Повышение чувствительности опухолевых клеток к терапии путем таргетирования антиапоптотического белка Mcl-1НИР

Enhancement of tumor cell sensitivity to therapy by targeting the anti-apoptotic protein Mcl-1

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 6 марта 2020 г.-31 декабря 2020 г. Повышение чувствительности опухолевых клеток к терапии путем таргетирования антиапоптотического белка Mcl-1
Результаты этапа: Селективная детекция изоформ Mcl-1S и Mcl-1L с помощью ПЦР в реальном времени требует подбора праймеров, специфичных для каждого транскрипта, при этом один из пары праймеров для короткой изоформы должен располагаться на стыке экзонов ("splice-junction"), соседствующих после исключения промежуточного экзона (для изоформы Mcl-1S: стык экзонов 1 и 3 после исключения экзона 2 в процессе АС). Создание обычного праймера, специфичного к splice-junction, является наиболее простым, экономичным и, как правило, достаточным для реализации поставленных задач. Подбор праймеров осуществляли с помощью онлайн-ресурса NCBI Primer-BLAST (NIH), также дающего возможность выявить неспецифические внутриклеточные мишени подобранных праймеров и избежать нежелательных продуктов амплификации. Помимо этого, придерживались стандартных эмпирических критериев подбора праймеров для ПЦР в реальном времени (размер праймера - 15-25 п.н., длина полученных ампликонов 75-200 п.н. и другие). Селективность подобранных праймеров была проверена методом качественной ПЦР и секвенированием продуктов амплификации (секвенирование образцов после постановки количественной ПЦР было выполнено компанией Евроген, Россия). Полученные результаты свидетельствовали о создании селективных условий для изучения экспрессии MCL-1L и MCL-1S методом ПЦР в реальном времени. Доступные для покупки первичные антитела, распознающие Mcl-1L, также детектируют Mcl-1S, более того они способны распознавать и их протеолитические фрагменты, содержащие эпитоп узнавания. Необходимо отметить, что антител для иммуноблоттинга, узнающих только Mcl-1S, но не Mcl-1L, в литературе не описано и также не было обнаружено у коммерческих предприятий. Для отличия с помощью Вестерн-блота Mcl-1S от других белковых форм, узнаваемых антителами к Mcl-1, необходим либо параллельный мониторинг каждого эксперимента методом ПЦР в реальном времени, либо введение положительного контроля. Первый способ не является предпочтительным, так как не дает прямого подтверждения того, что детектируемая методом Вестерн-блота полоса, по интенсивности коррелирующая с уровнем мРНК, относится именно к Mcl-1S. Более того, повышение уровня мРНК не всегда коррелирует с повышением уровня белкового продукта, что может вести к отсутствию согласованности между двумя измерениями разными методами. В связи с этим было принято решение ввести положительный контроль, позволяющий четко определять положение полосы Mcl-1S при иммуноблоттинге. Повышение уровня Mcl-1S в положительном контроле достигали с помощью фармакологического ингибирования белка сплайсосомы SF3B1, приводящее к проапоптотическому сплайсингу пре-мРНК MCL1. Для этого был использован низкомолекулярный ингибитор FR901464. Повышенный уровень MCL-1S при действии FR был подтвержден методом количественной ПЦР. Действие FR901464 также вело к появлению характерной полосы с молекулярной массой, соответствующей массе Mcl-1S , что показывает, что данный агент может быть использован в качестве положительного контроля для детекции Mcl-1S с помощью метода Вестерн блота. Далее была протестирована способность различных генотоксических агентов вести к повышению уровня Mcl-1S. С этой целью клетки HEK293T обрабатывали разными концентрациями цисплатина (3-15 мкМ), доксорубицина (0,1-2 мкМ) или этопозида (0,3-8 мкМ) в течение 16 часов либо постоянной дозой доксорубицина (0,5 мкМ) для разных периодов инкубации. Как можно судить по ATR / ATM-опосредованному фосфорилированию p53, указанные препараты вели к инициации клеточного ответа на повреждение ДНК. Тем не менее, ни один из указанных агентов не вел к накопления белка Mcl-1S. Дальнейшим этапом исследования стало изучение эффектов агента монастрола, обратимо нарушающего прогрессию клеточного цикла за счет ингибирования моторного белка кинезина-5. В отличие от