|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Факторы растительного ядра, вовлеченные в защитный ответ на вирусную инфекциюНИР
Plant nuclear factors involved in defence response to viral infection
- Руководитель НИР: Калинина Н.О.
- Участники НИР: Гущин В.А., Макарова С.С., Махотенко А.В.
- Подразделение: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского
- Срок исполнения: 1 августа 2016 г. - 15 февраля 2017 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 16-54-10057
- Номер ЦИТИС: АААА-А16-116063010003-3
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Структура и функционирование клетки. Межклеточные взаимодействия. Молекулярные механизмы клеточной дифференцировки, иммунитета и онкогенеза. Взаимодействие вирус-клетка.
- ПН России: Науки о жизни
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.15.31 Молекулярная биология вирусов
- 34.25.23 Противовирусный иммунитет
-
Ключевые слова:
защитный ответ, вирусные белки-элиситоры, коилин, трансгенные растения, клеточные белки-эффекторы, гордеивирус
defense response, hordeivirus, cellular proteins-effectors, coilin, transgenic plants, viral proteins-elicitors -
Описание:
Ядра и их компартменты (такие как ядрышки и тельца Кахаля) являются центром, координирующим защитные реакции растения на биотические стрессы (разнообразные патогены) и абиотические стрессы различного типа. Наши исследования выявили новый ранее неизвестный механизм основного защитного ответа растения на инфекцию тобравирусом. Мы показали, что вирусный белок инициирует взаимодействие коилина, белка телец Кахаля, с поли(ADP-рибозо) полимеразой (PARP), сопровождающееся ее перераспределением из нуклеоплазмы в ядрышко и модификацией ее функции. Коилин выполняет роль сенсора вирусной инфекции, который влияет на активность PARP и активирует поздние стадии основного защитного ответа растения на вирусную инфекцию такие, как образование каллозы и, как следствие, угнетение транспорта вируса в растении. Настоящий проект нацелен на идентификацию и функциональную характеристику клеточных белков и сигнальных путей, которые вовлечены в модуляцию восприимчивости/устойчивости растения к заражению вирусами рода Hordeivirus. Для выявления таких белков предполагается использовать растения дикого типа и полученные в Институте Джеймса Хаттона (Великобритания) линии трансгенных растений Nicotiana benthamiana и Nicotiana tabacum с выключенной экспрессией генов коилина и фибрилларина. К настоящему времени нами получены некоторые характеристики гордеивирусной инфекции (фенотипические особенности, оценка синтеза вирусной РНК и белка оболочки вируса в инфицированных и системных листьях растений различных линий) и выявлен вирусный белок, возможный элиситор защитного ответа растения. Однако механизм участия коилина в инфекции растений гордеивирусом неясен и, видимо, отличается от выявленного для тобравирусной инфекции. В рамках настоящего проекта планируется детализировать роль коилина и фибрилларина (основного белка ядрышек) в развитии защитной реакции растения на гордеивирусную инфекцию, проверить предположение о возможной роли PARP в этом процессе, провести анализ маркеров ранних и поздних стадий защитного ответа и образования каллозы. Методом иммунопреципитации с последующим анализом методом MALDI-TOF масс-спектрометрии предполагается идентифицировать белки растения и вируса, взаимодействующие с коилином и фибрилларином. Функциональная роль выявленных белков будет проанализирована в экспериментах по подавлению экспрессии их генов в растениях с использованием подхода, основанного на РНК-интерференции с помощью малых интерферирующих РНК. Полученные данные позволят оценить роль коилина/фибрилларина как сенсоров вирусной инфекции и получить данные о белках-регуляторах защитного ответа, которые в перспективе могут быть использованы для селекции или создания сельскохозяйственных растений, устойчивых к вирусам.
-
Планируемые результаты:
Планируется проведение исчерпывающего анализа взаимодействия вируса и растения на модели растений Nicotiana, зараженных РНК-содержащим гордеивирусом – вирусом штриховатой мозаики ячменя с целью идентификации и функциональной характеристики клеточных белков и сигнальных путей, которые вовлечены в модуляцию восприимчивости/устойчивости растения к заражению вирусами рода Hordeivirus.
