Алгоритм анализа конденсата выдыхаемого воздуха человека для выявления профилей низкомолекулярных органических веществ – потенциальных биомаркеров биохимических процессов, основанный на сочетании микросорбционного концентрирования и газовой хроматомасс-спектрометрииНИР

The algorithm of exhaled breath condensate analysis for the detection of profiles of low molecular weight organic substances - potential biomarkers of biochemical processes, based on a combination of micro extraction by packed sorbent technique and gas chromatography-mass spectrometry

Соисполнители НИР

ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России Соисполнитель

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 13 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Алгоритм анализа конденсата выдыхаемого воздуха человека для выявления профилей низкомолекулярных органических веществ – потенциальных биомаркеров биохимических процессов, основанный на сочетании микросорбционного концентрирования и газовой хроматомасс-спектрометрии
Результаты этапа: 1. С помощью установки ECoScreens (Jaeger, Wu¨rzburg, Germany) были отобраны образцы конденсата выдыхаемого воздуха добровольцев с нормальными показаниями функции лёгких, у которых в анамнезе отсутствовали указания на атопию, хронические заболевания лёгких, других органов и систем, а также острые респираторные симптомы в течении последних 2-х месяцев (образцы отбирали в начале 2020 года). Пробоотбор осуществляли в течении 10 мин. Собранные образцы КВВ переливали в стеклянные виалы объёмом 1.5 мл (объём образца при этом в каждой виалие 1 мл) или полипропиленовые пробирки. Далее образцы замораживали для хранения. 2. Были проведены три серии экспериментов с отобранными образцами: лиофилизация образцов с последующим силилированием (или этерификацией/ацилированием); экстракция органическим растворителем компонентов образцов КВВ и производных, полученных в результате предварительной дериватизации изобутилхлорформиатом; микросорбционное концентрирование компонентов матрицы с помощью метода Micro Extraction by Packed Sorbent (MEPS) с применением программируемого дозатора eVol® SGE Analytical Science (Австралия) и разработанного нами. После пробоподготовки полученные органические растворы, содержащие искомые низкомолекулярные органические вещества (или их производные) анализировали методом газовой хроматомасс-спектрометрии. Лиофилизацию образцов проводили из замороженного состояния при пониженном давлении. Силилирование высушенного образца проводили при нагревании реакционной смеси. В виде силильных производных был зарегистрирован ряд жирных, гидрокси-, дикарбоновых кислот, мочевина, из ряда альдегидов – деканаль. Взаимодействие компонентов образцов КВВ с изобутилхлорформиатом проводили как непосредственно в образцах (ИБХФ, пиридин, изобутанол), так и при добавлении реагентов к их лиофилизатам (ИБХФ, пиридин, ацетонитрил) при комнатной температуре. После проведения реакции в образцах КВВ аналиты экстрагировали метилтретбутиловым эфиром. Дополнительно был зарегистрирован ряд аминокислот (аланин, глицин, изолейцин) в виде изобутоксикарбониловых эфиров и среднелетучие органические вещества, не подвергшиеся дериватизации. Микросорбционное концентрирование (по MEPS методу) с применением в качестве сорбента силикагеля с привитыми октадецильными группами позволило зарегистрировать в образцах КВВ ряд жирных кислот, алканов, спиртов, аминов, из альдегидов - деканаль. В некоторых образцах были обнаружены такие вещества, как 1-(4-метилфенил)этанон, бензальдегид и изотиоционатциклогексан, отражающие процессы пищеварения, что может быть связано как с особенностями организма добровольца, так и с приёмом пищи меньше чем за 3-4 часа до пробоотбора. Ряд веществ имеет экзогенное происхождение. При сравнении данных, полученных в результате изученных подходов к пробоподготовке можно сделать ожидаемый предварительный вывод о том, что они дополняют друг друга. Некоторые среднелетучие вещества (относительно лёгкие кислоты, спирты, углеводороды и др.) терялись при лиофилизации, но такие соединения, как сахара удаётся зарегистрировать только в виде их силильных производных, а аминокислоты – в виде изобутоксикарбониловых эфиров. С помощью разработанного нами автоматического устройства для микросорбционного концентрирования была, также, предпринята попытка протестировать возможности извлечения низкомолекулярных органических соединений из КВВ с помощью сверхсшитого полистирола со степенью сшивки 200% (с кажущейся внутренней удельной поверхностью 1100 м2/г, с общим объёмом пор 1.2 мл/г (микропор 0.4 мл/г, макро-мезопор 0.8 мл/г), со средним размером микро пор 15 А, мезо- и макропор 880 А, с размером гранул 40-80 мкм. Образцы сорбента предоставлены сотрудниками отдела высокомолекулярных соединений, 314 лаборатории стереохимии сорбционных процессов, руководимой Даванковым В.