ИСТИНА

Одной из сложнейших проблем медицины является лечение больных старческого возраста. Крайне остро с этой проблемой сталкивается нефрология, где за последние 50 лет наблюдается значительное старение популяции неврологических больных. Старческий возраст приводит к более тяжёлому протеканию заболеваний и большему риску развития осложнений. Другая проблема заключается в уменьшении или исчезновении при старении терапевтического эффекта целого ряда фармакологических препаратов. Ситуация усугубляется тем, что подавляющее большинство экспериментальных работ, исследующих патогенез нефрологических заболеваний, проводятся на молодых животных, а эксперименты на старых животных крайне редки. Данное исследование будет направлено на выяснение разницы в механизмах развития почечных патологий у молодых и старых животных. Так же мы постараемся выявить причину исчезновения нефропротекторного действия ишемического прекондиционирования и ряда фармакологических препаратов. Работа будет проведена на физиологическом, клеточном и биохимическом уровне. Физиологический уровень будет включать исследование функции почки, при этом особое внимание будет уделено изменениям внутриорганной гемодинамики. На клеточном и биохимическом уровне основное внимание будет направлено на изменение состояния митохондрий, так как с одной стороны было показано, что у молодых животных эти органеллы играют ключевую роль в повреждении ткани почки в целом ряде патологий, а с другой стороны одной из ведущих гипотез старения является митохондриальная теория старения. Другим направлением будет выявление роли аутофагии в развитии или предотвращении почечных заболеваниях у молодых и старых животных. Третьей областью исследования станут процессы ацетилирования и деацетилирования клеточных структур, причины и последствия изменения уровня ацетилирования белков. Наконец, мы планируем исследовать неканонические действие ренин-ангиотензин-альдостероновой системы на клеточные процессы. Ряд данных позволяет предполагать наличие взаимосвязи всех этих процессов. Результатом исследования должно стать более глубокое понимание тех изменений, которые происходят при старении почки и приводят к потере нефропротекторного действия препаратов, что откроет возможность разработки лекарств, эффективных для лечения больных старческого возраста.

1. Планируется исследовать изменения почечной и центральной гемодинамики, возникающие у молодых животных при ишемии/реперфузии (И/Р) почки, при ишемическом и фармакологическом прекондиционировании, при действии митохондриально-направленных антиоксидантов и митохондриальных разобщителей. Планируется сравнить эти изменения гемодинамики молодых животных с изменениями гемодинамики у старых животных при аналогичных воздействиях. 2. Планируется исследовать защитное действие ишемического прекондиционирования на функцию почки старых и молодых животных при И/Р и изучить возможные механизмы приводящие к потери нефропротекторного действия ишемического прекондиционирования у старых животных. В частности, планируется исследовать влияние ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС). 3. Планируется изучить изменения процессов ацетилирования и деацетилрования в почке при И/Р и/или ишемическом прекондиционировании. Планируется сравнить динамику этих процессов у молодых и старых животных и определить их роль в патогенезе ОПП. 4. Планируется исследовать процессы аутофагии и митофагии у старых и молодых животных, исследовать изменения этих процессов после И/Р почки, а так же после ишемического и фармакологического прекондиционирования. Планируется выяснить роли аутофагии и митофагии в реализации защитного действия ишемического и фармакологического прекондиционирования и влияние старения на эти процессы. 5. Планируется исследовать изменения, происходящие под действием ишемического прекондиционирования в митохондриях почки старых и молодых животных. Планируется сравнить функциональную гетерогенность митохондрий почек молодых и старых животных при физиологических условиях, а так же при И/Р почки и/или ишемическом прекондиционировании.

Данные, полученные в нашей лаборатории в течение последних нескольких лет на моделях почечной недостаточности, максимально приближены к ситуации in vivo: с помощью операционной индукции ишемии, рабдомиолиза, пиелонефрита и последующего исследования клеток ткани, в том числе, переживающих срезов почки. Нами было показано развитие митохондриальной дисфункции в результате И/Р и роль АФК и поры неспецифической проницаемости митохондрии в данном процессе. Так же нами была показана возможность предотвращения ОПН при использовании различных митохондриально-направленных подходов: митохондриально-адресованных антиоксидантов, мягкого разобщения фосфорилирования и дыхания митохондрий, агентов фармакологического прекондиционирования. В целом в работе определены основные механизмы повреждений, развивающихся в клетках почки при нефропатологиях, показана доминирующая роль митохондрий в этих процессах и определена возможная стратегия защиты ткани от повреждений, что вносит существенный вклад в понимание регуляции жизнедеятельности клетки в условиях стресса и открывает возможности для разработки новых лекарственных средств. Наш коллектив обладает большим опытом работы с феноменом ишемического и фармакологического прекондиционирования и обладает большим арсеналом средств для исследований в данной области. Лаборатория обладает необходимой базой для проведения как физиологических, так и биохимических исследований, необходимых для выполнения данной работы. Кроме того, в распоряжении лаборатории имеется находящийся в коллективном пользовании НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского центр протеомного анализа с возможностью 2D фореза, MALDI-TOF, масс-спектрометрии.

