|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Дифференцировка и программируемая клеточная гибель клеток антиподального комплекса зародышевого мешка пшеницыНИР
Differentiation and programmed cell death of antipodal cells of embryo sac of wheat
- Руководитель НИР: Лазарева Е.М.
- Ответственный исполнитель: Доронина Т.В.
- Подразделение: Биологический факультет
- Срок исполнения: 1 октября 2020 г. - 1 октября 2022 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 20-34-90107Аспиранты
- Номер ЦИТИС: АААА-А20-120100190126-9
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Физико-химические основы биологии и биотехнологии
- ПН России: Науки о жизни
- Критическая технология России: Клеточные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.19.17 Цитоморфология
- 34.31.37 Биология и физиология культурных растений
-
Ключевые слова:
антиподальные клетки, политенные хромосомы, соматическая полиплоидия, программируемая клеточная гибель, зародышевый мешок
antipodal cell, embryo sac, polytene chromosomes, programmed cell death, somatic polyploidization -
Описание:
Целью проекта является изучение структуры и функций эндополиплоидных антиподальных клеток зародышевого мешка с гигантскими политенными хромосомами пшеницы на стадиях дифференцировки и гибели. Задачи проекта включают в себя: 1) изучение структурных особенностей ядра и цитоплазмы на стадии дифференцировки антиподальных клеток, 2) 3D реконструкция индивидуальных политенных хромосом на разных стадиях дифференцировки антиподальных клеток, 3) изучение судьбы основных компонентов антиподальных клеток в ходе их программируемой клеточной гибели, 4) выявление генов, повышенная экспрессия которых характерна для антиподальных клеток пшеницы на стадии дифференцировки и гибели, 5) периодизация структурно-функциональных изменений клеток антиподального комплекса (от момента оплодотворения, каждые 24 часа) на стадиях дифференцировки и ПКГ.
-
Abstract:
Antipodal cells of the embryo sac of wheat are located between the maternal tissues of the ovule and the endosperm developing after double fertilization. Antipodal cells are formed in the majority of species of flowering plants. However, in many plant species, antipodal cells degenerate before or instantly after fertilization. In cereals, antipodal cells persist for a long time after fertilization and form a multicellular ephemeral tissue. The unique structural features of antipodal cells are due to their functions at various stages of complex differentiation, when all the key processes occur in their nuclei and cytoplasm. Specifically in cereals giant polytene chromosomes are formed in the nuclei of antipodal cells. Polytene chromosomes are always formed in cells that synthesize numerous RNAs. In the nuclei of the antipodal cells, these giant chromosomes transcribe RNA encoding proteins that ensure the development and differentiation of the endosperm at the coenocyte stage. Polytene chromosomes allow antipodal cells to realize their main function - ensuring the development and protection of the emerging endosperm, which is the main tissue of the future grain. The structure of polytene chromosomes in plants differs from that in animals. However, compared to the polytene chromosomes of animals, the polytene chromosomes of plants are poorly studied. Therefore, the study of the structure of polytene chromosomes of antipodal cells has the great importance for fundamental science. The fate of antipodal cells is clearly determined, and the process of endosperm cellularization triggers the antipodal programmed cell death process. Thus, the antipodal cells are an ideal model for studying the ontogenesis of plant cells from birth to death, since their development cycle takes only 10 days, and for studying plant programmed cell death, since the cell death of plants in comparison with animal programmed cell death is poorly studied. Information about antipodal wheat cells in the modern literature is fragmentary and does not give a clear idea about the formation of their structure during the differentiation of the complex, nor about the nature of the restructuring of these cells during programmed cell death. In this project for the first time: the main morphological characteristics of antipodal wheat cells at the stage of differentiation and death will be described; the features of cells of different layers of multilevel antipodal complex, differences in localization and morphology of organelles of antipodal cells at different stages of development will be revealed; the periodization (sequence of events) of the development of antipodal cells will be performed; the expression of genes of the antipodal cells of the embryo sac of wheat will be evaluated; three-dimensional reconstruction of polytene chromosomes on isolated chromosomes and intact nuclei will be performed; the stages of formation will be studied and a model of the structure of the giant polytene chromosome of plants will be proposed, the fate of antipodal cells at the stages of programmed cell death will be studied, the distribution of the main components of giant nucleoli at the stages of programmed death will be studied; The model of formation of the structure of giant polytene chromosomes of plants and the stages of programmed cell death of highpolyploid cells of the antipodal complex are the questions of biology that have not been solved yet, but have the fundamental importance. The key role of antipodal cells in the formation of the endosperm, which is the main part of the grain, and then the bread of all mankind, assumes the use of the data obtained in this work in the agronomic research.