А., института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН. Было обнаружено заметно меньше соединений. Вероятно, это связано как со свойствами сорбента, так и с необходимостью дальнейшего модифицирования нашего устройства (подробнее в пункте 3). Интересно будет продолжить исследования, как с этим сорбентом, так и с другими, неприменяемыми ранее в коммерческом варианте MEPS, после модификации нашего устройства. 3. С целью расширения возможностей метода микросорбционного концентрирования (выбор любого сорбента, а не только коммерчески доступного и упакованного в иглу для автоматического дозатора MEPS) и с целью снижения стоимости одного анализа (обусловленной высокой ценой как самого коммерческого дозатора, так и расходных материалов, в особенности сменных картриджей с сорбентом) разработано автоматическое устройство для микросорбционного концентрирования. Детали конструкции были спроектированы и изготовлены нами с применением метода 3D-печати. Устройство было укомплектовано самодельным блоком управления. В качестве платы использовали платформу Arduino. Управление устройством осуществляли с использованием кнопок и дисплея (без необходимости подключения к компьютеру). Программа для микроконтроллера была написана нами, код программы был адаптирован для обеспечения работы устройства в режиме микросорбционного концентрирования. В процессе проектирования нами было рассмотрено несколько возможных конструкций устройства, было изготовлено несколько прототипов. Наиболее оптимальная конструкция для целей микросорбционного концентрирования представлена на Рис. 1. В этой конструкции шприц располагается вертикально перпендикулярно поверхности стола, само устройство фиксируется на штативе (Рис. 1). Это облегчает отбор проб из стеклянных виал или микропробирок типа «Эппендорф», а также позволяет зафиксировать устройство на определенной высоте от стола. С использованием микровесов была оценена точность дозирования жидкости в случае одноразового пластикового шприца объемом 1 мл. На первом этапе проводили калибровку дозатора (в соответствии с рекомендациями ISO 8655). При дозировании 100 мкл (отбор жидкости производили непосредственно в шприц) систематическая погрешность составила 0.6 мкл, случайная – 0.4 мкл. В коммерческом варианте устройства для MEPS применяется шприц с иглой, внутри которой смонтирован картридж с 4 мг сорбента. С целью снижения стоимости сменной насадки с сорбентом, исключения загрязнения шприца компонентами пробы, а также сокращения времени пробоподготовки (благодаря исключению стадии промывки шприца между образцами) в первой модификации нашего устройства было решено вместо иглы с сорбентом использовать пипетку Пастера, в носике которой, между двумя слоями дезактивированной кварцевой ваты помещали навеску сорбента. Пипетку Пастера соединяли герметично с пластиковым шприцем с использованием отрезка силиконовой трубки. Это было возможно благодаря практически одинаковым внешним диаметрам шприца и пипетки. Использование пипетки Пастера ожидаемо ухудшило точность дозирования (из-за наличия большого мертвого объема между штоком шприца и кончиком пипетки). В случае, когда мертвый объем составлял около 1000 мкл, систематическая погрешность дозирования 100 мкл составляла около 10 мкл (что свидетельствовало о необходимости введения соответствующих поправок в калибровочный коэффициент), случайная ошибка составляла 0.8 мкл. Введение поправок позволило уменьшить систематическую погрешность до 1.0 мкл (при дозировании 100 мкл). К сожалению, даже после решения проблемы с точностью дозирования вариант с пипеткой Пастера не оправдал наших ожиданий. Это объяснялось тем, что наличие сорбента в носике увеличивало сопротивление при отборе пробы жидкости. Даже при относительно низких скоростях потока визуально наблюдалась некоторая задержка между движениями поршня шприца и фронта жидкости в пипетке Пастера. Проба проходила через сорбент с непостоянной, т.