| 1 |
14 марта 2016 г.-30 ноября 2016 г. |
Исследование роли ФАНЛ в образовании и транспорте фотосинтетического сахара, а также в межклеточном транспорте белка и вирусной РНК |
| Результаты этапа: В результате проведенной работы мы выяснили, что ФАНЛ (NbLNAF) является потерявшим способность ингибировать активность трипсина гликопротеином клеточной стенки листа, не влияющим на активность хлоропластов, но способствующим межклеточному транспорту макромолекул и фотоассимилятов. Введение в растительную клетку плазмиды, экспрессирующей NbLNAF, (а) стимулирует межклеточный транспорт репортерного белка (2xGFP) и (б) вызывает снижение содержания глюкозы в source-листьях из-за ее оттока и перераспределения в sink-листья. При этом NbLNAF не влияет на фотосинтетическую активность хлоропластов.
Выделен транскрипционный промотор NbLNAF (Pro-NbLNAF), выявлены его потенциальные регуляторные элементы. Показано, что Pro-NbLNAF обеспечивает экспрессию репортерного гена Uid A, кодирующего GUS, в клетках N. benthamiana с высокой эффективностью. Количество мРНК гена NbLNAF, поставленного под контроль Pro-NbLNAF, зависит от факта экспрессии 53ак-ОРС. Стабильность мРНК NbLNAF определяется тем, выражается ли 53ак-ОРС: если 53ак-аОРС экспрессируется, то уровень «материнской» мРНК NbLNAF в клетке снижается. Мы показали, что трансляция со стартового кодона 53ак-аОРС в составе «материнской» мРНК NbLNAF происходит в экспериментах, когда 53ак-аОРС замещается (а) геном Uid A или (б) геном, кодирующим слитый белок 53ак-Пеп:GFP. При этом трансляция 53ак-ОРС осуществляется именно с «материнской» мРНК NbLNAF, что подтверждается отсутствием альтернативных транскриптов NbLNAF и криптического промотора в составе гена NbLNAF.
Наши исследования структуры и свойств мРНК ФАНЛ дают первый пример гена-матрешки, у которой вложенный ген оказывает влияние на стабильность и экспрессию материнской матрицы
|
| 2 |
4 апреля 2017 г.-30 ноября 2017 г. |
Исследование механизма экспрессии «вложенной» ОРС в гене-матрешке ФАНЛ |
| Результаты этапа: Ранее в ходе выполнения работ по проекту мы выяснили, что ФАНЛ (NbKPILP) является потерявшим способность ингибировать активность трипсина гликопротеином клеточной стенки листа, не влияющим на активность хлоропластов, но способствующим межклеточному транспорту макромолекул и фотоассимилятов. В этом 2017 году мы показали, что в отличие от корней, мРНК NbKPILP и соответствующий белок не были обнаружены в неповрежденных листьях, но абиотические (длительная темнота) и биотические (бактериальная и вирусная инфекция) стрессы резко стимулировали накопление соответствующей мРНК в листьях. В поисках причины низкого содержания мРНК NbKPILP в листьях мы обнаружили, что ген NbKPILP является «матрешкой», содержащей альтернативную вложенную рамку считывания (ANRF), кодирующую 53 аминокислотный (aa) полипептид (53aa-ANRF), который содержит амфипатическую спираль. Наличие перед стартовым кодоном полипуринового блока, важного для функционирования некоторых внутренних сайтов посадки рибосомы, и благоприятного контекста самого стартового кодона указывает на принципиальную возможность выражения ANRF. Мы создали конструкцию, где последовательность, кодирующая GFP, была вставлена в ген NbKPILP после 53aa-ANRF в той же рамке считывания и показали присутствие слитого белка 53а.к.-GFP во фракции, обогащенной мембранными белками. Используя 5'-RACE, мы показали, что экспрессия ANRF не объясняется наличием криптического промотора в гене NbKPILP, а осуществляется непосредственно с материнской мРНК NbKPILP. Мы обнаружили, что введение мутаций, разрушающих амфипатическую спираль в 53а.к. пептиде приводит к более чем двукратному увеличению уровня мРНК NbKPILP. Таким образом, ген NbKPILP представляет собой первый пример функционирования ANRF как репрессора материнского гена в интактном растении. Мы предложили модель, в которой стрессовое воздействие влияет на процесс инициации трансляции NbKPILP, тем самым, способствуя накоплению соответствующего белка и мРНК в листьях. |