Изменения почечной гемодинамики исследовались при помощи двух типов высокочастотной ультразвуковой допплеровской техники. Одном случае использовалась установка, разработанная в Биоинженерной лаборатории НИИ Общей патологии и патофизиологии с датчиками банадажного типа, работающие на частоте 27 МГц, которые фиксировались на почечной артерии. При помощи этой технологии оценивалось состояние почечного русла целиком, так изменения кровотока и его характеристик, важнейшей из которых является индекс резистивности, отражали изменения, происходящие с сосудами почки. Одновременно, второй датчик фиксировался на брюшной аорте проксимальнее места ответвления почечных артерий, для того, чтобы убедиться в том, что изменения, регистрируемые в почечной артерии, связаны с изменением сопротивления кровотоку в почке, а не с увеличением или уменьшением объёма крови, поступающего из аорты. В течение эксперимента осуществляли регистрацию линейной (V) и объемной (Q) скорости кровотока. Оцифровку данных, поступающих от ультразвукового прибора, проводили с помощью компьютерной программы «Graph2Digit». Анализ состояния кровотока осуществляли на основании следующих параметров: частота сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин), объемная скорость кровотока (Q, мл/мин), пиковая систолическая скорость кровотока (Vmax, см/с), конечная диастолическая скорость кровотока (Vmin, см/с), индекс резистивности: (Vmax – Vmin)/Vmax. В этих экспериментах была, выявлена значительная гипоперфузия почки после 40 мин ишемии. Через 1 мин после начала реперфузии объемная скорость кровотока составляла лишь ~30% от предишемического уровня. Измерение этого параметра на 5, 10, 15 и 20-й мин реперфузии показало, что кровенаполнение почки остается таким же низким. Лишь на 25-й мин было выявлено некоторое улучшение кровотока, однако гипоперфузия органа сохранялась до конца наблюдаемого периода (30 мин). Используя максимальную пиковую систолическую и конечную диастолическую скорость кровотока в течение сердечного цикла, был вычислен индекс резистивности, свидетельствующий о степени сопротивления току крови дистальнее места его регистрации. Т.к. в наших опытах датчик фиксировали на почечной артерии, то колебания индекса отражали изменения сосудистого сопротивления почки. После 40 мин ишемии индекс резистивности значительно возрастал и уже через 1 мин после начала реперфузии был выше предишемических значений на ~20%. На 10-й мин индекс резистивности достигал максимальных значений, затем оставался повышенным вплоть до 30 мин реперфузии, когда эксперимент прекращали. Введение SkQR1 (в/б, 100 нмоль/кг) за 3 ч до начала ишемии приводило к более быстрому восстановлению почечного кровотока. Так, уже на 1-й мин реперфузии объемная скорость кровотока у крыс, получавших митохондриальный антиоксидант, увеличивалась до 49% от предишемических значений по сравнению с 30% у крыс контрольной нелеченной группы. Объемная скорость продолжала расти и достигала 67% на 15-й мин, в то время как у животных, не получавших лечения, кровоток к этому времени восстанавливался лишь до 36% от предишемических значений. Индекс резистивности в интактных условиях до ишемии достоверно не различался у крыс после инъекции SkQR1 и без нее. Непосредственно после 40 мин ишемии (на 1-й мин реперфузии) мы не наблюдали положительного влияния митохондриально-направленного антиоксиданта на вызванное ишемией увеличение индекса резистивности на 1-й мин реперфузии. Однако уже на 5 и 10-й мин реперфузии индекс резистивности снижался, возвращаясь к предишемическим значениям. Начиная с 15-й мин сосудистое сопротивление снова начинало расти. Таким образом, митохондриально-направленный антиоксидант уменьшал сосудистое сопротивление почки после ишемии как раз в тот период, когда наблюдалось повреждение митохондрий в эндотелии сосудов. При регистрации кровотока по почечной артерии было показано, что системная гемодинамика (объёмная и линейная скорости) не претерпевает значительных изменений в результате И/Р. Измерение ЧСС также показало отсутствие статистически достоверных отличий данного параметра в течение эксперимента, как при использовании SkQR1, так и без него. Использование сверхкороткого ишемического прекондицинирования (СК-ИПК) (4 цикла, состоящих из 15 сек ишемии и 15 сек реперфузии, непосредственно