![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Жировая ткань является важнейшим эндокринным органом, регулирующим гомеостаз всего организма. Обновление и рост жировой ткани происходит благодаря активности мезенхимных мультипотентных стромальных клеток (МСК). Наши предварительные данные показали, что в популяции мезенхимных мультипотентных стромальных клеток при стимуляции адипогенной дифференцировки возникает кластер клеток, отличающихся повышенной экспрессией целого спектра рецепторов и сигнальных молекул. Отличительным признаком этой субпопуляции является экспрессия нестина, который часто рассматривают, как маркер стволовых клеток взрослого организма, происходящих из нервного гребня. Ранее было показано, что в костном мозге клетки, экспрессирующие нестин, участвуют в передаче сигнала от симпатической нервной системы к гематопоэтическим стволовым клеткам (Mendez-Ferrer et al. 2010). Мы предполагаем, что и в жировой ткани нестин экспрессирующие клетки выполняют регуляторную функцию, являясь лидирующей субпопуляцией, способной передавать сигналы гормонов и нейромедиаторов окружающим клеткам. Ранее нами было обнаружено, что в популяции МСК существуют отдельные субпопуляции, отличающиеся профилем экспрессии рецепторов к гормонам и нейромедиаторам. Наши предварительные данные показали, что часть этих субпопуляций содержит нестин. Целью настоящего исследования является выявление механизмов участия нестин-экспрессирующих клеток жировой ткани в регуляции адипогенной дифференцировки МСК. Для этого на МСК жировой ткани человека и мышей линии Nes-GFP+, у которых под нестиновым промотором экспрессирован зеленый флюоресцентный белок, будет проверена гипотеза о роли нестин–экспрессирующих клеток жировой ткани в регуляции адипогенеза, В первый год выполнения исследования будут получены данные о локализации нестин экспрессирующих клеток в жировой ткани и проведен анализ профиля экспрессии генов, участвующих в активации секреции везикул, продукции адипокинов и факторов роста и экспрессии рецепторов к гормонам в этих клетках при адипогенной дифференцировке. В результате выполнения проекта буду впервые раскрыты механизмы участия нестин-экспрессирующих клеток в адипогенезе. Полученные данные будут иметь фундаментальное значение для понимания механизмов формирования и обновления жировой ткани и могут лечь в основу разработки подходов для терапии заболеваний связанных с нарушениями функции жировой ткани.
Adipose tissue is the most important endocrine organ that regulates the homeostasis of the whole organism. The renewal and growth of adipose tissue occurs due to the activity of mesenchymal multipotent stromal cells (MSCs). Our preliminary data showed that in a population of mesenchymal multipotent stromal cells, upon stimulation of adipogenic differentiation, a cluster of cells appears that is characterized by increased expression of a whole spectrum of receptors and signaling molecules. A distinctive feature of this subpopulation is the expression of nestin, which is often considered as a marker of adult stem cells originating from the neural crest. It was previously shown that in the bone marrow, cells expressing nestin are involved in signal transduction from the sympathetic nervous system to hematopoietic stem cells (Mendez-Ferrer et al. 2010). We suggest that in nestin adipose tissue, expressing cells perform a regulatory function, being the leading subpopulation capable of transmitting the signals of hormones and neurotransmitters to surrounding cells. Earlier, we found that in the MSC population there are separate subpopulations that differ in the expression profile of receptors for hormones and neurotransmitters. Our preliminary data showed that part of these subpopulations contains nestin. The aim of this study is to identify the mechanisms of participation of nestin-expressing adipose tissue cells in the regulation of adipogenic differentiation of MSCs. For this, on MSCs of human adipose tissue and mice Nes-GFP +, in which a green fluorescent protein is expressed under the nestin promoter, a hypothesis on the role of nestin-expressing adipose tissue cells in the regulation of adipogenesis will be tested. In the first year of the study, data on the localization of nestin expression cells in adipose tissue and the analysis of the expression profile of genes involved in the activation of vesicle secretion, production of adipokines and growth factors and expression of hormone receptors in these cells with adipogenic differentiation. As a result of the project, the mechanisms of the participation of nestin-expressing cells in adipogenesis will be revealed. The data obtained will be essential for understanding the mechanisms of formation and renewal of adipose tissue and may form the basis for the development of approaches for the treatment of diseases associated with impaired function of adipose tissue. Форма 2 Данные о физическом лице
В первый год выполнения исследования будут получены данные о локализации нестин экспрессирующих клеток в жировой ткани и проведен анализ профиля экспрессии генов, участвующих в активации секреции везикул, продукции адипокинов и факторов роста и экспрессии рецепторов к гормонам в этих клетках при адипогенной дифференцировке. В результате выполнения проекта буду впервые раскрыты механизмы участия нестин-экспрессирующих клеток в адипогенезе. Полученные данные будут иметь фундаментальное значение для понимания механизмов формирования и обновления жировой ткани и могут лечь в основу разработки подходов для терапии заболеваний связанных с нарушениями функции жировой ткани.