е. неконтролируемой скоростью. Уменьшение мертвого объема до 300 мкл (за счет использования более коротких пипеток) улучшило ситуацию и сделало возможным проведение ряда экспериментов. Несмотря на это влияние мёртвого объёма пипетки на установление заданных параметров прокачки раствора через сорбент было заметно даже в случае модельных растворов. Можно ожидать, что это влияние будет более существенным при анализе вязких образцов. В связи с этим было принято решение вернуться к варианту отбора жидкости непосредственно в шприц. Отбор органических растворителей в пластиковый шприц может привести к загрязнению раствора органическими соединениями (например, олигомерами или пластификаторами). В связи с этим целесообразно использовать стеклянные шприцы объемом 25–250 мкл. Конструкция, представленная на Рис. 1 не позволяет зафиксировать ни один из доступных в нашем распоряжении стеклянных шприцев. Кроме того, шприцы различных производителей могут несколько отличаться по внешнему диаметру, размеру фланца и штока. Чтобы сделать устройство более универсальным и пригодным для работы с большим числом шприцев, необходимо внести некоторые изменения в конструкцию. Также предполагается внести изменения в программу управления, добавить несколько специфических режимов, а также сделать работу в режиме микросорбционного концентрирования более удобной для оператора за счет внедрения ряда дополнительных функций (например, задания числа последовательных операций 'прокачки' растворителя или пробы через сорбент). Рис. 1. 3D-модель (слева) и фотография (справа) устройства для микросорбционного концентрирования. 4. По результатам проведенных экспериментов подготовлена к печати статья.
2 13 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Алгоритм анализа конденсата выдыхаемого воздуха человека для выявления профилей низкомолекулярных органических веществ – потенциальных биомаркеров биохимических процессов, основанный на сочетании микросорбционного концентрирования и газовой хроматомасс-спектрометрии
Результаты этапа: Устройство для микросорбционного концентрирования, разработанное ранее, было модифицировано и улучшено. Основные изменения перечислены ниже: • Изменена конструкция деталей, обеспечивающих фиксацию шприца. Новая конструкция позволяет использовать не только пластиковые шприцы объемом 1 мл, но и стеклянные шприцы объемом 25–250 мкл. Данная конструкция позволяет работать с большинством коммерческих шприцев. • Изменен способ крепления устройства на штативе. Новая конструкция позволяет использовать штативы со штангами различного диаметра, узел крепления стал более надежным и позволяет быстро и плавно перемещать устройство по штанге штатива. • Изменена прошивка устройства. Улучшения коснулись добавления новых режимов работы, облегчающих процедуру концентрирования, когда одни и те же операции повторяются несколько раз подряд. Кроме того, добавлена функция плавного разгона и замедления шагового двигателя, увеличивающая стабильность работы устройства при больших скоростях дозирования. Максимальная скорость вращения шагового двигателя стандарта NEMA 17 при использовании доступного по цене драйвера A4988 и напряжения 12 В составляет порядка 5 об./с. По этой причине для высоких скоростей дозирования следует использовать ведущие винты с относительно большим шагом резьбы. Однако при этом снижается число шагов двигателя, необходимых для дозирования определенного объема, что может отразиться на воспроизводимости и точности дозирования. Нами были сопоставлены результаты дозирования при использовании ведущих винтов с шагом резьбы 2 и 8 мм. Нами не выявлено снижение точности и воспроизводимости дозирования при увеличении шага ведущего винта с 2 до 8 мм (в эксперименте использовали один и тот же шприц, устанавливали одинаковую линейную скорость перемещения штока и дозировали объем эквивалентный 1/4 и 1/2 общего объема шприца). Исследованы составы образцов конденсата выдыхаемого воздуха здоровых волонтеров, пациентов с различными респираторными заболеваниями (астма, ХОБЛ) и спортсменов после физической нагрузки. В качестве пробоподготовки образцов выбрали лиофильную сушку (или упаривание в токе азота) с последующим силилированием высушенного остатка (БСТФА) при нагревании. Пробы полученных растворов производных объёмом 1 мкл анализировали методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии. Сравнение полученных хроматограмм даже по полному ионному току выявило заметное различие образцов КВВ здоровых волонтёров от образцов КВВ других исследованных групп. В образцах КВВ больных ХОБЛ и астмой были обнаружены силильные производные веществ, масс-спектры которых с высокой долей вероятности можно отнести к силильным производным моносахарида и дисахаридов. В образцах КВВ спортсменов обнаружены только дисахариды (те же, что и в образцах КВВ больных астмой и ХОБЛ). У здоровых волонтёров данные соединения не обнаружены.