ДНК-повреждающих агентов, действие монастрола фазоспецифично к G2/M-стадиям и опосредовано другим механизмом – нарушением динамики микротрубочек. Мы обнаружили, что обработка клеток HEK293T в течение 24 ч приводила к небольшому увеличению уровня белка Mcl-1S лишь при использовании низких концентраций агента (25мкМ), тогда как стандартные более высокие концентрации монастрола не вели к изменению уровня белка Mcl-1S. В отличие от изменений в уровне белка, уровень мРНК Mcl-1S значительно повышался (в среднем в 6.89 раз) по сравнению с контрольным уже после 4 ч инкубации клеток HEK293T с монастролом в концентрации 25 мкМ и достигал 14-кратного повышения после 24 ч обработки монастролом в указанной концентрации. В то же время значимое накопление MCL-1S по сравнению с контролем при обработке 100 мкМ монастролом отмечалось лишь на 24 ч и было ниже такового при действии 25 мкМ. Чтобы определить, происходит ли накопление Mcl-1S в процессе клеточного цикла, клетки HEK293T были синхронизированы в G1/S-фазах путем двойного тимидинового блока. Затем клетки дважды промывали PBS и добавляли среду DMEM с содержанием эмбриональной телячьей сыворотки 10% и смесью антибиотик-антимикотик Gibco. По истечении указанного времени (2, 4, 6 или 8 ч) клетки анализировали с помощью методов Вестерн-блот анализа и проточной цитометрии. Было обнаружено, что уровень белка Mcl-1S возрастает по мере входа клеток в предмитотическую и митотическую фазы. Чтобы исключить возможность того, что наблюдаемый эффект специфичен только для клеток HEK293T, был проведен анализ уровня белка Mcl-1S в фазах S и G2/M на клеточных линиях разного происхождения. В экспериментах помимо HEK293T были использованы клеточная линия эмбриональных фибробластов легкого – IMR90 и клеточные линии опухолевой этиологии – HeLa (аденокарцинома шейки матки), Caov-4 (аденокарцинома яичников), HCT116 (колоректальная карцинома), U1810 (немелкоклеточная карцинома легкого). Тенденция к накоплению изоформы Mcl-1S в фазе G2/M сохранилась во всех клеточных линиях. Тем не менее, выраженность эффекта варьировала между разными клеточными линиями. Возможным объяснением этому являются различные внутриклеточные условия, а также разная эффективность синхронизации в подобранной экспериментальной модели. В следующей части данного проекта мы изучили влияние ингибирования аутофагии на клеточную гибель в условиях генотоксического стресса и ограничения питательных веществ. Известно, что удаление факторов роста и питательных веществ из среды может приводить к усилению процессов аутофагии. Следовательно, мы выбрали депривацию сыворотки как потенциальную in vitro модель ограничения питательных веществ. Для определения интенсивности процессов аутофагии в выбранной экспериментальной модели исследовали уровень маркера аутофагии белка LC3 в клетках линий Caov-4 и HeLa. Стимулирование аутофагии приводит к конъюгации LC3-I с фосфатидилэтаноламином и появлению активной формы LC3-II, которая обладает большей электрофоретической подвижностью и детектируется в геле ниже, чем LC3-I. Повышение соотношения LC3-II/ LC3-I, как правило, свидетельствует об усилении в клетке процессов аутофагии. Для анализа уровня аутофагии клетки Caov-4 и HeLa инкубировали в стандартной среде или в условиях SD c добавлением цисплатина или без него в течение 2, 6, 12 или 18 часов, в качестве контроля клетки инкубировали в течение 2 часов в стандартной среде. Вестерн-блот анализ показал, что в условиях SD происходило накопление LC3-II, что свидетельствует о выраженном усилении аутофагии уже спустя 2 часа культивирования вне зависимости от присутствия цисплатина. Добавление цисплатина не влияло на перераспределение двух форм LC3 в течение 18 часов после начала инкубации. Далее была проведена оценка влияния ингибиторов аутофагии на интенсивность клеточной гибели и уровень антиапоптотического белка Mcl-1. С этой целью клетки Caov-4 и HeLa были предварительно обработаны ингибитором аутофагии Бафиломицином A1 в концентрации 50 нМ, после чего клеточную гибель индуцировали 70 мкМ цисплатина в стандартной или бессывороточной средах в течение 18 часов. Об эффективности ингибирования аутофагии судили по накоплению форм LC3I и LC3II, а также по уровню белка p62, который отвечает за