-
Планируемые результаты:
Ожидаемые результаты проекта относятся к области клеточной биологии. В результате проекта ожидается получение следующих ключевых результатов: 1) Будут уточнены основные морфологические характеристики антиподальных клеток на стадии дифференцировки и гибели, выявлены различия в локализации и морфологии органелл антиподальных клеток на разных стадиях развития, выявлены особенности антиподальных клеток разных ярусов антиподального комплекса. 2) Будет отработана методика выделения политенных хромосом. Проведена трехмерная реконструкция политенных хромосом на выделенных хромосомах и интактных ядрах. Отработана методика FISH-окрашивания теломерных участков политенных хромосом и иммуноцитохимического выявления центромерных участков, локализованы теломерные и центромерные участки. Предложена модель организации растительной политенной хромосомы. 3) Будут уточнены морфологические характеристики гибели антиподальных клеток. Будет изучено распределение основных компонентов гигантских ядрышек на стадиях программируемой гибели; 4) Будет проведена периодизация развития антиподальных клеток, выявленные ранее морфологические особенности привязаны к дням/часам после опыления. 5) Будет оценена экспрессия генов, характерных для антиподальных клеток зародышевого мешка пшеницы
-
Научный задел:
Впервые показано распределение фибрилларина, белка 53Кд и аргентофильных белков ядрышка в ядрах клеток антиподального комплекса и эндосперма на разных стадиях развития зародышевого мешка пшеницы. Выявлены ключевые и строго последовательные стадии развития антиподального комплекса: этап пролиферации инициальных клеток, этап функциональной дифференцировки и этап программируемой гибели. Показано, что процессы пролиферации и эндоредупликации в этих клетках строго разнесены во времени. Процесс эндоредупликации сопровождается тотальным ремоделированием хроматина, в результате которого формируются гигантские хромосомы. Предложена модель «ярусного» расположения клеток в антиподальном комплексе. Обнаружена секреторная активность, направленная в синцитий эндосперма. Индуктором клеточной гибели является дифференцирующийся эндосперм.
-
Основные результаты:
Ожидаемые результаты проекта относятся к области клеточной биологии. В результате проекта ожидается получение следующих ключевых результатов: 1) Будут уточнены основные морфологические характеристики антиподальных клеток на стадии дифференцировки и гибели, выявлены различия в локализации и морфологии органелл антиподальных клеток на разных стадиях развития, выявлены особенности антиподальных клеток разных ярусов антиподального комплекса. 2) Будет отработана методика выделения политенных хромосом. Проведена трехмерная реконструкция политенных хромосом на выделенных хромосомах и интактных ядрах. Отработана методика FISH-окрашивания теломерных участков политенных хромосом и иммуноцитохимического выявления центромерных участков, локализованы теломерные и центромерные участки. Предложена модель организации растительной политенной хромосомы. 3) Будут уточнены морфологические характеристики гибели антиподальных клеток. Будет изучено распределение основных компонентов гигантских ядрышек на стадиях программируемой гибели; 4) Будет проведена периодизация развития антиподальных клеток, выявленные ранее морфологические особенности привязаны к дням/часам после опыления. 5) Будет оценена экспрессия генов, характерных для антиподальных клеток зародышевого мешка пшеницы
- Добавил в систему: Доронина Татьяна Валерьевна
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 октября 2020 г.-1 октября 2021 г. | Дифференцировка и программируемая клеточная гибель клеток антиподального комплекса зародышевого мешка пшеницы |
| Результаты этапа: С помощью методов световой и трансмиссионной электронной микроскопии были выявлены основные характеристики клеток антиподального комплекса на стадии гибели. Было показано, что ядра клеток с политенными хромосомами меняют свою структуру, а компоненты (белки и РНК) ядрышка перемещаются в область политенных хромосом, происходит экструзия гранулярного компонента ядрышка и частей хроматина в цитоплазму через разрывы ядерной оболочки. Впервые показано наличие разрывов в ДНК по методу TUNEL. Число органелл цитоплазмы уменьшается, происходит изменение их структуры. Впервые продемонстрирован выход цитохрома с из митохондрий антиподальных клеток. Была проведена периодизация развития антиподальных клеток. Для этого было проведено опыление кастрированных растений пшеницы, выращивание их в изоляторах, и фиксация через равные промежутки времени. Изучение общей морфологии фиксированных на разных стадиях антиподальных клеток показало, что события дифференцировки занимают 0-5 сутки после оплодотворения, события гибели – 5-10 сутки. Индивидуализация политенных хромосом происходит на 2-3 сутки после оплодотворения, первые признаки гибели – уплотнение и сближение хромосом наблюдаются на 5-6 сутки, на 6 сутки в отдельных ядрах комплекса выявляются разрывы ДНК и выход цитохрома с. По результатам исследования было подготовлено 3 доклада на российской и международной конференциях, опубликована статья. | ||
