ИСТИНА

Митохондрии — важные органеллы эукариотических клеток. В них не только протекают различные метаболические реакции, синтезируется АТФ, но и сами митохондрии играют роль во внутриклеточной сигнализации. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae известен сигнальный каскад, передающий информацию от митохондрий к ядру, - ретроградный (RTG) путь. Известно, что нарушение взаимной регуляции между митохондриями и ядром связано с различными патологиями. Основываясь на ранее полученных нами данных и научной литературе, мы предположили, что RTG путь не является единственным способом передачи сигнала. Мы выдвинули гипотезу о том, что митохондриальная супероксиддисмутаза с белками-мишенями перекиси водорода также участвуют в сигнальном ответе при нарушении коммуникации между митохондриями и ядром и, более того, существует взаимная регуляция между двумя сигнальными путями. Целью нашего исследования является поиск новых участников молекулярного механизма передачи информации от нефункциональных митохондрий в ядро, изучение взаимосвязи между сигнальными путями. Предполагается исследовать роль ретроградного пути в защите от «митохондиального» стресса, вклад митохондриальной супероксиддисмутазы в адаптацию на стресс, также взаимодействие между RTG сигнализацией и пероксид водорода зависимым путем. Планируется проведение генетического скрининга для идентификации новых участников сигнального пути.

Планируемые результаты всего проекта: 1) Планируется идентифицировать и исследовать стрессорные воздействия, мишени которых находится в митохондриях клеток дрожжей. В качестве стрессорных воздействий будут исследованы различные виды ксенобиотиков (метаболические ингибиторы, прооксиданты, антимикотики), тепловой шок, высокая концентрация этанола и сивушных спиртов. 2) В условиях, подобранных в п. 1, будет исследована роль передачи сигнала от митохондрий к ядру, в механизме активации защиты от стресса. Будет проверена гипотеза о том, что наличие митохондриальной супероксиддисмутазы Sod2p, необходимо для активации транскрипционного фактора Yap1p при воздействие на клетку «митохондриальных» стрессов. 3) Будет исследована роль митохондриальной супероксиддисмутазы в адаптационном ответе дрожжей на «митохондриальные» стрессы. С помощью штамма, в котором ген митохондриальной супероксиддисмутазы находится под регулируемым промотером, будет изучено, как этот фермент влияет на возникновение устойчивости к такому стрессу. 4) Также будет изучено генетическое взаимодействие между RTG сигнализацией и пероксид водорода-зависимым путем. Если выживание штаммов в условиях выбранного стресса без гена SOD2 и без RTG2 будет сравнимо с выживанием двойного мутанта по генам SOD2 и RTG2, то это будет свидетельствовать о наличии генетического взаимодействия между двумя исследуемыми сигнальным путями. Более того, будет исследовано взаимодействие этих двух путей по активации RTG3-GFP на фоне делеции SOD2 и YAP1 и активации Yap1-GFP на фоне делеции RTG2 и MKS1 в условиях выбранного стресса. 5) Будет проведен скрининг, в результате которого будут отобраны клоны, устойчивые к митохондриально направленному стрессу. Из этих клонов будет выделена плазмида и секвенирован участок геномной ДНК на ней. В результате скрининга будут находится плазмиды, содержащие ген SOD2, однако, ожидается, что будут найдены новые участники ретроградной сигнализации. Мы полагаем, что низкая жизнеспособность клеток без Sod2p связана с нарушением передачи сигнала от митохондрий в ядро. Таким образом, будут идентифицированы гены, кодирующие белки, активация которых связана с нарушением передачи сигнала от митохондрий к ядру.