перед 40-мин ишемией) приводило к ещё большему улучшению гемодинамических параметров после 40 мин ишемии. Уже на 5-й мин объёмная скорость кровотока достигала 53% от предишемических значений, к 15-й мин – 99%, а к 25-й минуте реперфузии – 123%. Если за 3 часа до СК-ИПК и 40 мин ишемии животные получали митохондриально-направленный антиоксидант SkQR1, то динамика восстановления кровотока после ишемии была такая же, как при введении препарата без СК-ИПК. В другой серии экспериментов мы использовали коммерческий высокочастотный ультразвуковой Доплер прибор «Минимакс-Допплер-К НБ» (Минимакс, Россия). Данная система предполагает использование транскутанных датчиков (частота работы – 25 МГц), позволяющих неинвазивно, с поверхности почки регистрировать кровоток индивидуальных сосудов органов. Для этих экспериментов выбиралась одна из дуговых артерий почки и далее регистрировался её кровоток в течении всего эксперимента. Полученные данные так же оцифровывали с помощью компьютерной программы «Graph2Digit» и анализировали те же параметры: частота сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин), объемная скорость кровотока (Q, мл/мин), пиковая систолическая скорость кровотока (Vmax, см/с), конечная диастолическая скорость кровотока (Vmin, см/с), индекс резистивности: (Vmax – Vmin)/Vmax. При использовании данного экспериментального подхода мы увидели воспроизведение тенденции, которую мы получили, используя бандажные датчики на почечной артерии: кровоток по дуговым артериям после 40 мин ишемии не восстанавливался до предишемических значений, а после 40 мин ишемии с предварительным использованием СК-ИПК не только полностью восстанавливался, но даже и превышал предишемические значения. Однако, в количественном измерении, реакция индивидуальных сосудов была не такая не драматическая, как изменении почечного кровотока в целом. Так уже на 1-й минуте реперфузии объёмная скорость кровотока достигала 75%, а к 15-й минут – 94% у крыс перенесших только ишемию. Предварительное использование СК-ИПК приводило к ухудшению кровотока на 1-й минуте реперфузии (61%), однако уже к 10-й минуте улучшало кровоток до 106%. Так же СК-ИПК значительно уменьшало сопротивление сосудистого русла. Так на 5-й минуте реперфузии индекс резистивности дуговых артерий крыс перенесших ишемию был равен 0,73, а крыс с предварительным СК-ИПК – 0,57. Далее мы исследовали влияние старения на гемодинамические изменения сосудов почки при ишемии и СК-ИПК. Мы обнаружили, что у старых животных восстановление кровотока после ишемии происходит не только быстрее чем молодых животных, подвергшихся ишемии такой же длительности, но даже быстрее, чем у молодых животных, перенесших СК-ИПК и ишемию. На 1-й минуте реперфузии у старых животных кровоток восстанавливался до 92% от предишемических значений, к 15-й минуте достигал 121%. СК-ИПК перед ишемией у старых животных приводила к ещё более выраженной гиперфперфузии в реперфузионный период. С 1-й по 10-ю мин кровоток колебался в районе 135-141%, а затем падал до 107% к 20-й минуте. Индекс резистивности достоверно не различался у старых крыс с и без СК-ИПК. В начале реперфузии он был высоким (0,66), затем падал, достигая крайне низких значений к 10-й минуте (0,47), а затем снова возрастал (до 0,62 к 20-й минуте). Дисфункцию эндотелия так же оценивали по степени нарушения сосудистого русла почки. Для оценки проницаемости сосудистого русла почки использовали прижизненное введение красителя Evans Blue. Наркотизированным животным вводили в/в 2 мл 0,5% Evans Blue. Через 70 мин проводили транскардиальную перфузию животных 200 мл PBS, чтобы удалить Evans Blue из кровеносных сосудов. После этого левую почку вырезали, просушивали, взвешивали, разрезали и фотографировали. Затем ее гомогенизировали, центрифугировали гомогенат 10 мин при 14 000 g и собирали супернатант. Для осаждения белка супернатант смешивали с 50%-ной ТХУ (соотношение объемов 1 : 2) и центрифугировали 20 мин при 14 000 g. К 30 мкл супернатанта добавляли 90 мкл этанола и измеряли интенсивность флуоресценции (возбуждение – 535 нм, эмиссия – 625 нм). Для построения калибровочной кривой использовали раствор с известной концентрацией Evans Blue. При сравнении накопления красителя Evans Blue в почках контрольных крыс и животных, перенесших ишемию, было обнаружено небольшое