3 13 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Алгоритм анализа конденсата выдыхаемого воздуха человека для выявления профилей низкомолекулярных органических веществ – потенциальных биомаркеров биохимических процессов, основанный на сочетании микросорбционного концентрирования и газовой хроматомасс-спектрометрии
Результаты этапа: С помощью установки ECoScreens (Jaeger, Wu¨rzburg, Germany) были отобраны образцы конденсата выдыхаемого воздуха добровольцев с нормальными показаниями функции лёгких, у которых в анамнезе отсутствовали указания на атопию, хронические заболевания лёгких, других органов и систем, а также острые респираторные симптомы в течении последних 2-х месяцев. Пробоотбор осуществляли в течении 10 мин. Собранные образцы КВВ переливали в стеклянные виалы объёмом 1.5 мл (объём образца при этом в каждой виалие 1 мл) или полипропиленовые пробирки. Далее образцы замораживали для хранения. Благодаря системе клапанов на пути движения вдыхаемого воздуха из окружающей среды и выдыхаемого воздуха в охлаждающее устройство эти потоки не смешивались, и образующаяся слюна не попадала в КВВ. Пациент, сидя, вдыхал и выдыхал воздух через рот при спокойном дыхании (для исключения прохождения воздуха через носовую полость использовали носовой зажим). Были проведены три серии экспериментов с отобранными образцами: лиофилизация образцов с последующим силилированием (или этерификацией/ацилированием); экстракция органическим растворителем компонентов образцов КВВ и производных, полученных в результате предварительной дериватизации изобутилхлорформиатом (а также дериватизация изобутилхлорформиатом лиофилизата образцов); микросорбционное концентрирование компонентов матрицы с помощью метода Micro Extraction by Packed Sorbent (MEPS) с применением программируемого дозатора eVol® SGE Analytical Science (Австралия) и разработанного нами. После пробоподготовки полученные органические растворы, содержащие искомые низкомолекулярные органические вещества (или их производные) анализировали методом газовой хроматомасс-спектрометрии. Лиофилизацию образцов проводили из замороженного состояния при пониженном давлении. Силилирование высушенного образца проводили при нагревании реакционной смеси. Взаимодействие компонентов образцов КВВ с изобутилхлорформиатом проводили как непосредственно в образцах (ИБХФ, пиридин, изобутанол), так и при добавлении реагентов к их лиофилизатам (ИБХФ, пиридин, ацетонитрил) при комнатной температуре. После проведения реакции в образцах КВВ аналиты экстрагировали метилтретбутиловым эфиром. Растворы реакционных смесей после проведения реакций дериватизации и элюаты после стадии десорбции микросорбционного концентрирования анализировали с помощью газового хроматографа (7890A, Agilent), соединенного с времяпролетным масс-спектрометром Pegasus HT (GC-TOFMS – LECO Corporation). Объем анализируемой пробы составлял 1 мкл. Ввод пробы осуществляли в режиме с делением/без деления потока в инжектор, нагретый до 250°С. Делитель потока открывался через 30 с после ввода пробы в инжектор. Вещества разделяли на колонке VF-5ms длиной 30 м, внутренним диаметром 0.25 мм, толщиной неподвижной фазы (5% фенил-, 95% метилполисилоксан) 0.25 мкм в режиме программирования температуры (изотерма 50°С (5 мин), нагревание термостата со скоростью 10 °С/мин до 250°С (изотерма 10 мин)). Скорость потока газа-носителя гелия 1 мл/мин. Аналитические сигналы регистрировали в режиме полного ионного тока, энергия электронов 70 еВ. Диапазон сканирования – от 50 до 600 а.е.