Ранее нами было показано, что при образовании псевдогиф – одной из специализированных морфологических форм дрожжевых клеток, – митохондрия играет сигнальную роль, не связанную с активацией RTG белков (Starovoytova et al. 2013). Мы показали, что делеция генов RTG-пути блокирует образование псевдогиф. При этом делеция гена MIH1, кодирующего тирозин-фосфатазу, которая контролирует переход из G2 фазы в М фазу клеточного цикла, приводит к практически полному обращению этого эффекта. Мы также обнаружили генетическое взаимодействие между SOD2 и геном протеинфосфатазы MIH1, крайне чувствительной к перекиси водорода. Поэтому, мы предположили, что передача сигнала от митохондрий к ядру также осуществляется с помощью перекиси водорода. Для работы по данному проекту имеется в наличии гиперэкспрессионная дрожжевая библиотека, содержащая гены на мультикопийной плазмиде. Также нами уже получены штаммы PGAL-SOD1 и PGAL-SOD2, в которых гены супероксиддисмутаз поставлены под регулируемый промотор, так как штаммы с нокаутированными генами супероксиддисмутаз генетически нестабильны. Таким образом, наша система с регулируемой экспрессией SOD2 представляется наиболее релевантной для выполнения наших задач. Также у нас имеются в наличии штаммы дикого типа, экспрессирующие белок RTG3-GFP и Yap1-GFP, штаммы с делецией MKS1, RTG2.

В 2016 году мы получили следующие положительные результаты: 1) Мы подобрали условия (время, концентрация) митохондриально-направленного стрессового воздействия, при котором клетки без Sod2p были бы менее жизнеспособны, чем клетки без Sod1p и клетки дикого типа. Мы использовали такие стрессовые воздействия, как: антимикотики (бензалкониум хлорид, блеомицин, клотримазол, миконазол), разобщитель (С12ТРР), прооксиданты (паракват и менадион), высокие концентрации этилового спирта и тепловой шок. Мы обнаружили, что добавление токсических концентраций этилового спирта 12-18% делало клетки с репрессией гена митохондриальной супероксиддисмутазы SOD2 сверхчувствительными к такому стрессу, в отличие от клеток с репрессией SOD1 и клеток дикого типа. 2) Для изучения роли Sod2p в пероксид водорода-сигнальном пути были получены штаммы: Yap1-GFP; PGAL-SOD2 Yap1-GFP; PGAL-SOD2 delta yap1; delta yap1. Мы обнаружили, что в условиях репрессии SOD2 не происходило релокализации транскрипционного фактора Yap1p в ядро при добавлении спирта, а в контроле происходило. Таким образом, результат показывает необходимость Sod2p для активации Yap1p. Также мы обнаружили, что делеция гена YAP1 (delta yap1), как и репрессия гена SOD2 (PGAL-SOD2), в одинаковой степени понижала устойчивость клеток к этиловому спирту. Однако репрессия гена SOD2 не влияла на жизнеспособность клеток дрожжей в штамме с делетированным геном YAP1 при добавлении этанола (PGAL-SOD2 delta yap1). Это указывает на наличие генетического взаимодействия между двумя генами, предполагая, что оба белка Sod2p и Yap1p участвуют в одном и том же сигнальном каскаде. Таким образом, мы предполагаем, что Sod2p и Yap1p являются компонентами одного сигнального каскада, передающими информацию от митохондрий к ядру и играющими важную роль в клеточном антистрессовом ответе на этанол. 3)Для изучения взаимодействия пероксид водорода-опосредованного и RTG-пути были получены штаммы: PGAL-SOD2 delta rtg2, PGAL-SOD2 delta mks1, Rtg3-GFP PGAL-SOD2, Rtg3-GFP delta yap1, Yap1-GFP delta rtg2, Yap1-GFP delta mks1. Мы обнаружили, что делеция гена RTG2 в диком типе (delta rtg2) и на фоне репрессии SOD2 (PGAL-SOD2 delta rtg2) в одинаковой степени уменьшала выживаемость клеток при действии этанола, что указывает на наличие генетического взаимодействия между RTG2 и SOD2. Кроме того, мы показали, что делеция RTG2 вызывала перманентную активацию Yap1p в контроле и при репрессии SOD2, а при делеции MKS1 такого эффекта не наблюдалось. Эти данные указывают на взаимодействие двух путей. Также мы обнаружили, что искусственная активация RTG-пути с помощью вещества MSX (2мМ в течение 30) или делецией MKS1 восстанавливала устойчивость штамма с репрессией SOD2 к этанолу. Таким образом, мы предполагаем, что активация RTG-пути взаимодействует с пероксид водорода-опосредованным путем, препятствуя активации Yap1p и, в то же время, запускает свой независимый путь антистрессового ответа на этанол.