увеличение его концентрации в постишемичных почках, что позволяет предполагать повышение проницаемости сосудов почки для альбумина, с которым краситель связывается на 99%. Визуальный анализ локализации Evans Blue в различных отделах почки показал, что основное накопление красителя у интактных животных наблюдается в почечной лоханке и внутреннем мозговом слое, в то время как в корковом и внешнем мозговом слое он практически не детектируется. После ишемии происходит увеличение содержания Evans Blue во всех отделах почки. При этом наблюдается накопление красителя в коре и внешнем мозговом слое – отделах почки, наиболее чувствительных к ишемическому повреждению. Причем, при измерении количества Evans Blue, экстрагированного из гомогенатов целой почки, разницы между контрольными и опытными животными, перенесшими И/Р, не наблюдалось. После лечения животных митохондриально-направленным антиоксидантом SkQR1 путем в/б введения 100 нмоль/кг за 3 ч до ишемии, а также через 1, 18, 30 и 42 ч после начала реперфузии отмечалась тенденция к нормализации проницаемости сосудистого русла почки. После ишемии на фоне поступления введения SkQR1 концентрация Evans Blue в тотальном гомогенате почке не отличалась от таковой у интактных животных; визуальный анализ также выявил крайне низкое содержание красителя в корковом и внешнем мозговом слое. Одним из характерных маркеров повреждения эндотелия сосудов является появление в кровотоке свободно циркулирующих эндотелиальных клеток. В данной работе был разработан метод оценки содержание в периферической крови крыс мРНК белка Vcam-1, служащего специфичным маркером эндотелиальных клеток. У крыс забирали из яремной вены 1,5 мл крови шприцом, содержащим в качестве антикоагулянта ЭДТА. Из полученной цельной крови выделяли РНК с помощью набора «QIAamp RNA Blood Mini kit» («Qiagen», США), согласно указаниям производителя. Полученную тотальную РНК использовали в качестве матрицы для обратной транскрипции и ПЦР. В начале мы доказали, что данный метод в самом деле детектирует эндотелиальные клетки. Для этого мы выделяли из крысы сегмент брюшной аорты, гомогенизировали его и клеточную взвесь разводили в физиологическом растворе. Наш метод детектировал наличие мРНК Vcam-1 в данном образце. Далее, чтобы убедиться, что методика позволяет работать и с биологическими образцами, в частностью, с цельной кровью, мы вводили внутривенно интактной крысе клеточную взвесь, полученную после гомогенизации сегмента брюшной аорты, через 10 минут забирали кровь у этой крысы и анализировали образец. Параллельно забиралась кровь у интактной крысы и смесь клеток брюшной аорты добавлялась к этому образцу. В образцах обоих типов наша методика опять-таки детектировала мРНК Vcam-1. Мы исследовали изменения количества циркулирующего эндотелия на разных сроках после 40-мин ишемии почки: через 10 мин, через 40 мин и через 48 часов после начала реперфузии. Через 10 мин после начала реперфузии количество мРНК Vcam-1 у опытных крыс с ишемией почки значительно увеличивалось по сравнению с ложнооперированными животными, что свидетельствует о существенном увеличении слущиваемых в просвет сосуда сильно поврежденных эндотелиальных клеток или/и высоком уровне активации эндотелия, т.к. экспрессия Vcam-1 усиливается при воспалительном ответе эндотелиальных клеток. Через 40 мин мы не наблюдали достоверного отличия между ишемичными и контрольными животными. Через 48 часов уровень циркулирующего эндотелия был выше у контрольных животных, чем у ложнооперированных. Эти данные свидетельствуют о том, что пик повреждения эндотелия приходится на самые первые минуты реперфузии. Далее мы оценивали влияние ишемии и СК-ИПК на функцию почки. Для того, чтобы оценить уровень повреждения почки, подвергшейся ишемии и реперфузии, производили нефрэктомию контралатеральной (интактной) почки, т.к. при сохранении хотя бы одной интактной почки почечная недостаточность не наблюдается. Для предотвращения ретроградного выброса мочи в брюшную полость производили перевязку правого мочеточника. В течение всего времени действия наркоза температуру животного поддерживали на уровне 37ᵒС. Крыс контрольной группы подвергали аналогичной операции, но не накладывали зажим на сосудистый пучок левой почки (ложнооперированные животные). Т.