м.. Масс-спектры обнаруженных компонентов сравнивали с библиотечными (NIST). В виде силильных производных был зарегистрирован ряд жирных, гидрокси-, дикарбоновых кислот, мочевина, из ряда альдегидов – деканаль. Дополнительно был зарегистрирован ряд аминокислот (аланин, глицин, валин, пролин, изолейцин) в виде изобутоксикарбониловых эфиров и среднелетучие органические вещества, не подвергшиеся дериватизации. Микросорбционное концентрирование (по MEPS способу) с применением в качестве сорбента силикагеля с привитыми октадецильными группами позволило зарегистрировать в образцах КВВ ряд жирных кислот, алканов, спиртов, аминов, из альдегидов - деканаль. В некоторых образцах были обнаружены такие вещества, как 1-(4-метилфенил)этанон, бензальдегид и изотиоционатциклогексан, отражающие процессы пищеварения, что может быть связано как с особенностями организма добровольца, так и с приёмом пищи меньше чем за 3-4 часа до пробоотбора. Ряд веществ имеет экзогенное происхождение. При сравнении данных, полученных в результате изученных подходов к пробоподготовке можно сделать ожидаемый предварительный вывод о том, что они дополняют друг друга. Некоторые среднелетучие вещества (относительно лёгкие кислоты, спирты, углеводороды и др.) терялись при лиофилизации, но такие соединения, как сахара удаётся зарегистрировать только в виде их силильных производных, а аминокислоты – в виде изобутоксикарбониловых эфиров. В рамках проекта разработано самодельное устройство, позволяющие проводить концентрирование аналитов методом микросорбционного концентрирования. Детали устройства были спроектированы и изготовлены нами с применением технологии 3D печати. В процессе проектирования нами было рассмотрено несколько возможных конструкций устройства, было изготовлено несколько прототипов. Наиболее оптимальная конструкция для целей микросорбционного концентрирования представлена на фотографии в файле «Материал в научно-популярной форме». В этой конструкции шприц располагается вертикально перпендикулярно поверхности стола, само устройство фиксируется на штативе, что облегчает отбор проб из стеклянных виал и полипропиленовых пробирок типа «Эппендорф». В процессе выполнения проекта устройство модифицировалось с целью расширения его возможностей. Последняя версия устройства обладает универсальным креплением и позволяет работать как с пластиковыми шприцами объемом 1 мл, так и с большим числом моделей стеклянных шприцев объемом до 500 мкл включительно. Для автономного управления устройством был разработан блок управления, основанный на плате Arduino. Для отображения информации использовали экран формата 1602, а для управления устройством – 4 кнопки. Основной акцент в процессе разработки программы для микроконтроллера был сделан на использовании устройства в режиме микросорбционного концентрирования. Например, нами был реализован режим, позволяющий выполнять последовательные операции «прокачки» растворителя или пробы через сорбент в полуавтоматическом режиме (когда оператору необходимо задать скорость, объем и число последовательных операций, а начало следующего этапа цикла инициируется нажатием одной кнопки). Управляющая программа микроконтроллера также модифицировалась и улучшалась в процессе выполнения проекта. Например, была добавлена функция плавного разгона и замедления шагового двигателя, увеличивающая стабильность работы устройства при высоких скоростях дозирования. Точность дозирования, обеспечиваемая самодельным устройством, была оценена при использовании микровесов. Калибровку шприцев, используемых в работе, проводили в соответствии с рекомендациями стандарта ISO 8655. В случае пластикового шприца объемом 1 мл и дозировании 100 мкл бидистиллированной воды систематическая погрешность составила 0.6 мкл, случайная – 0.4 мкл. При дозировании 200 мкл стеклянным шприцем объемом 250 мкл (SGE) случайная и систематическая ошибки не превышали 0.2 мкл. Изначально в конструкции использовался ведущий винт с шагом резьбы 2 мм. В рамках проекта была рассмотрена возможность увеличения шага резьбы с 2 до 8 мм. Основной мотивацией послужила относительно небольшая максимальная скорость вращения шагового двигателя стандарта NEMA 17 (порядка 5 об./с) при использовании доступного по цене драйвера A4988 и блока питания напряжением 12 В. Следует отметить, что применение ведущих винтов с большим шагом резьбы приводит к увеличению объема, отвечающего одному шагу двигателя что может негативно отразиться на воспроизводимости и точности дозирования. По этой причине нами были сопоставлены результаты дозирования при использовании ведущих винтов с шагом резьбы 2 и 8 мм. Нами не выявлено снижение точности и воспроизводимости дозирования при увеличении шага ведущего винта с 2 до 8 мм (в эксперименте