В нашей лаборатории фундаментальные исследования МСК человека ведутся более 10 лет. За это время получены новые данные о роли МСК в регенерации тканей, их секреторной активности, экспрессии рецепторов участвующих в регуляции функциональной активности МСК и функциональной гетерогенности популяции МСК. Результаты исследований регулярно публикуются в ведущих зарубежных журналах и представляются на профильных конференциях. Коллектив располагает коллекцией первичных клеток МСК, полученных от условно здоровых доноров. В ходе работы оптимизированы методики выделения и культивирования МСК, исследования гетерогенности и механизмов дифференцировки, методы функциональной и морфологической характеристики МСК. Нами освоены современные методы прижизненной работы с клетками, разработаны уникальные приемы наблюдения за сигнализацией в одиночных клетках в ходе дифференцировки. В распоряжении коллектива имеется линия мышей Nes-GFP+ для которой отработаны методы выделения МСК из костного мозга и жировой ткани и выполнена частичная характеристика популяции нестин-экспрессирующих клеток. Налажены методы биоинформативной обработки массивов данных scRNA-seq. Коллектив располагает современным оборудованием для выделения, культивирования и анализа клеток с использованием методов конфокальной микроскопии, прижизненных наблюдений и работе с одиночными клетками, проточной цитофлуориметрии и сортировке клеток, , коллекцией первичных антител и материалами для реализации проекта.
В результате выполнения проекта буду впервые раскрыты механизмы участия нестин-экспрессирующих клеток в адипогенезе. Полученные данные будут иметь фундаментальное значение для понимания механизмов формирования и обновления жировой ткани и могут лечь в основу разработки подходов для терапии заболеваний связанных с нарушениями функции жировой ткани. В работе впервые будет продемонстрирована роль нестин-экспрессирующих клеток в формировании и обновлении жировой ткани. В частности, будут впервые установлены механизмы участия нестин- экспрессирующих клеток в передаче сигналов гормонов и нейромедиаторов мезенхимным мультипотентным клеткам жировой ткани. В результате проекта будут выявлены задействованные при этом механизмы межклеточных взаимодействий. Выявление этих механизмов может дать ключ к пониманию процессов формирования и обновления жировой ткани, развития патологий, обусловленных нарушением ее функций. Результаты проекта могут лечь в основу разработки новых подходов для терапии заболеваний связанных с нарушениями функции жировой ткани.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 7 марта 2020 г.-30 декабря 2020 г. | Роль нестин экспрессирующих мезенхимных мультипотентных клеток в адипогенезе |
Результаты этапа: В течение первого года выполнения проекта нами впервые было исследовано распределение нестин-экспрессирующих клеток в жировой ткани мыши и человека с помощью оригинальных методик, включающих многоцветное иммунофлуоресцентное окрашивание толстых замороженных срезов подкожной жировой ткани мышей линии Nes-GFP+ у которых под нестиновым промотором экспрессирован зеленый флуоресцентный белок. Окрашенные срезы были проанализированы с помощью конфокальной и световой микроскопии. С помощью такого подхода нами было исследовано распределение нестин экспрессирующих клеток относительно зрелых адипоцитов, стромы, сосудистых структур и нервных окончаний, а также проанализировано содержание рецепторов катехоламинов в этих клетках. Поскольку нестин–это белок промежуточных филаментов, распределенных преимущественно вокруг ядра, иммунофлуоресцентная окраска клеток с использованием антител против нестина предполагает процедуру пермеабилизации плазматической мембраны. Однако такая обработка приводит к потере части поверхностных рецепторов и не дает возможности исследовать их экспрессию одновременно с выявлением нестина. Использование клеток и тканей мышей линии Nes-GFP+, у которых под нестиновым промотором экспрессирован зеленый белок, позволило исследовать со-локализацию нестина с другими белками, минуя процедуру пермеабилизации. Кроме того, в этих клетках GFP белок распределен по всей цитоплазме, что дало возможность впервые обнаружить и описать