доставку убиквитинилированных белков в аутофагосомы. Kлеточную гибель регистрировали по появлению одного из маркеров апоптоза – фрагмента p89 белка PARP. Данный фермент отвечает за репарацию ДНК при повреждениях. Расщепление PARP эффекторными каспазами ведет к его инактивации и свидетельствует об интенсивности протекания процессов апоптоза в клетке. Добавление Бафиломицина A1 снижало деградацию PARP и накопление фрагмента р89 после обработки клеток цисплатином в условиях SD, что свидетельствовало об уменьшении уровня клеточной гибели в клетках HeLa, в то время как в клетках Caov-4 аналогичные условия вели к увеличению клеточной гибели. Вестерн-блот анализ также показал, что действие Бафиломицина A1 ведет к стабилизации Mcl-1 в зависимости от способа обработки и типа клеток. Так, в клетках Caov-4 Бафиломицин A1 вел к стабилизации Mcl-1 в клетках, обработанных цисплатином, как в стандартной, так и в бессывороточной средах. В клетках HeLa стабилизирующий эффект Бафиломицина A1 на Mcl-1 наблюдался только при обработке цисплатином в условиях SD. С целью количественной оценки влияния ингибирования аутофагии посредством Бафиломицина A1 на величину апоптотической популяции при действии цисплатина был проведен цитофлуориметрический анализ с окраской Аннексином V-FITC и йодидом пропидия клеток Caov-4 и HeLa, обработанных Бафиломицином A1 в конечной концентрации 50 нМ. Время инкубации обеих клеточных линий с цисплатином составляло 18 часов. Показано, что в клетках Caov-4 при действии цисплатина независимо от среды культивирования Бафиломицин A1 ведет к небольшому увеличению популяции гибнущих клеток (т.е. клеток, которые прокрашивались Аннексином V-FITC и/или йодидом пропидия). В то же время в клетках HeLa Бафиломицин A1 вел к выраженному снижению (свыше 20% от общего числа клеток в популяции) клеточной гибели при действии цисплатином в условиях SD, в то время как в стандартной среде эффект был минимален.
2 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Повышение чувствительности опухолевых клеток к терапии путем таргетирования антиапоптотического белка Mcl-1
Результаты этапа: Из литературы известна роль Mcl-1S в связывании Mcl-1L и нейтрализации его антиапоптотической активности. В то же время отсутствуют данные о неапоптотической роли Mcl-1S, потому изучение этого вопроса являелось одной из задач исследования. Чтобы оценить влияние Mcl-1S на клеточный цикл, клетки HEK293T исследовали на разных стадиях клеточного цикла после оверэкспрессии Mcl-1S. Клетки трансфицировали плазмидой pcDNA3-hMcl-1S в течение 24 ч, затем синхронизировали двойным тимидиновым блоком (18 + 9 + 18 ч) и анализировали через разные периоды выхода из блока. Клетки с оверэкспрессией Mcl-1S показали статистически значимо более высокую скорость прохождения через S-фазу через 4 часа и тренд через 6 и 8 часов после высвобождения из блока, сравнение сделано с соответствующими контрольными группами. Оверхэкспрессия Mcl-1S также приводила к изменению перехода клеток из фазы G1 в фазу S по сравнению с контролем. Так, 48% клеток с оверэкспрессией Mcl-1S были обнаружены в фазе G1 через 4 часа после высвобождения по сравнению с 35% контрольных клеток. Различия в содержании клеток в фазе G1 между контрольными клетками и клетками, оверэкспрессирующими Mcl-1S, были статистически значимыми для всех исследованных временных точек. Нокдаун Mcl-1L с помощью siRNA продемонстрировал аналогичную тенденцию: клетки с дефицитом Mcl-1L быстрее переходили в стадию G2/M, хотя увеличение скорости прогрессии в данную фазу было менее выраженным. Следует отметить, что использованная siRNA (смысловая цепь: 5’-GCATCGAACCATTAGCAGAdTdT-3’) нацелена специфично на транскрипт Mcl-1L, но не Mcl-1S. Менее выраженный эффект нокдауна Mcl-1L (в сравнении с оверэкспрессией Mcl-1S) можно объяснить недостаточным снижением уровня Mcl-1 с помощью siRNA-опосредованного нокдауна. С учетом специфического антагонистического влияния Mcl-1S на Mcl-1L, наблюдаемые результаты могут свидетельствовать о том, что Mcl-1S действует как ингибитор Mcl-1L в регуляции клеточного цикла. Далее было изучено, оказывают ли специфические антагонисты Mcl-1L схожее влияние на прогрессию клеточного цикла. С этой целью был использован высокоселективный