![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Исследования будут направлены на изучение механизмов и условий направленной дифференцировки при культивировании in vitro клеток млекопитающих различной степени комитации и их поведения при трансплантации в организм животного-реципиента.
The research will focus on the mechanisms and conditions of directed differentiation during cultivation of in vitro mammalian cells of varying degrees of comitation and their behavior after transplantation into the body of the animal recipient.
Будет проведено исследование влияния кондиционированных сред регенератов сетчаток тритона на дифференцировку ретинального пигментного эпителия человека in vitro. Будут охарактеризованы нейральные производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и их экзосом в ходе культивирования данных клеток. Будет проведен сравнительный анализ транскриптомных данных мейоцитов человека и мейоцитов, полученных in vitro из ИПСК человека.
Проводили эксперименты по влиянию на клетки пигментного эпите- лия линии ARPE-19 сред, кондиционированных культивируемыми регене- ратами сетчатки тритонов. Выявлено изменение морфологии клеток ли- нии пигментного эпителия ARPE-19 и, снижение пролиферативной актив- ности. Прослежено изменение паттернов экспрессии ряда характеристиче- ских генов (OCT4 и NANOG; NES; OTX2; KLF4 ;BMP4, KRT18; TUBB3; CCND1; COL1A1), а также иммуноцитохимически показано снижение интенсивно- сти окрашивания клеток на коннексин 43; возрастание – на цитокератин 8 и βIII-тубулин, а также изменение распределения β-катенина Были оха- рактеризованы внеклеточные везикулы эмбриональных стволовых клеток человека линии hES-MK05 по морфометрическим параметрам и по профи- лю основных маркерных белков плюрипотентности. Их сопоставление с ха- рактеристиками. везикулярных частиц иПСК, выявили определенные раз- личия. Показана возможности диффференцировки in vitro индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в клетки половой линии вплоть до мейоцитов (появление маркеров мейоза STRA8 и SCP3). При исследова- нии тканевой модели живого эквивалента кожи in vitro в кератиноцитах, культивируемых после криохранения, выявлено изменения уровня экспрес- сии генов,кодирующих некоторые кератины.(интегрина α6 и интегрина β1), тенденция к увеличению процента клеток с фенотипом стволовых, а также значительное повышение количества в популяции голоклонов/мероклонов/ параклонов по сравнению с культурами до криоконсервации
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro. |
Результаты этапа: Показано, что мелатонин активирует в клетках человека линии ARPE-19 (клетки пигментного эпителия глаза) начальные этапы пронейральной дифференцировки: стимулирует увеличение размеров клеток (на 25%) за первые сутки культивирования, снижает пролиферацию клеток от 15.5% до 40% (МТТ-тест), снижает экспрессию РПЭ- маркеров и в течение 24-48 ч. повышает уровнь экспрессии маркеров нейральной дифференцировки Nestin и TubB3 (Метод ПЦР в реальном времени). При исследовании регуляторных свойств везикулярного компонента паракринной секреции клеток проведен выбор референсных генов и прослежено содержание маркеров плюрипотентности (Oct4, Sox2 и Nanog), маркеров ранней нейральной дифференцировки (Pax6, Nestin), маркеров нейронов (TubB3, MAP2) и астроцитов (S100B), а также содержания микроРНК в клетках и их везикулах в ходе нейральной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК) человека. Показано, что на 35 сутки дифференцировки in vitro в нейральных производных ИПСК сохраняется экспрессия Oct4, Sox2 и Nanog и выявляется экспрессия Pax6, Nestin, TubB3, MAP2 и S100B, а в их везикулах, выявлены мРНК генов-маркеров только нейральной дифференцировки и Sox-2. Как в ИПСК и в их нейральных производных (НП-ИПСК), так и во внеклеточных везикулах обоих типов клеток выявлены микроРНК-151 и -486. Везикулы от ИПСК, так и от НП-ИПСК вызывают некоторое усиление пролиферации ИПСК в культуре, но не влияют на уровень экспрессии маркеров плюрипотентности.Проведены пилотные эксперименты по исследованию стволовых клеток и их везикул методом ToF-SIMS. При анализе генетических изменений в процессе получения половых клетки человека in vitro из ИПСК посредством мейотической индукции, был выполнен транскриптомный анализ (RNAseq) ИПСК, ППК-подобных и мейоцитоподобных клеток человека. Биоинформационный анализ совокупности всех РНК-транскриптов продемонстрировал соответствие изменений в ряду ИПСК – ППК-подобные – мейоцит-подобные клетки согласно генной онтологии изменениям при дифференцировке ППК в мейотические клетки in vivo. В рамках работы по оптимизации тканевой модели живого эквивалента кожи in vitro для регенеративной биомедицины проследили динамику изменений клеток в культуре кератиноцитов человека после криохранения в суспензии. Методами иммуноцитохимии, ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга и проточной цитометрии показали, что к 7-му дню культивирования после криохранения восстанавливаются основные показатели популяции (уровень содержания маркерного белка p63; уровень экспрессии гена, кодирующего α6-интегрин, скорость колонеобразования), а также способность кератиноцитов образовывать эпидермальный эквивалент кожи становится сопоставимой с таковой в кератиноцитах до криохранения - они могут формировать 1-2 клеточных слоя на синтетическом коллагеновом каркасе. | ||