длинные отростки нестин-положительных клеток, распределенные в жировой ткани. Фрагменты подкожной жировой ткани самцов мышей линии Nes-GFP+ подвергали заморозке в парах азота с использованием криопротектора Tissue-Tek (Sakura). Срезы толщиной 10 и 20 мкм резали с использованием криостата при температуре -28С и монтировали на электростатически обработанные предметные стекла (SuperFrost). Срезы фиксировали свежим 4% формалином на PBS 30 минут при комнатной температуре и окрашивали антителами к CD31(маркер эндотелия) мыши и человека соответственно, а также антителами против маркера гладкомышечных клеток SMA. Для визуализации были использованы вторичные антитела AlexaFluor594 иAlexaFluor 633. Для окраски толстых срезов время инкубации с антителами и отмывок было увеличено. Изображения получали с использованием конфокального микроскопа LSM 780(Zeiss) с использованием405, 488, 594 и 633 лазерных линий. Обработка изображений проводили при помощи программного обеспечения ZEN 2010. При анализе распределения нестин-содержащих клеток с помощью малого увеличения микроскопа, мы обнаружили, что такие клетки распределены в жировой ткани неравномерно (Рис. 1). Прежде всего, мы обнаружили, что нестин-содержащие клетки и их отростки располагаются вдоль кровеносных сосудов в виде толстых тяжей и одиночных клеток. Кроме того, одиночные нестин-содержащие клетки располагаются также и в толще жировой ткани, пронизанной мелкими капиллярами. В жировой ткани мы также обнаружили участки, не содержащие нестин-экспрессирующих клеток. Такие клетки во многих тканях постнатального организма представляют собой мультипотентные клетки-предшественники, которые необходимы для регенерации и обновления тканей. Поэтому данные, впервые полученные в ходе выполнения проекта, указывают на то, что в жировой ткани нестин-экспрессирующие клетки могут входить в состав ниши стволовых клеток, ассоциированной со стенкой кровеносных сосудов. При более детальном изучении локализации нестин-содержащих клеток, мы обнаружили, что они обладают протяженными отростками, которыми оплетают кровеносный сосуд снаружи (Рис. 2). На микрофотографии видны нестин экспрессирующие клетки (зеленая флуоресценция), которые имеют протяженные отростки и располагаются вдоль крупного сосуда. Сосуд с внешней стороны покрыт гладкомышечными клетками (белая флуоресценция), внутри выстлан эндотелием (красная флуоресценция). Нестиновые клетки тесно контактируют с гладкомышечными, но не эндотелиальными клетками. Поскольку флуоресценция GFPможет существенно снижаться при обработке тканей (замораживании, фиксации и проч.) мы также исследовали распределение нестин-содержащих клеток в тканевых эксплантах жировой ткани. Для этого фрагменты подкожной жировой ткани самцов мышей линии Nes-GFP+ помещали в среду культивированияDMEMсодержащую раствор HEPES и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного камерой для прижизненных наблюдений LeicaAF6000LX. На полутолстых переживающих срезах и фрагментах подкожной жировой ткани мыши с использованием методов флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии мы исследовали распределение GFP-экспрессирующих клеток в толще жировой ткани. На микрофотографиях видны одиночные зеленые клетки с длинными отростками, вытянутыми между адипоцитами. Тела клеток отмечены стрелками (Рис.3). Важно отметить, что исследованные в работе нестин-экспрессирующие клетки имеют особую морфологию: небольшое тело и протяженные отростки, которые располагаются периваскулярно. Похожая морфология была впервые описана в 2010 году для телоцитов – интерстициальных клеток, обнаруженных в различных тканях (Popescu, Faussone-Pellegrini 2010). Маркерами телоцитов являются CD34, CD117/c-Kit, PDGFRα, PDGFRβ,VEGF, iNOS, calveolin-1, vimentin, connexin 43, CD44, desmin, cadherin-11,CD29, CD10, а также нестин. Функции этих клеток до сих пор обсуждаются. Есть данные, что эти клетки взаимодействуют с макрофагами, кровеносными сосудами и нервными окончаниями, регулируют поддержание клеточного состава ткании, возможно, участвуют в регуляции регенерации. Поскольку мы предполагаем, что нестин-содержащие клетки регулируют обновление и рост жировой ткани, а катехоламины