антагонист Mcl-1, BH3-миметик S63845. Условия экспериментов были аналогичны описанным выше для оверэкспрессии Mcl-1S / нокдауна Mcl-1L. Примечательно, что даже высокие концентрации соединения не вызывали апоптоза в исследуемой клеточной линии. Известно, что связывание S63845 приводит к стабилизации Mcl-1L, поэтому накопление Mcl-1L служит индикатором взаимодействия S63845 с мишенью. Соответственно, в экспериментах, связанных с клеточным циклом, использовалась концентрация S63845 300 нМ, поскольку эта доза позволяла получить максимальное накопление Mcl-1L. Не было обнаружено нарушений клеточного цикла при действии S63845 в используемой экспериментальной модели. Эти результаты подтвердили безопасность S63845 в контексте влияния данного препарата на клеточный цикл в указанной концентрации. Обнаруженная при оверэкспрессии Mcl-1S или нокдауне Mcl-1L более быстрая прогрессия через S фазу клеточного цикла может приводить к накоплению повреждений ДНК по сравнению с контрольными группами. Чтобы проверить, накапливают ли клетки с оверэкспрессией Mcl-1S больше повреждений ДНК, чем контрольные клетки, мы провели 16-часовые инкубации в негенотоксических условиях, а также с концентрациями ДНК-повреждающих агентов, достаточными для индукции ответа на повреждение ДНК (что можно оценить по фосфорилированию p53 по сайту Ser15), но не влияют на уровень белка Mcl-1L: 3 мМ цисплатина, 0,3 мМ доксорубицина или 1 мМ этопозида. Действительно, клетки, трансфицированные плазмидой pcDNA3-hMcl-1S, демонстрировали более высокую степень фосфорилирования H2A.X по Ser139 (γ-H2A.X, маркер повреждения ДНК) в сравнении с контрольными клетками как без ДНК-повреждающих агентов, так и при генотоксическом стрессе. Обработка доксорубицином и этопозидом приводила к 2-3-кратному увеличению накопления γ-H2A.X при оверэкспрессии Mcl-1S по сравнению с контрольными клетками. При обработке цисплатином было обнаружено 25-кратное увеличение уровня фосфорилирования H2A.X, что подтверждает чрезвычайно выраженное накопление повреждений ДНК в клетках, оверэкспрессирующих Mcl-1S. Накопление повреждений ДНК было выше в сравнении с контрольными клетками и в клетках с siRNA-опосредованным нокдауном Mcl-1L. Однако увеличение уровня маркера повреждения ДНК, γ-H2A.X, было менее выраженным по сравнению с оверэкспрессией Mcl-1S, что может быть связано с недостаточной эффективностью нокдауна Mcl-1L. Примечательно, что BH3-миметик S63845, для которого в приведенных выше экспериментах показано отсутствие влияния на клеточный цикл, не влиял и на накопление повреждений ДНК. В целом эти результаты демонстрируют, что оверэкспрессия Mcl-1S приводит к накоплению повреждений ДНК. Нокдаун Mcl-1 также способствует увеличению повреждения ДНК, хотя и в меньшей степени. Действие высокоселективного BH3-миметика к Mcl-1 не влияло на накопление повреждений ДНК. Эти данные указывают на то, что BH3-миметики к Mcl-1 лишены неспецифического влияния на прогрессию клеточного цикла, что может иметь значимость в случае применения данных агентов в качестве лекарственных препаратов. Для дальнейшего изучения роли аутофагии во влиянии на уровень Mcl-1 в условиях ограничения питательных веществ (ОПВ) была использована мутантная линия клеток аденокарциномы легкого U1810, нокаутных по гену ATG13, кодирующему одноименный белок, отвечающий за формирование фагосом. В экспериментах использовалась как данная нокаутная линия – U1810 ATG13КО, так и клетки дикого типа U1810. В качестве модели ОПВ использовали не только условия SD, но и альтернативную модель – культивирование клеток в среде HBSS. Для анализа уровня аутофагии клетки U1810 инкубировали в стандартной среде (среда RPMI), в условиях ОПВ в течение 2, 6, 12 или 18 часов, в качестве контроля клетки инкубировали в течение 2 часов в стандартной среде. Методом Вестерн-блот анализа был оценен уровень белка Mcl-1, а также уровень маркеров аутофагии (белков LC3 и р62). Показано, что условия SD не влияли на уровень белка Mcl-1 в клетках U1810, в то время как культивация клеток в среде HBSS на более поздних временных точках (12 и 18 часов) приводила к снижению уровня Mcl-1 практически в 2 раза. Важно отметить, что и условия SD, и условия HBSS приводили к эффективному запуску аутофагии, несмотря