование структурных белков, обеспечивающих механическое сопряжение клеток и тканей - исследование МН на процессы нарушения симметрии частей тела и органов в развитии животных -исследование молекулярных механизмов нарушения симметрии частей тела и органов в развитии животных
The response of embryonic cells to mechanical stress (MS) is one of the factors affecting morphogenesis and cell differentiation, however, the mechanisms of these changes are only just at beginning to be studied. It is supposed to conduct work in the following areas: - study of the active response of embryonic cells to MS; - search for mechanically dependent genes; - identification of receptors, signaling pathways and molecular generators of MS in embryonic cells; - modeling of cellular reactions to MS - study of structural proteins that provide mechanical conjugation of cells and tissues - study of MS on the processes of symmetry breaking of body parts and organs in the development of animals - investigation of the molecular mechanisms of symmetry breaking in body parts and organs in the development of animals
Будут количественно охарактеризованы механические напряжения в супрабластопоральной области интактной средней гаструлы и растянутых эксплантатах крыши бластоцеля X.laevis с помощью FRET-зонда ActTS-GR. Полученные данные будут сопоставлены с изменением формы и траекториями движений клеток ткани в соответствующих участках интактного зародыша и эксплантатах, чтобы напрямую продемонстрировать механозависимость движений клеток, инициируемых при растяжении ткани. Будут продолжены работы по исследованию молекулярных механизмов диверсификации планов организации колоний гидроидных полипов по генам-маркерам Dlx и FAT4, выбранным на основе предварительно полученных результатов анализа RNA-seq . Будут исследованы паттерны экспрессии упомянутых генов методом гибридизации in situ и будет исследована их функция в определении порядка симметрии колоний гидроидных полипов методом RNAi. Будет прослежена локализаци белка Germes в ооцитах и фолликулярных оболочках методом иммуногистохимии с использованием выделенных нами антител. Будет предпринята попытка визуализировать мигрирующие ППК по присутствию в них белка Germes, выявляемого иммуногистохимически, также как это было показано для других генов половой плазмы.
Работа, предшествующая выполнению данного этапа НИР, была направлена на решение некоторых вопросов механобиологии. Было проведено детальное исследованние микродеформации тканей в разных областях зародышей (боковых и дорсальных)на разных стадиях нормального развития (от ранней гаструлы до поздней нейрулы) для установления роли активных и пассивных компонентов в формировании паттернов МН. Была изучена вариабельность становления главной оси тела в ходе развития полипа Dynamena pumila по паттернам экспрессии генов Wnt3 и Frizzled3 (маркеров антерио-постериорной оси). Исследованы молекулярные механизмы понижения порядка симметрии при морфогенезе верхушки роста побега колонии Dynamena pumila. Начата разработка методов количественной регистрации клеточных движений и морфологических характеристик в эмбриональных тканях шпорцевой лягушки с использованием конфокальной микроскопии и автоматического анализа изображений. Было прослежено влияние искусственных деформаций на морфогенез осевых зачатков у Xenopus. Были продолжены исследования влияния блокатора форминов семейства Dia SMIFH2 на установление право-левой оси организма у амфибий.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения |
Результаты этапа: При исследовании роли механических деформаций клеточного пласта в перемещении клеток было показано, что время деформации в 10 минут и 12% амплитуда деформации эксплантата оказались минимально необходимыми для инициации движений клеток в эксплантате, заключающихся в перегруппировке клеток (единичное смещение клетки внутри пласта, приводящее к изменению положения клетки относительно соседних) и в направленной миграции (продолжительное перемещение в выделенном направлении). Перегруппировки клеток превалировали в центральной части всех исследованных эксплантатов. Направленные движения клеток наблюдали в эксплантате, если тот имел правильную форму, а ось растяжения совпадала с длинной осью эксплантата. Для получения информации о молекулярных механизмах, определяющих разный способ морфогенеза верхушки роста и, соответственно, архитектуру колоний в целом был собран материал для секвенирования (верхушки роста G. loveni, D.pumila и D.pumila после активации канонического Wnt каскада, приводящей к неразделению верхушки на три зачатка). Были осуществлены модификации методик для подбора оптимальных условий проведения секвенирования от способа выделения тотальной РНК до анализа полученных прочтений, проведенного с помощью пакета нескольких программ. При анализе первых данных мы выявили, что при активации Wnt сигнального каскада возрастает экспрессия следующих генов: Wnt16, Wnt 3, wnt 7 и notum. В дальнейших исследованиях планируем