являются известными регуляторами адипогенеза, мы проанализировали экспрессию рецепторов катехоламинов на нестин-содержащих клетках. Для этого срезы подкожной жировой ткани человека (10 мкм) полученные, как описано ранее фиксировали свежим 4% формалином на PBS 10 минут при комнатной температуре, пермеабилизовали с использованием раствора 0,2 % TritonX100 на PBS 10 минут и окрашивали антителами к рецепторам катехоламинов человека (α1A adrenoreceptor, α1Badrenoreceptor, α2Aadrenoreceptor, α2Badrenoreceptor, β1 adrenoreceptor, β2 adrenoreceptor, β3adrenoreceptor), а также против человеческого нестина (были протестированы несколько антител разных производителей Invitrogen, Merckmillipore, Chemicon, Biolegend). Для визуализации были использованы вторичные антитела AlexaFluor 488 AlexaFluor594 иAlexaFluor 633. Изображения получали с использованием конфокального микроскопа LSM 780(Zeiss) с использованием405, 488, 594 и 633 лазерных линий. Обработка изображений проводилась при помощи программного обеспечения ZEN 2010.В работе обнаружена частичная колокализация нестин позитивных клеток в жировой ткани человека с рецепторами катехоламинов (Рис. 4). На микрофотографии на большом увеличении видно, что окраска антителами против нестина выявляет белок нестин, расположенный в телах клеток и не выявляет отростков, как в жировой ткани мыши (Рис. 1, 2) Полученные данные были проверены на клетках, выделенных из подкожной жировой ткани мышей с использованием проточной цитофлуориметрии и иммуноцитохимии. Для этого фрагменты подкожной жировой ткани 4 самцов мышей линии Nes-GFP+ в возрасте 8 недель механически измельчали и обрабатывали раствором коллагеназы I типа (Wortington) 200 ед/мл и нейтральной протеазы (Wortington) с активностью 30 ед/млпри 37°С в течение 1 часа при постоянном помешивании. Далее клетки центрифугировали при 200g 10 минут высевали в чашки Петри и культивировали в средеDMEM, 10% FBS, (HyClone), 10 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco) в СО2-инкубаторе при 370С и 5% содержанием СО2. Экспрессию на клетках мыши рецепторов оценивали в 5 независимых экспериментах. Для окраски использовали клетки 2-3 пассажа. Для исследования с использованием метода проточной цитофлуориметрии клетки снимали с подложки раствором Версена и кратковременной обработкой трипсином. Фиксировали свежим 4% формалином на PBS 10 минут при комнатной температуре, и окрашивали антителами к рецепторам катехоламинов(α1A adrenoreceptor, α1Badrenoreceptor, α2Aadrenoreceptor, α2Badrenoreceptor) и вторичными антителамиAlexaFluor594. Далее оценивали процент нестин-позитивных и нестин-негативных клеток, окрашенных антителами против соответствующего рецептора. Данные полученные в 5 независимых экспериментах представлены в таблице (Рис. 5). Для исследования с использованием иммуноцитохимического исследования клетки 3 пассажа высаживали на покровные стекла и после достижения субконфлуентного монослоя фиксировали свежим 4% формалином на PBS 10 минут при комнатной температуре, и окрашивали антителами к рецепторам катехоламинов(α1A adrenoreceptor, α1Badrenoreceptor, β1 adrenoreceptor, β2 adrenoreceptor) и вторичными антителами AlexaFluor594. Данные обсчетов числа клеток в высоким и средним уровнем свечения GFP, экспрессирующих соответствующий адренорецептор, представлены под репрезентативными фотографиями (Рис. 6). На микрофотографиях видна характерная морфология клеток, экспрессирующих нестин и имеющих яркую флуоресценцию. Часть таких клеток имеют меньшие размеры по сравнению с другими клетками в популяции и несколько отростков. Для функциональной оценки чувствительности нестин-позитивных клеток к действию норадреналина была использована ранее разработанная в нашей лаборатории методика регистрации кальциевой сигнализации в одиночных клетках(Tyurin-Kuzminetal., 2016). Клетки, выделенные из жировой ткани мышей линии Nes-GFP+ окрашивали флуоресцентными красителями, чувствительными к уровню внутриклеточного кальция. (Fura2 и Fluo8). На флуоресцентном микроскопе NikonEclipseTi регистрировали ответ клеток на действие норадреналина. В трех независимых экспериментах не удалось зарегистрировать ни одного ответа нестин-позитивных клеток на