2 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro. |
Результаты этапа: При изучении пронейральной дифференцировки клеток ретинального пигментного эпителия человека прослежена динамика изменения профиля экспрессии генов OCT4, NANOG, KLF4, PAX6, OTX2, MITF, NES, TUBB3, BMP2, BMP4, KRT18, CTNNB1, GSK3B, CCND1 в клетках культуры ARPE-19 под действием кондиционированной среды регенератов сетчаток тритонов. Показано, что изменения соответствуют состояниям эпителио-мезенхимного перехода и дифференцировке клеток по нейральному пути. При исследовании внеклеточных везикул (ВВ) клеток с индуцированной плюрипотентностью (ИПСК) и их нейральных производных (НП-ИПСК) прослежено изменение профиля микроРНК в клетках и в ВВ, коррелирующее с направлением процесса дифференцировки ИПСК – в частности, происходит снижение содержания микроРНК-302d-3p и микроРНК-302b-3p, характерных для состояние плюрипотентности, и появление микроРНК-99а-5р, характерной для нейральной дифференцировки. При изучении биологического действия внеклеточных везикул на модели культуры фибробластов линии HdFb(d75)GFP (характеризующихся длительным клеточным циклом) показано, что добавление к среде инкубации ВВ, секретируемых как от ИПСК, так и НП-ИПСК на продвинутых фазах дифференцировки, не влияет на пролиферативную активность, оцениваемую методом проточной цитофлюориметрии и иммуноцитохимии. Анализ (PCA) транскриптомных данных методом главных компонент подтверждена близость и схожесть клеток, получаемых нами при индукции мейоза в культивируемых плюрипотентных клетках, и клеток Yamashiro (2018),полученных в результате дифференцировки ППК-подобных клеток из ИПСК. Транскриптом клеток при индукции мейоза в ИПСК показал возрастающую экспрессию вовлеченных в процесс мейоза генов- SCP2/3, REC8, MSX1/2, MAEL и DUSP18. В период дифференцировки увеличивали экспрессию гены DAZAP2, LEF1 и KRBOX4. Гены ключевых сигнальных молекул BMP2/4/5/7 и RSPO1/Wnt4 активровались во время спецификации и развития ППК-подобных клеток, параллельно с повышеннием уровня транскриптов ключевых сигнальных рецепторов (BMPR2, BMPR1A, BMPR1B) и их мишеней (ID1, ID2, ID3, ID4, MSX1 / 2). | ||
3 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro. |
Результаты этапа: Были проанализированы и обобщены в свете собственных данных материалы по морфологическим и молекулярно-генетическим исследованиям гетерогенности клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) у млекопитающих и человека, по механизмам репрограммирования не нейрональных клеток ЦНС (в т.ч. и РПЭ) в нейроны in vitro и in vivo. Анализ протеомных профилей внеклеточных везикул (ВВ) индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека(ИПСК-ч) и нейрональных производных(НП) этих клеток выявил около 1000 белков. Функциональная аннотация представленности белков, проведенная с использованием баз данных Reactom, GO CC, GO BP и KEGG продемонстрировала, что ВВ НП-ИПСК-ч содержат значительное количество белков, связанных с нейрональной дифференцировкой клеток и приобретения ими функциональной спецификации. Предварительно мы выявили, что ВВ НП-ИПСК содержат мРНК генов-маркеров нейрональной дифференцировки (Pax6, Nestin,TUBBIII, Map2 и S100B). Показано, что при добавлении таких внеклеточных везикул в среду культивирования ИПСК-ч (среда N2B27), в этих клетках уже на 7 сутки выявляются признаки ранней нейрональной дифференцировки - экспрессия гена FoxA2.Регуляторный эффект определяется концентрацией добавляемых ВВ. Исследование химического состава ВВ от ИПСК-ч и НП-ИПСК-ч методами рамановской спектроскопии показало полосы липидов, а также более выраженные для ВВ НП-ИПСК полосы нуклеиновых кислот и белков, содержащих ароматические структуры. Хемометрический анализ рамановских спектров везикул с помощью алгоритмов PCA и PLS-DA показал, что спектральные данные ВВ ИПСК и ВВ НП-ИПСК различаются, но частично пересекаются. При исследовании дифференцировки ИПСК-ч в ППК-подобные клетки с применением разработанного протокола показали, что ИПСК-ч с трисомией 21 хромосомы в отличие от дифференцировки нормальных клеточных линий нарушается экспрессия гена NANOS3 - раннего маркера ППК. Экспрессия других, как ранних (PRDM1, PRDM14, STELLA и SSEA1), так и поздних маркеров ППК (DAZL и VASA), а также наличие белковых продуктов этих генов не различались. | ||
4 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro. |
Результаты этапа: | ||
5 | 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. | Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro. |
Результаты этапа: | ||
6 | 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. | Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro. |
Результаты этапа: | ||
7 | 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. | Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro. |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".