-
Научный задел:
Участники проекта имеют значительный опыт работы в изучении роли ядерных белков коилина и фибрилларина в вирусной инфекции, опыт работы по ко-локализации вирусных белков и клеточных ядерных/ядрышковых белков in vivo и анализу взаимодействий между клеточными и вирусными белками in vivo и in vitro. Группа Н.О. Калининой специализируется на анализе биохимических и структурных свойств белков РНК-содержащих вирусов растений, а также растительных белков коилина и фибрилларина и белок-белковых взаимодействиях in vitro (Rakitina et al., 2010; Makarov et al., 2013). Получены данные о ядерной локализации транспортного белка вируса ТБГ1 гордеивируса полулатентного вируса мятлика, картирован сигнал ядерной/ядрышковой локализации в составе белка и участки взаимодействия с коилином и фибрилларином (Semashko et al., 2012; Семашко и др. 2012). Имеется набор конструкций для экспрессии вирусного белка, а также коилина и фибрилларина и их разнообразных мутантов, как в растениях, так и в клетках E.coli. Получен рекомбинантный вирус ВШМЯ, в геноме которого мутирован участок, отвечающий за связывание белка ТБГ1 с коилином, получены некоторые характеристики инфекции растений мутантным вирусом. Все результаты получены с применением современных методов и подходов, характеризуются новизной и оригинальностью.
- Добавил в систему: Калинина Наталья Олеговна
Соисполнители НИР
| Институт Джеймса Хаттона | Соисполнитель |
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 августа 2016 г.-30 декабря 2016 г. | Факторы растительного ядра, вовлеченные в защитный ответ на вирусную инфекцию |
| Результаты этапа: Для выявления механизма защитного ответа растения на заражение гордеивирусом штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) при участии ядерного белка фибрилларина изучена инфекция трансгенных растений (ТР) с ингибированной (с помощью механизма РНК-интерференции) экспрессией гена фибрилларина в сравнении с растениями дикого типа (ДТ). В целом, результаты были сходны с полученными ранее при инфекции ВШМЯ ТР с дефицитом коилина (Shaw et al., 2014), а именно: недостаток фибрилларина приводил к повышению чувствительности ТР к заражению ВШМЯ на ранних сроках инфекции и более агрессивной инфекции (угнетение роста растений и деформация листьев) на поздних стадиях. Анализ вирусной РНК показал, что в ТР вирус способен транспортироваться в системные листья на 1-2 дня раньше (быстрее) чем в растениях ДТ. Оба белка (коилин и фибрилларин) ко-локализуются в тельцах Кахаля или в тельцах, подобных тельцам Кахаля и способны прямо взаимодействовать между собой in vitro. Возможность участия обоих ядерных белков в общем защитном механизме растения проверяется. Мы также исследовали влияние коилина на инфекцию растений потивирусом Y вирусом картофеля (YBК). В условиях угнетения экспрессии гена коилина при инфекции ТР YBК эффективность заражения снижалась многократно, сопровождаясь заметной устойчивостью растений к этому вирусу, т.е. эффект был прямо противоположен наблюдаемому при инфекции ТР ВШМЯ. Оценка синтеза белка оболочки вируса методом ИФА показала, что в инокулированных листьях ТР его уровень ниже в 3-4 раза по сравнению с инокулированными листьями растений ДТ, а в системных листьях в среднем в 4 раза ниже. Дефицит коилина, вероятно, не влияет на системный транспорт YВК в верхние неинокулированные листья (и в растениях ДТ и в ТР вирус впервые детектируется методом ИФА в системных листьях на 5 день после инокуляции). Однако дальнейшее накопление вируса в системных листьях также снижено в ТР по сравнению с растениями ДТ. Механизм РНК-интерференции, по-видимому, не затрагивается при инфекции YВК ТР. Очевидно, что ответ растения, опосредованный коилином, на инфекцию YВК отличается от защитного механизма, вовлеченного в ответ на инфекцию гордеивирусом. | ||
| 2 | 9 января 2017 г.-29 декабря 2017 г. | Факторы растительного ядра, вовлеченные в защитный ответ на вирусную инфекцию |