действие гормона в разработанной системе. Можно предположить, что сигнал GFP перекрывает по интенсивности сигнал от сенсора, что не позволяет регистрировать всплеск интенсивности флуоресценции. Кроме того доля нестин позитивных клеток не превышает 10 %. И только несколько процентов из них экспрессируют рецепторы. При редкой посадке клеток, необходимой для получения ответа от одиночных клеток частота встречаемости и вероятность регистрации ответа таких клеток очень мала. И, наконец, отсутствие результата может быть связано с небольшим размером клеток. Вместе с тем в ходе исследования были зарегистрированы ответы от клеток, слабо светящихся GFP. В среднем, из 6 бледно-зеленых клеток в поле зрения 2 отвечали осцилляциями, одна – неповторяющимся одиночным всплеском: из трех добавок норадреналина(темные полосы над кривой изменения интенсивности) ответила только на одну добавку, и три оставшиеся не отвечали изменением интенсивности флуоресценции (Рис. 7). Таким образом, по данным проточной цитометрии и иммуноцитохимического окрашивания адренорецепторы присутствуют и на Nestin GFP+ клетках и на МСК не экспрессирующих Nestin GFP. Т.е. предположение о том, что именно популяция стволовых клеток, одним из маркеров которых является нестин, может обладать свойством регуляторной популяции воспринимающей и амплифицирующей сигнал от катехоламинов в нашей модели не подтвердилась. Однако, часть клеток нестин положительной популяции экспрессирует рецепторы к катехоламинам и есть клетки, специфически отвечающие на действие норадреналина. Для подготовки публикации этой части исследования планируется подобрать сенсор для оценки функционального ответа в ярко светящихся клетках, проанализировать экспрессию рецепторов в нестин-позитивной популяции МСК выделенных из жировой ткани человека с применением методов scRNA-seq и последующего биоинформационного анализа и оценить действие агонистов и антагонистов рецепторов катехоламинов на переживающие экспланты жировой ткани мышей линии Nes-GFP+. На данном этапе выполнения проекта нами также была проанализирована экспрессия нестина в субпопуляциях МСК, выделенных из жировой ткани человека и их изменение при стимуляции дифференцировки. Для этого были использованы массивы данных, полученные на клетках МСК человека выделенных из жировой ткани и клетки от того же донора после 4 суток стимуляции адипоцитарной дифференцировки (неопубликованные данные, полученные в рамках выполнения гранта РНФ в нашей лаборатории). На основании изменения уровня экспрессии рассматриваемых генов использована технология “10x Genomics”, состоящая из предварительного перевода .bcl-файлов в .fastq-файлы с помощью cell ranger mkfastq, выравнивания, фильтрации, подсчета баркодов и уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) с созданием матрицы, определением кластеров и анализом дифференциальной экспрессии с помощью cell ranger count. Обработка реализована с помощью нескольких программ, входящих в рабочий алгоритм 10x. Данные scRNA-seq представляют собой результат секвенирования транскриптома каждой клетки исследуемого образца. При дальнейшем обсчете данных оценивали уровень экспрессии гена, с которого он был транслирован. В основе кластеризации лежит метод главных компонент, который уменьшает размерность исходных данных. Изначально массив представляет собой информацию о каждой клетке и каждом ее транскрипте, то есть является множеством точек в многомерном пространстве, где каждая точка - это клетка. Затем происходит уменьшение многомерного пространства до трех – или двумерного за счет объединения сонаправленных векторов клеток в пространстве. Результате обработки представлены в виде графических изображений, на которых сходные по уровню экспрессии генов клетки объединены в кластеры – графические области, в которых располагаются клетки со схожими профилями экспрессии (Рис. 8). На рисунке представлены объединенные данные для двух популяций использованных в анализе: клетки гетерогенной популяции МСК, выделенных из жировой ткани человека располагаются с правой стороны и клетки от этого же донора после 4 суток стимуляции адипоцитарной дифференцировки - облако точек слева. Коричневым цветом разной