использовали один и тот же шприц, устанавливали одинаковую линейную скорость перемещения штока и дозировали объем эквивалентный 1/4 и 1/2 общего объема шприца). На начальных этапах исследования нами была рассмотрена возможность проведения микросорбционного концентрирования с использованием пипетки Пастера, в носике которой, между двумя слоями дезактивированной кварцевой ваты находилось 4–6 мг сорбента. Пипетку Пастера соединяли герметично с пластиковым шприцем с использованием отрезка силиконовой трубки (это было возможно благодаря практически идентичным внешним диаметрам шприца и пипетки). Основная идея использования такой конструкции заключалась в исключении попадания исследуемого раствора в шприц, и, как следствие, снижение вероятности проявления эффекта кросс-контаминации. Использование пипетки Пастера ожидаемо ухудшило точность дозирования (из-за наличия большого мертвого объема между штоком шприца и кончиком пипетки). В случае, когда мертвый объем составлял около 1000 мкл, а отбираемый объем – 100 мкл, систематическая погрешность составляла около 10 мкл, случайная погрешность – порядка 0.8 мкл. Введение поправок в калибровочный коэффициент позволило уменьшить систематическую погрешность до 1.0 мкл (при дозировании 100 мкл). К сожалению, даже после решения проблемы с точностью дозирования вариант с пипеткой Пастера не оправдал наших ожиданий. Это объяснялось тем, что наличие сорбента в носике увеличивало сопротивление при отборе пробы жидкости. Даже при относительно низких скоростях потока визуально наблюдалась некоторая задержка между движениями поршня шприца и фронта жидкости в пипетке Пастера. Проба проходила через сорбент с непостоянной, т.е. неконтролируемой скоростью. Уменьшение мертвого объема до 300 мкл (за счет использования более коротких пипеток) улучшило ситуацию и сделало возможным проведение ряда экспериментов. Несмотря на это, влияние мёртвого объёма пипетки на установление заданных параметров прокачки раствора через сорбент было заметно даже в случае модельных растворов. В связи с этим впоследствии были проведены эксперименты с применением металлических игл. В случае игл с внутренним диаметром более 0.5 мм сорбент помещали внутрь между двумя ограничителями, изготовленными из пористого гидрофилизованного полиэтилена. С целью снижения мертвого объема были проведены эксперименты с иглами меньшего диаметра (< 0.5 мм). Для этого иглы разрезали пополам и соединяли две части при помощи небольшого отрезка полиэтиленовой трубки, внутри которой находился сорбент. Также рассмотрели возможность использования полипропиленовых наконечников (ZipTip, Millipore, Франция), носик которых заполнен небольшим количеством сорбента (С18). Конструкция шприца позволяла подсоединить к нему как съёмную иглу, так и полипропиленовый наконечник. Последний вариант (полипропиленовый наконечник) показал наилучшие результаты, практически исключив мертвый объем из эксперимента. Исследовали состав силильных производных аналитов, полученных в результате пробоподготовки, основанной на силилировании лиофилизатов образцов КВВ пациентов с диагнозами хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и бронхиальная (БА) астма и лиофилизатов образцов КВВ здоровых волонтеров. В группу здоровых отбирали добровольцев с нормальными показаниями функции легких, у которых в анамнезе отсутствовали указания на атопию, хронические заболевания легких, других органов и систем, а также острые респираторные симптомы в течении последних двух месяцев. В группу пациентов с ХОБЛ входили больные с ранее подтвержденным диагнозом ХОБЛ 2 и 3 степени, в группу пациентов с бронхиальной астмой входили больные с ранее подтвержденным диагнозом БА. Больные, принимающие системные глюкокортикостероиды, страдающие другими болезнями легких, онкологическими заболеваниями, имеющие тяжелую сопутствующую патологию сердечно-сосудистой системы, органов пищеварения, мочеполовой и нервной системы, сахарный диабет, злоупотребляющие алкоголем и наркотиками в анамнезе в исследование не включали. Пробоотбор осуществляли в течение 10 мин. Собранные образцы КВВ переливали в стеклянные виалы объемом 