к. с возрастанием концентрации креатинина и мочевины в крови свидетельствуют об ухудшении фильтрационной функции почки, то эти биохимические маркеры служили показателем уровня почечной недостаточности у животных. Креатинин и мочевину определяли в сыворотке крови, взятой из хвостовой вены, используя анализатор AU480 Chemistry System (Beckman Coulter, США). Через 48 часов после 40-мин ишемии концентрация креатинина и мочевины возрастали в более чем в 6,5 раз, что свидетельствует о развитии тяжёлой почечной недостаточности. СК-ИПК перед ишемией предотвращало повреждение почки: уровень мочевины возрастал только в 2,5 раза по сравнению с ложнооперированными животными, а уровень креатинина – в 4 раза. У старых животных тяжесть повреждение почки через 48 часов после ишемии была такой же, как и молодых животных. Однако, СК-ИПК у старых животных не приводило к уменьшению тяжести почечной недостаточности, как у молодых крыс, но наоборот к небольшому увеличению: на 18% возрастала концентрация креатинина и на 22% - мочевины по сравнению со старыми животными без СК-ИПК. Т.к. ишемия и СК-ИПК приводили к выраженным изменениями почечной гемодинамики, мы исследовали влияние на тяжесть почечной недостаточности одной из ключевых систем, регулирующих почечный кровотока – ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС). При введении крысам ингибитора ангиотензин-превращающего фермента – эналаприла (37,5 мкг/к в/б) за 60 мин до начала ишемии мы наблюдали исчезновение защитного влияния СК-ИПК на функцию почки (уровень креатинина возрастал в 7 раз по сравнению с контрольными животными, а уровень мочевины – в 6,5 раз). При этом сам эналаприл, по всей видимости не оказывал ни негативного, ни позитивного влияния на тяжесть почечного повреждения после 40-мин ишемии, так как через 48 часов после операции у крыс получавших эналаприл уровень креатинина и мочевины не отличался достоверно от показателей крыс, перенесших ишемию без введения каких-либо препаратов. Одним из ключевых механизмов связанных с процессом старения является ацетилирование белков. Мы исследовали изменения процессов ацетилирования/деацетилирования у молодых и старых крыс в норме, после 40-мин ишемии и после 40-мин ишемии с предварительным СК-ИПК. Состояние системы ацетилирования оценивали при помощи иммуногистохимического окрашивания срезов коры почки, фиксированной при помощи транскардиальной перфузии крысы 4% формальдегидом через 40 мин после начала реперфузии. Почку продолжали фиксировать в 4% формальдегиде в течение 24 часов при +4оС, в дальнейшем хранили в фосфатно-солевом буфере с 0,01% азидом натрия при +4оС. Затем на вибратоме получали 100 мкм срезы, которые окрашивали антителами против ацетилированного лизина и фаллоидином, конъюгированноым с тетраметилродамином, для визуализации актинового цитоскелета. Для каждого среза почки было снято от 10 до 18 полей зрения, все канальцы в этих полях посчитаны. Окрашивание срезов почки антителами против ацетилированного лизина показало, что окрашиваются, в основном, ядра клеток канальцев. Таким образом, для всех групп крыс произвели подсчет процента канальцев с высоким уровнем ацетилирования ядерных белков. У молодых интактных крыс наблюдали ацетилирование белков ядер только в 10% канальцев на срезе, у старых интактных крыс данный параметр увеличивался до 21%. Через 40 минут после ишемии процент канальцев с высоким уровнем ацетилирования ядерных белков возрастал и у молодых, и у старых крыс (до 27% и 25% соответственно). СК-ИПК уменьшало уровень ацетилирования у молодых (17%), однако, наоборот, увеличивало его уровень у старых крыс (37%). Затем оценили процент канальцев со щеточной каемкой. Уровень канальцев со щеточной каемкой был примерно одинаковым у всех групп крыс. Также оценили процент канальцев со щеточной каемкой и ацетилированными ядерными белками. Ацетилирование белков в ядрах канальцев со щеточной каемкой у молодых интактных крыс практически не обнаруживали, а у старых оно было отмечено в 7% проксимальных канальцев. После ишемии у молодых интактных крыс появлялось ацетилирование ядерных белков проксимальных канальцев (4%), которое возвращалось к уровню интактных животных после СК-ИПК. После ишемии у старых крыс количество канальцев со щеточной каемкой и ацетилированными ядерными белками также возрастало (14%) и увеличивалось еще больше после СК-ИПК (20%).