интенсивности выделены клетки с разным уровнем экспрессии нестина. Видно, что после дифференцировки число таких клеток и уровень экспрессии значительно падает. На рисунке 9 представлены результаты кластеризации обоих образцов. Кластерный анализ показал, что в недифференцированной популяции МСК нестин экспрессирующие клетки представлены во всех кластерах и составляют около шести процентов всей популяции (Рис.9). Интересно, что после активации дифференцировки эти клетки не исчезают полностью, а оказываются равномерно распределенными среди всех клеток небольшими компактными группами. В одном из кластеров (3) остается небольшая группа клеток, в которых даже после стимуляции дифференцировки сохраняется высокий уровень экспрессии нестина. Биоинформационный анализ выявил в этих клетках экспрессию генов отвечающих за адгезию и не выявил экспрессии генов характерных для этапов адипогенной дифференцировки. При анализе распределения уровня экспрессии гена нестина в контрольном и индуцированном образце, видно, что нестин экспрессируется в основном в клетках контрольного образца (Рис. 8 справа). Уровень экспрессии гена нестина в клетках индуцированного образца незначительный (Рис. 8 слева). Однако в 3 кластере дифференцирующейся популяции присутствуют клетки, экспрессирующие нестин. Таким образом, можно предположить, что нестин экспрессирующие клетки не исчезают в ходе дифференцировки, а выполняют регуляторные функции. Анализ изменения экспрессии ранних и поздних генов адипоцитарной дифференцировки, а также генов семейства UCP, транскрипционных факторов и генов стволовости представлены в таблице. Видно, что в ходе адипогенной дифференцировки происходит ожидаемое увеличение экспрессии ранних генов во всех кластерах и незначительное увеличение экспрессии адипонектина экспрессия которого характерна для поздних стадий адипогенной дифференцировки. Экспрессия генов стволовости за исключением NANOG и SOX2 падает во всех кластерах при активации дифференцировки. Анализ коэкспрессиигенов рецепторов к катехоламинам в нестин-экспрессирующих клеткахконтрольного образца, уровень экспрессии нестина в которых больше 1 (236 клеток) выявил следующий список. Если из клеток контрольного образца выбрать клетки с уровнем экспрессии нестина больше 2, то останется всего 34 клетки. После анализа коэкспрессии генов получили следующий список. Проведенный анализ не выявил коэкспрессии генов рецепторов катехоламинов, а также генов имеющих отношение к активации секреции везикул, продукции адипокинов и факторов роста. Возможно, не хватает чувствительности метода для определения экспрессии генов. Однако проведенный анализ выполнен только один раз и при этом были исследованы клетки первичной популяции, полученные от условно здорового донора. Нельзя исключить, что полученный результат отражает индивидуальные особенности донора. Учитывая небольшое число нестин позитивных клеток вошедших в конечном итоге в анализ, для подачи публикации планируется повторить исследование с использованием данных, полученных в результате анализа клеток другого донора. | ||
2 | 11 января 2021 г.-30 декабря 2021 г. | Роль нестин экспрессирующих мезенхимных мультипотентных клеток в адипогенезе |
Результаты этапа: Нестин-экспрессирующие мезенхимные стволовые/стромальные клетки (Nes+ МСК) костного мозга контролируют активность гематопоэтических стволовых клеток, регулируя таким образом обновление крови. Однако роль таких клеток в поддержании состава других тканей, в частности, жировой ткани остается не выясненной. Целью данного проекта является изучение роли Nes+ МСК в регуляции адипоцитарной дифференцировки МСК. На втором этапе проекта нами впервые исследован вклад субпопуляции нестин-экспрессирующих клеток (Nes+ МСК) в регуляцию дифференцировочного потенциала мезенхимных стволовых/стромальных клеток. Для этого мы использовали МСК жировой ткани мышей линии Nes-GFP+, которые разделяли с помощью поточной сортировки на 2 популяции – обогащенную GFP-Nes+ МСК и лишенную таких клеток, а также популяцию с низким уровнем экспрессии GFP-Nes(low), после чего индуцировали их адипоцитарную дифференцировку. Через 2 недели инкубации в индуцирующей адипогенез среде в культурах МСК, не