на различие уровней LC3-II в используемых экспериментальных моделях. Эту разницу можно объяснить тем, что при усилении уровня аутофагии деградация LC3-II может происходить быстрее преобразования формы LC3-I в LC3-II, что осложняет анализ изменения соотношения LC3-II/LC3-I в разных условиях. Такая деградация отражается в сниженном соотношении LC3-II/LC3-I и может быть неправильно интерпретирована. Тем не менее, в условиях HBSS наблюдалась более выраженная деградация белка р62, чем в условиях SD, что свидетельствует о высокой интенсивности процесса аутофагии. Таким образом, более «жесткие» условия ОПВ, полученные при помощи культивирования клеток U1810 в среде HBSS, приводили к выраженной деградации белка Mcl-1, чего не наблюдалось в случае инкубирования в бессывороточной среде. Для выяснения причин деградации Mcl-1 в условиях, стимулирующих аутофагию, к клеткам U1810, растущим в стандартных условиях и в среде HBSS, был добавлен ингибитор аутофагии Бафиломицин A1 в концентрации 50 нМ. Аналогичным образом были обработаны клетки U1810 ATG13КО, в которых нарушена возможность протекания процесса аутофагии. Клетки культивировались в указанных условиях в течение 18 часов. Методом Вестерн-блот анализа был оценен уровень белка Mcl-1, а также уровень маркеров аутофагии (белков LC3 и р62). Показано, что снижение уровня Mcl-1 в условиях HBSS наблюдалось как в случае нокаутных по аутофагии клеток U1810 ATG13КО, так и при применении Бафиломицина А1. Таким образом, суммируя полученные результаты, сделан вывод, что деградация Mcl-1, наблюдаемая в условиях ОПВ, не связана с процессами аутофагии. Как было показано выше, деградация Mcl-1 при культивировании в среде HBSS происходила вне зависимости от процессов аутофагии. Вследствие этого было выдвинуто предположение, что потенциальной причиной снижения уровня данного антиапоптотического белка может стать усиление протеасомной деградации в условиях резкого ограничения питательных веществ. С этой целью к клеткам U1810, культивируемым в стандартных условиях или в среде HBSS, был добавлен ингибитор протеасом MG-132 в концентрации 10 мкМ за 2 часа до приготовления клеточных лизатов. Аналогичным образом были обработаны клетки U1810 ATG13КО, в которых нарушена возможность протекания процессов аутофагии. Методом Вестерн-блот анализа оценивали уровень белка Mcl-1, а также уровень маркеров протеасомной деградации белков (общего убиквитина и убиквитина К48 – цепи полиубиквитина, конъюгированные через остаток лизина К48). Было показано, что уровень короткоживущего белка Mcl-1 возрастал в несколько раз под действием ингибитора протеасом MG-132 в обеих линиях клеток при культировании в стандартной среде, причем более выраженное увеличение Mcl-1 наблюдалась в клетках U1810 ATG13КО. Кроме того, в стандартных условиях роста уровень общего убиквитина и убиквитина К48 был выше в клетках U1810 ATG13КО по сравнению с клетками дикого типа. Данная разница увеличивалась при обработке клеток ингибитором протеасом MG-132, что свидетельствует о том, что в нокаутных по аутофагии клетках U1810 ATG13КО более интенсивно происходят процессы протеасомной деградации по сравнению с клетками U1810 при культивировании в стандартной среде. В условиях HBSS наблюдалось уменьшение стабилизации Mcl-1 в клетках U1810 при обработке MG-132, в то время как в аналогичных условиях в клетках U1810 ATG13КО – отсутствие этой стабилизации, что, по-видимому, связано с усилением гибели нокаутных по аутофагии клеток при культивировании в среде HBSS. Более того, в условиях HBSS снижался уровень общего убиквитина и убиквитина К48, наибольшая разница с инкубацией в нормальной среде была детектирована при использовании ингибитора протеасом. Суммарно эти данные свидетельствуют о том, что культивирование клеток в среде HBSS ведет к торможению процессов протеасомной деградации, что согласуется с литературными данными. Таким образом, было продемонстрировано, что в условиях недостатка питательных веществ деградация антиапоптотического белка Mcl-1 происходила по протеасомному пути.
3 1 января 2022 г.-6 марта 2022 г. Повышение чувствительности опухолевых клеток к терапии путем таргетирования антиапоптотического белка Mcl-1
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".