| Результаты этапа: Полученные ранее результаты показали, что коилин и/или тельца Кахаля необходимы для развития потивирусной инфекции, в том числе для образования симптомов при заражении растения потивирусом. Коилин усиливаeт патогенность потивируса YВК (Y-вируса картофеля), поскольку симптомы просветления жилок и некрозы в системных листьях растений табака дикого типа при инфекции YВК были значительно сильнее, чем в трансгенных растениях N. benthamiana c ингибированной экспрессией гена коилина. В протопластах, полученных из трансгенных растений табака, накопление вируса не менее чем в 6 раз ниже, чем в протопластах их растений дикого типа (оценку проводили с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием антител против YВК). Эти результаты позволили предположить, что коилин обеспечивает эффективную продукцию вируса, непосредственно или опосредованно участвуя в процессе репликации вирусной РНК. Дефицит коилина, вероятно, не влияет на системный транспорт YВК в верхние неинокулированные листья (и в растениях дикого типа и в трансгенных растениях вирус впервые детектируется методом ИФА в системных листьях на 5 день после инокуляции). Однако дальнейшее накопление вируса в системных листьях также снижено в трансгенных растениях по сравнению с растениями дикого типа. Механизм РНК-интерференции, по-видимому, не затрагивается при инфекции YВК трансгенных растений. Ранее нами было показано, что в трасгенных растениях с дефицитом коилина не наблюдается увеличения (по сравнению с растениями дикого типа) специфичных к YВК миРНК, главного маркера процесса РНК-интерференции. Существенно, что в опытах по агроинфильтрации транзиентный сайленсинг гена зеленого флуоресцентного белка сохраняется в трансгенных растениях на уровне растений дикого типа. Эффект от умолкания экспрессии гена коилина весьма схож с эффектом от умолкания гена фибрилларина в растениях: частичное выключение экспрессии гена коилина значительно уменьшает накопление вируса. В целом, полученные данные позволяют предположить, что и фибрилларин и коилин могут использоваться вирусом для его размножения и, следовательно, выключение (даже неполное) экспрессии этих генов снижает накопление вируса, т.е. повышает устойчивость растений к YВК. Как показано нами ранее, в процессе инфекции тобравирусом при участии вирусного белка коилин модифицирует активность поли(АДФ рибозо)полимеразы (PARP), что сопровождается активацией поздних стадий основного защитного ответа растения на данную инфекцию. Для подавления экспрессии гена PARP нами использован метод вирус-индуцированного «умолкания» генов (VIGS). Соответствующие «шпилечные» конструкции были экспрессированы с вирусного вектора на основе вируса погремковости табака (ВПТ или TRV). Растения инфицировали ВПТ дикого типа (контроль) или векторами на основе ВПТ, экспрессирующими конструкции для «умолкания» гена PARP. Частичное выключение экспрессии гена PARP практически не влияет на инфекцию YВК. Наши опыты также не выявили влияния 3-аминобензамида, ингибитора поли(АДФ рибозо)полимеразы, на симптомы инфекции растений табака дикого типа YВК. Анализ белков-маркеров защитного ответа растения методом ПЦР в реальном времени показал, что экспрессия гена, кодирующего белок PR-1b, усиливается значительно (более чем в 5 раз) при инфекции растений PVY на 10 дпи, свидетельствуя о том, что салициловая кислота вовлечена в ответ растения на вирусную инфекцию. Другим важным маркером защитного ответа растения против патогенов является усиление клеточных стенок за счет отложения каллозы. Отложение каллозы также зависит от защитных путей, опосредованных салициловой кислотой, и индуцируется различными биотическими и абиотическими стрессами. Отложение каллозы заметно индуцируется при заражении PVY. Таким образом, каллоза может быть вовлечена в антивирусный защитный ответ растения. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".