разделенных на субпопуляции, накапливаются адипоциты, содержащие крупные липидные капли. Такие клетки, как правило, расположены группами. В популяции, обогащенной GFP Nes+ МСК, после индукции дифференцировки появляются клетки, содержащие мелкие липидные капли. При этом часть GFP Nes+ МСК не накапливает липиды и не утрачивает экспрессию нестина. Они формируют сеть клеток с длинными отростками и располагаются поверх пласта дифференцирующихся адипоцитов. Напротив, в популяции, лишенной GFP Nes+ МСК, доля клеток, способных к адипоцитарной дифференцировке, оказалась снижена по сравнению с неразделенной популяцией МСК. Полученные данные свидетельствуют о том, что присутствие Nes+ МСК способствует адипогенной дифференцировке прогениторных клеток жировой ткани. Однако исследованные субпопуляции не различаются по способности к остеогенной дифференцировке. В условиях, стимулирующих хондрогенную дифференцировку, крупные многоядерные клетки с включениями в цитоплазме появляются в негативной по нестину популяции. Эти данные указывают на то, что в жировой ткани нестин-экспрессирующие МСК участвуют в регуляции именно адипоцитарной, но не остеогенной или хондрогенной дифференцировки прогениторных клеток жировой ткани. На данном этапе мы провели подробную морфологическую и функциональную характеристику GFP Nes+ клеток. Обнаружена частичная коэкспрессия стандартных маркеров МСК и GFP Nes, но экспрессии маркеров плюрипотентности и маркера CD34 в этих клетках не обнаружено. GFP Nes+ МСК жировой ткани при редком посеве формируют крупные смешанные колонии. Разработана модель эксплантной культуры жировой ткани мыши на которой исследовано действие агонистов и антагонистов рецепторов катехоламинов на переживающие экспланты жировой ткани мышей линии Nes-GFP+. Обнаружено, что ангиотензин II стимулирует, а норадреналин подавляет миграцию клеток из эксплантов. Для проверки гипотезы об участии нестин-экспрессирующих клеток в регуляцию адипогенеза остальной популяции были исследованы профили экспрессии генов белков – маркеров микровезикул CD9, CD63, CD81 и СD36 в МСК жировой ткани условно здорового донора до и после индукции адипоцитарной дифференцировки с помощью анализа транскриптома одиночных клеток. С помощью углубленного биоинформатического анализа мы впервые установили, что в кластере, который содержит клетки с высоким уровнем экспрессии нестина, присутствуют клетки, в которых высокоэкспрессированы все гены белков, участвующих в биогенезе внеклеточных везикул. Таким образом, полученные на данном этапе результаты свидетельствуют об участии нестин-экспрессирующих МСК в регуляции адипоцитарной дифференцировки прогениторных клеток жировой ткани. Наши данные впервые указывают на возможный путь регуляции, реализуемый нестин-содержащими клетками, что будет проверено на заключительном этапе проекта. | ||
3 | 7 марта 2022 г.-30 декабря 2022 г. | Роль нестин экспрессирующих мезенхимных мультипотентных клеток в адипогенезе |
Результаты этапа: Нестин-экспрессирующие клетки, потомки клеток нервного гребня, контролируют активность гематопоэтических стволовых клеток, регулируя, таким образом, обновление крови. Однако, роль таких клеток в поддержании состава других тканей, в частности, жировой ткани остается не выясненной. Основной целью исследования было выявить роль нестин-экспрессирующих клеток в процессах дифференцировки жировой ткани. Для этого были использованы образцы жировой ткани человека и клетки и ткани мышей линии линии Nes-GFP+. Впервые исследовано распределение нестин-экспрессирующих клеток в жировой ткани мыши и человека. Обнаружено, что такие клетки распределены в жировой ткани неравномерно. Нестин-позитивные клетки и их отростки располагаются вдоль кровеносных сосудов в виде толстых тяжей и одиночных клеток. Кроме того, одиночные нестин-позитивные клетки располагаются также и в толще жировой ткани, пронизанной мелкими капиллярами. Полученные данные указывают на то, что в жировой ткани нестин-экспрессирующие клетки могут входить в состав ниши стволовых клеток, ассоциированной со стенкой кровеносных сосудов. Исследована роль субпопуляции Nes+ МСК в регуляции адипоцитарной дифференцировки МСК, выделенных их подкожной