1.5 мл или полипропиленовые пробирки. Далее образцы замораживали для хранения при –20°С. Аликвоты размороженных образцов (образцы не перезамораживали) объемом 0.5–1.0 мл лиофилизировали. К высушенному остатку добавляли 50 мкл N,Oбис(триметилсилил)трифторацетамида (БСТФА), виалы с полученными растворами выдерживали при 60°С в течение 30 мин в термостате. Растворы остужали до комнатной температуры и пробу объемом 1 мкл вводили в инжектор газового хроматографа Thermo Scientific Finnigan TRACE GC Ultra (Италия), соединенного с масс-спектрометром Trace DCQ MS, в режиме с делением/без деления потока. Температура инжектора составляла 250°С. Диапазон времени от момента ввода пробы до открытия клапана делителя потока 30 с. Вещества разделяли в кварцевой капиллярной колонке Restek Rtx-5MS. Длина колонки – 15 м, внутренний диаметр – 0.25 мм. Толщина неподвижной фазы – 0.25 мкм. Поток гелия через колонку 1 см3 /мин. Сконцентрированные на входе в аналитическую колонку компоненты разделяли в условиях программирования температуры термостата, их масс-спектры электронной ионизации с энергией 70 еВ регистрировали в режиме полного ионного тока. Термостат колонок нагревали по следующей программе: изотерма 50°С в течение 5 мин, далее нагрев со скоростью 10°С/мин до 250°С и выдерживание при этой температуре в течение 10 мин. Температура обогреваемого интерфейса между газовым хроматографом и масс-спектрометром 250°С. Диапазон сканирования выбрали от 50 до 700 а.е.м.. Полученные хроматограммы сравнивали между собой. Масс-спектры обнаруженных компонентов сравнивали с библиотечными (NIST). Сравнение полученных хроматограмм выявило заметные различия между образцами КВВ больных астмой, ХОБЛ и образцами здоровых добровольцев. На хроматограммах, относящихся к образцам КВВ пациентов с ХОБЛ и БА присутствовали хроматографические пики, отсутствующие (или находящиеся ниже предела обнаружения) на хроматограммах продуктов силилирования лиофилизатов здоровых добровольцев. Сравнение соответствующих масс-спектров со спектрами библиотеки NIST, соотношение характеристичных ионов в масс-спектрах позволило выдвинуть предположение, что эти хроматографические пики соответствуют силильным производным фуранозной и пиранозной форм D-фруктозы. Библиотечные масс-спектры силильных производных глюкозы заметно отличаются от масс-спектров зарегистрированного соединения. Хроматографические пики производных глюкозы не были зарегистрированы. Далее провели поиск литературы по списку ключевых слов, включающих “exhaled breath condensate”, “fructose”, “COPD/astma”. Не удалось обнаружить публикации, в которых фруктозу как продукт метаболических процессов в организме человека идентифицировали бы в КВВ при ХОБЛ или БА. Однако выявили две публикации, в которых фруктоза в той или иной форме фигурирует в роли биомаркера ХОБЛ. Авторы первой работы сравнили составы образцов плазмы крови двух групп пациентов с диагнозом ХОБЛ (выживших и умерших в течение двух лет после исследования). Оказалось, что в ограниченный круг компонентов, внесших наибольший вклад в различие таких групп образцов, входит фруктоза (заметный рост содержания этого вещества в образцах плазмы крови умерших пациентов). Авторы второй работы при выяснении влияния нарушения мышечного метаболизма на переносимость физических нагрузок при ХОБЛ сравнили содержания веществ в образцах ткани (латеральной широкой мышцы бедра) пациентов с ХОБЛ и здоровых волонтеров того же возраста (отобраны биопсией), расходующихся и образующихся при гликолизе. Анализ экстрактов из образцов ткани методом ВЭЖХ показал, что индуцированное физической нагрузкой образование конечных продуктов гликолиза, таких как лактат и пируват, и промежуточных продуктов гликолиза, таких как глюкозо-6-фосфат, глюкозо-1-фосфат и фруктозо-6- фосфат, а также потребление гликогена выше у пациентов с ХОБЛ. Вероятно, что такое нарушение мышечного метаболизма при нагрузке у больных ХОБЛ (выраженное в том числе повышенным содержанием фруктозо-6-фосфата в мышцах) взаимосвязано с появлением фруктозы в КВВ, обнаруженным в нашем исследовании.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".