| 2 | 1 октября 2021 г.-1 октября 2022 г. | Дифференцировка и программируемая клеточная гибель клеток антиподального комплекса зародышевого мешка пшеницы |
| Результаты этапа: Нами был разработан метод приготовления препаратов политенных хромосом. На выделенных хромосомах и в составе интактных ядер были локализованы теломерные и центромерные участки хромосом методом FISH. На стадии ранней дифференцировки в ядрах с неиндивидуализованными политенными хромосомами сохранялось рабл-положение хромосом, когда все теломерные районы были локализованы на одной стороне ядра, а центромерные участки – на другой. Хроматиды (хромонемы) теломерных участков политенных хромосом не объединены. На стадии гибели теломерные и центромерные повторы маркировали индивидуальные или сближенные области объединенных хромосом. В интерфазных ядрах эндосперма на стадиях G1 и G2 локализованы теломерные участки хромосом, определено число теломерных участков в этих клетках. Проведенные подсчеты позволили определить число раундов эндоредупликации хромосом антиподальных клеток после завершения пролиферации. Анализ ультраструктуры политенных хромосом антиподальных клеток позволил выявить субъединицу политенных хромосом и создать гипотетическую модель политенной хромосомы растений. Проведена оценка экспрессии генов пшеницы, участвующих в защитных, антистрессовых и метаболических процессах с помощью real-time ПЦР. Идентификация ключевых транскриптов и выяснение профилей экспрессии генов в антиподальных клетках очень важно для понимания их функций. Данные о генах, которые могут экспрессироваться в антиподальных клетках пшеницы, в литературе отсутствуют, поэтому любой прогресс в этой области значителен. В качестве исследуемых генов мы выбрали YUCCA 9 – auxin metabolism, Cytochome p450, AT5G01860 - C2H2 and C2HC zinc fingers superfamily protein, At1g77790 - glycosyl hydrolase family 17 protein, Hsp70, At2g31030 - oxysterol-binding family protein. В литературе выявлены гены, экспрессирующиеся в антиподальных клетках Arabidopsis. Среди этих генов нами были выбраны те гены, которые имели ортологи у пшеницы и описанную функцию. Одна из возможных функций антиподальных клеток – защитная, поэтому для изучения выбраны гены: цитохром p450, который экспрессируется в антиподах Arabidopsis, и ген Hsp70, семейства белков теплового шока, который экспрессируется в клетках с политенными хромосомами двукрылых. Также была изучена экспрессия гена гидролазы (Glycosyl hydrolase family 17 protein) и гена, связанного с метаболизмом стероидов (Oxysterol-binding family protein), активно экспрессирующиеся в антиподальных клетках Arabidopsis. Поскольку растительные гормоны регулируют фактически все события в развитии растений, нами был выбран ген, связанный с метаболизмом этилена, экспрессировавшийся в антиподах Arabidopsis и ген, связанный с метаболизмом ауксина, т.к. было показано, что ауксин влияет на начальные стадии онтогенеза антиподальных клеток у Zea mays. Для данных генов были найдены ортологи у пшеницы с помощью базы данных Plaza. В качестве референсного гена был взят Ta54227. Были оценены относительные уровни экспрессии генов в чистой фракции антиподальных клеток. Для сравнения были определены относительные уровни экспрессии этих же генов во фракции всех клеток зародышевого мешка (включающего в себя зародыш, эндосперм и антиподальные клетки) и в клетках корня. В антиподальных клетках наибольшая экспрессия показана для генов цитохрома p450 (в 4,6 раза сильнее референсного гена) и Hsp70 (в 10,4 раза сильнее референсного гена). Сравнение экспрессии генов чистой фракции антиподальных клеток с фракцией всех клеток зародышевого мешка показало, что экспрессия всех генов, за исключением YUCCA 9, в антиподальных клетках выше, чем в клетках зародышевого мешка. Экспрессия гена цитохрома р450 была в 1,9 раза, гена белка, связанного с метаболизмом этилена - в 2,1 раза, гена белка из семейства гликозилгидролаз 17 - в 3,9 раза, Hsp70 - в 9,5 раза, а гена оксистерол-связывающего белка - в 6,3 раза выше в антиподальных клетках по сравнению с фракцией всех клеток зародышевого мешка. Показано, что экспрессия большинства изученных генов в клетках корня была выше по сравнению с их экспрессией в антиподальных клетках и клетках зародышевого мешка. Исключением был ген Hsp70, который экспрессировался в 1,8 раза сильнее в антиподальных клетках по сравнению с клетками корня. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".