жировой ткани мыши. Исследование проводили на МСК подкожной жировой ткани молодых (8 недель) самцов мышей, экспрессирующих GFP под промотором маркерного белка клеток нервного гребня, нестина (линия Nes-GFP+). Тотальная популяция МСК была разделена на субпопуляции нестин-экспрессирующих клеток Nes+ МСК и клеток не экспрессирующих нестин и проанализирована способность этих субпопуляций к адипоцитарной дифференцировке. Обнаружено, что способность субпопуляции нестин-экспрессирующих клеток Nes+ МСК к накоплению жировых капель заметно снижена. Было отмечено, что при дифференцировке тотальной популяции нестин-экспрессирующие клетки Nes+ МСК формируют сеть поверх пласта дифференцирующихся МСК и имеют веретеновидное тело и длинные отростки. В популяции, лишенной Nes+ МСК, доля клеток, способных к адипоцитарной дифференцировке, оказалась снижена по сравнению с несортированной популяцией МСК. Полученные данные свидетельствуют о том, в жировой ткани присутствие Nes+ МСК необходимо для адипогенной дифференцировки всей популяции. Методом биоинформатического анализа клеток человека в контроле и при активации адипогенной дифференцировки было обнаружено, что в кластере, который содержит клетки с высоким уровнем экспрессии нестина, присутствуют клетки, в которых высокоэкспрессированы гены белков, участвующих в биогенезе везикул. На основании проведенных исследований была выдвинута гипотеза, в соответствии с которой клетки экспрессирующие нестин регулируют процесс дифференцировки всей гетерогенной популяции за счет секреции везикул и при этом сами практически не вступают в дифференцировку. Целью заключительного этапа работы было сопоставление параметров секреции везикул клетками Nes+ МСК мыши по сравнению с клетками не экспрессирующими нестин и исследование динамики секреции везикул клетками Nes+ МСК мыши в ходе адипоцитарной дифференцировки МСК. Тотальную популяцию МСК, выделенных из жировой ткани мышей линии Nes-GFP+ наращивали и разделяли с использованием клеточного сортера на нестин-экспрессирующие (Nes+ МСК), клетки со слабой экспрессией нестина (GFPdim) и популяцию, не содержащую GFP. В свежевыделенных клетках оценивали экспрессию генов везикул и маркеров ранних стадий адипоцитарной дифференцировки PPARγ и C/EBPα и генов «стволовости». Другую часть клеток наращивали до конфлуентного монослоя и индуцировали адипоцитарную дифференцировку. Среду культивирования через 3, 6 и 9 суток дифференцировки собирали, окрашивали антителами против CD9, CD63 и анализировали количественный и качественный состав везикул с использованием NTA и проточной цитофлуориметрии. Обнаружено, что продукция внеклеточных везикул клетками Nes+ МСК не отличается от МСК, не экспрессирующих нестин . При анализе экспрессии разных типов везикул в динамике в ходе адипогенной дифференцировки также не обнаружено достоверной разницы между клетками Nes+ МСК и остальными клетками популяции, как на ранних, так и на поздних стадиях адипогенной дифференцировки. С помощью анализа транскрипционного профиля сортированных Nes+МСК и МСК, негативных по экспрессии нестина (сразу после сортировки) мы также не обнаружили разницы в профиле экспрессии генов CD9, CD63 и CD81. Следует отметить, что на 9 сутки адипогенной дифференцировки сортированных клеток экспрессия генов CD9, CD63 и CD81 снижается в адипогенной среде и возрастает в условиях культивирования в контрольной среде без гормонов, причем в Nes+МСК популяции эти изменения ниже. При исследовании экспрессии генов транскрипционных факторов адипогенеза и генов стволовости в клетках с разным уровнем экспрессии нестина достоверной разницы также не обнаружено. Таким образом, полученные данные указывают на то, что клетки, экспрессирующие нестин принимают участие в регуляции адипогенной дифференцировки, однако при этом в них не происходит значимой активации продукции внеклеточных везикул и изменения профиля экспрессии транскрипционных факторов. Распределение Nes+МСК клеток в виде сети на поверхности монослоя дифференцирующихся МСК может свидетельствовать о том, что эти клетки выполняют регуляторную функцию, взаимодействуя контактно с окружающими клетками. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".