выяснить, какую функцию выполняют данные гены. При исследовании роли гена germes в оогенезе позвоночных выявили локализацию мРНК гена с помощью in situ гибридизации с окраской антителами, конъюгированными частицами золота (<1 нм), где экспрессию germes определяли по наличию золотых частиц в клетках с использованием ТЭМ на ультратонких срезах. Экспрессия germes показана в цитоплазме и ядрах фолликулярных клеток больших и малых ооцитов, а также в зоне макро- и микровиллей ооцита и фолликулярных клеток. Причем, плотность частиц коллоидного золота в ФК выше, чем в половой плазме в ооците. Динамика синтеза белка Germes в ооцитах и раннем развитии Xenopus была оценена с помощью метода Western-blotting. Показано, что белок синтезируется в течение всего периода оогенеза, в раннем развитии (с увеличением в период нейруляции) и постепенно сижается плоть до личиночных стадий (48-я последняя, изученная нами). | ||
2 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения |
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта в 2022 году были выполнены все поставленные задачи. Были получены данные по изменению формы и траекторий движений клеток эмбриональной ткани шпорцевой лягушки в соответствующих участках интактного зародыша и эксплантатах, для последующих исследований механозависимых движений клеток, которые, возможно, инициируются при растяжении ткани в ходе нормального развития. Был сконструирован генетически-кодируемый FRET-зонд ActTS-GR для количественных исследований распределения механических напряжений в супрабластопоральной области интактной средней гаструлы и растянутых эксплантатах крыши бластоцеля X.laevis. Были продолжены работы по исследованию молекулярных механизмов диверсификации планов организации колоний гидроидных полипов по генам-маркерам Dlx и FAT4, выбранным на основе предварительно полученных результатов анализа RNA-seq. Были исследованы паттерны экспрессии упомянутых генов методом гибридизации in situ , а также начаты исследования их функций в определении порядка симметрии колоний гидроидных полипов методом RNAi. Также, мы исследовали локализацию белка Germes в ооцитах и фолликулярных оболочках методом иммуногистохимии, с использованием выделенных нами антител. Нам удалось показать, что белок Germens экспрессируется в мигрирующих первичных половых клетках и что с помощью метода иммуногистохимии с применением антител против Germes возможно их визуализировать, так же как это было показано для других генов половой плазмы. Также нами был выявлен данный белок в фолликулярных клетках. | ||
3 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения |
Результаты этапа: Проведен анализ морфогенетических движений клеток, визуализированных с помощью генетически-кодируемых маркеров клеточных мембран и ядер, в супрабластопоральной области зародышей шпорцевой лягушки. При цейтраферной съемке регистрировали скорость и сонаправленность движений клеток и их микродеформации, являющиеся показателем механических напряжений, возникающих в ткани. Используя математический анализ микродеформаций и FRET-зонд ActTS-GR , установили, что наиболее сильные напряжения характерны для медиальной области эмбриона в ходе гаструляции. Эксперименты по контролируемому автоматизированному растяжении эксплантатов эмбриональной ткани на разработанной нами установке показали, что клеточные перестройки компенсируют усиленное растяжение ткани в ходе процесса гаструляции. Методом гибридизации in situ получены пространственно-временные паттерны экспрессии генов Wnt-лигандов (wnt2, wnt3, wnt6, wnt7, wnt8 и wnt9/11), генов компонентов сигнального пути cWnt (axin, β-catenin и tcf), а также эндогенных ингибиторов этого сигнального пути (sfrp1 и notum) в ходе морфогенетического цикла верхушка роста побега Dynamena pumila. Показано, компоненты сигнального пути cWnt участвуют в предразметке верхушки роста с самого начала морфогенеза, а различия в их активности направляет спецификацию зачатков. Показана видоспецифичная роль гена Nodal в регуляции пространственной архитектуры колоний гидроидных полипов D.pumila и G. loveni. При исследовании гена germes (маркера половой плазмы и первичных половых клеток) в ооцитах и фолликулярных клетках шпорцевой лягушки подобраны условия выявления непроцесированной мРНК данного гена. Установлено, что в фолликулярных клетках ооцитов малого и большого роста и в самих ооцитах малого роста выявляется непроцесированная мРНК, т.е.продолжается транскрипция указанного гена. На поздних стадиях оогенеза в ооцитах транскрипция гена germes не происходит, присутствует только запасенная мРНК. Проведенный структурный анализ последовательности самого белка germes указывает на возможность его взаимодействия с белками, а локализация в области клеточных контактов - на его траспортную функцию. | ||
4 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения |
Результаты этапа: | ||
5 | 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. | Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".